Введение к работе
Актуальность темы. Глицеролипиды, к которым относятся ГЛ и ФЛ, являются структурными компонентами мембран хлороплас-тов, митохондрий, пероксисом и других органелл фотосинтетических тканей. Они играют важную роль в процессе развития растений и их адаптации к условиям окружающей среды, в особенности, к изменениям освещенности и температуры. Однако, в качестве объекта исследований использовались преимущественно низшие растения, и пока мало сведений о характере изменений состава липидов в листьях высших растений. Поэтому возникла необходимость проведения систематических исследований по изменению состава глицеролнпидов в процессе развития травянистых и древесных растений и их адаптации к различной освещенности и пониженной температуре. Актуальной является проверка выдвигаемой нами концепции о том, что в процессе эволюции растений и их адаптации к факторам среды в листьях выработался сложный механизм биохимической и структурной перестройки, в которой значительную роль играют глицеролипиды клеточных мембран. Кроме того, представляет интерес исследования по изменению ЖКС мембранных дипидов в зависимости от способности видов растений к клубне-, плодо- и корнеплодообразованию на длинном дне.
Цель и задачи исследования. Цель нашей работы состояла в установлении закономерностей изменения состава глицеролнпидов листьев в процессе развития растений и их адаптации к различной освещенности и пониженной температуре. Достижение этой цели включало решение таких задач, как разработка и усовершенствование некоторых методов анализа глицеролнпидов її ацетил-Ко А-синтетазы, изучение внутриклеточного распределения глицеролнпидов и ацетил-Ко А-синтетазы, расщепление глицеролнпидов в результате гомогенизации листьев, влияния на состав липидов различной освещенности и пониженных температур, характера годичных и сезонных изменений состава глицеролипи-50В у древесных растений, а также изменения ЖКС глицеролнпидов листьев в зависимости от способности видов к клубне-, пло-50- и корнеплодообразованию на длинном дне.
Научная новизна. Выдвинута концепция, согласно которой в процессе эволюции растений и их адаптации к факторам среды
2 Зак. 2616
в листьях выработался сложный механизм .структурной и биохи мической перестройки, в которой значительную роль играют гли церолипиды. С помощью разработанных и усовершенствованны; методов анализа глицеролипидов показано, что наиболее интеи сивные изменения состава липидов наблюдаются при зелепепиі и росте листьев, адаптации растений к морозу и весенней потер! морозоустойчивости, когда интенсивно перестраивается ультра структура клеток.
При освещении этиолированных растений, когда в листья) формируются хлоропласты из этиопластов, после индукционной периода значительно возрастает содержание хлоропластных липи дов — МГДГ, ДГДГ, Сл, ФГ; у древесных растений при этом сии жается содержание ФЛ, что связано с образованием центральної вакуоли и деградацией части ЭР и диктиосом. На свету у Сіб:з-растений увеличивается относительное содержание высокоиепасы щепных жирных кислот (липоленовой кислоты сначала в МГДГ ДГДГ, Сл, затем в ФХ, ФЭ, ФГ и ФИ, Д7' 10> 13 — гексадекатриено вой в МГДГ, А3—транс-гексадеценовой в ФГ) и уменьшаете концентрация ЖК с меньшей степенью ненасыщешюсти (линоле вой, олеиновой и пальмитиновой) в результате чего СНЖК воз растает, что направлено на обеспечение необходимой жидкостно сти мембранных липидов. Освещение растений с зелеными сфор мировавшимися листьями не приводит к существенному изменению состава глицеролипидов в листьях.
Нами обнаружен в хлоропластах, выделен и частично очищеі фермент ацетил-Ко А-сиптетаза, необходимый для образована ацетил-К.о А при синтезе ЖК из ацетата на свету. При затемнении растений расщепляются липиды хлоропластов, что коррели рует с деградацией граналыю-ламеллярной системы хлоропластов в то время как виехлоропластные ФЛ и структура митохондрю существенно не изменяются. На состав липидов оказывает влияние и пониженная освещенность: в одно- и двулетней хвое сосны, растущей в нижнем ярусе лесного полога, содержите? больше ФЛ и меньше ГЛ, чем у деревьев верхнего яруса и сво-боднорастущих, что указывает на мезотрофный способ питания.
Под влиянием пониженных температур на растения отмечается разный характер изменения состава липидов листьев (па примере картофеля): закаливающие температуры способствуют увеличению содержания ФЛ, заморозок с переохлаждением не вызывает существенных изменений состава глицеролипидов, заморозок с льдообразованием способствует расщеплению галакто- и фос-фолипидов с образованием СЖК, лизофосфолипидов, ФК, кото рая ингибирует реакцию Хилла в хлоропластах. Промораживание хвои сосны приводит к расщеплению ФЛ и разрушению ультраструктуры клеток, а осеннее закаливание растений к морозу вы-
:ывает возрастание содержания ФЛ и увеличение количества іембрап.
Обнаружены принципиальные различия в характере сезонных [змепепий ЖКС двух групп мембранных липидов — ФЛ и ГЛ: і естественных условиях при осенней адаптации древесных рас-ений к морозу СНЖК ФЛ повышается, а СНЖК ГЛ понижает-:я. При перезимовке сохраняется высокий уровень СНЖК ФЛ, огда как СНЖК ГЛ продолжает снижаться. Весной с потерей шрозоустойчивости СНЖК ФЛ уменьшается, а СНЖК ГЛ рас-ет. Подобным же образом изменяется в эти периоды содержание РЛ и ГЛ. Эти различия обусловлены развитием и сохранением росфолипидсодержащих внехлоропластпых мембран осенью—зи-юй и частичной деградацией гликолипндсодержащих хлоропласт-іьіх. Весной, наоборот, фосфолипидсодержащие мембраны час-'ично деградируют, гликолипидсодержащие — восстанавливаются, {аоактер сезонных изменений пенасыщенпости жирных кислот -ЇЛ зависит от органа растения: в хвое сосны СНЖК снижается )сеныо—зимой и повышается весной, в то время как в почках :осны и березы этот показатель существенно не изменяется. Вы-іеленьї группы липидов, сезонные изменения СНЖК одной из них соррелируют с колебаниями температуры, другой — освещеннос-и, а ЖКС третьей существенно не изменяется в течение осени— шмы—весны. На основании этих фактов выдвинута гипотеза ) температуро-, светозавнсимой и стабилирующей системах регу-ІЯПИН ЖКС у древесных растений.
Установлено, что содержание НЛ в хвое и почках древесных эастений увеличивается летом — в первой половине осени, сии-кается во второй половине осени — зимой и, главным образом, ієсной — летом следующего года в период набухания почек, роста тобегов и листьев, хвои. В растущих побегах снижение концен-рации НЛ до минимума приводит к росту концентрации ГЛ, что жазывает па развитие хлоропластов и усиление интенсивности ротосіїптеза. В январской хвое сосны обнаружено примыкание тлотпого слоя сферосом, в которых v растений сосредоточены за-тасные НЛ, к плазмалемме, что согласуется с гипотезой об их /частий как высокоэпергетических соединений в репарации по-фежденных участков плазмалеммы.
Выявлена зависимость изменения ЖКС различных групп ли-шдов и функциональной активности листьев от способности ви-ІОВ картофеля, томатов и свеклы к развитию запасающих органов іа длинном дне.
Практическое значение работы. Предлагается использовать: і селекционной работе при отборе более холодоустойчивых сортов и форм растений метод оценки повреждений мембран листьев ю снижению содержания глнцеролипидов.
Теоретические разработки, касающиеся установленных закопо-
мерностей изменения состава липидов в процессе развития растений и их адаптации к факторам среды, могут быть использованы в учебниках и при чтении соответствующих курсов по физиологии и биохимии растений.
Апробация работы. Наши результаты докладывались на научных конференциях Института биологии Карельского филиала АН СССР в 1965—1972 гг., на II, III, IV Всесоюзных биохимических съездах, Всесоюзном семинаре по методам выделения хло-ропластов (Пущино, 1969), втором Всесоюзном симпозиуме «Физиологические основы устойчивости растений к заморозкам и пониженным температурам» (Петрозаводск, 1971), симпозиумах «Биологические проблемы Севера» — V-ом (Магадан, 1972), VII-ом (Петрозаводск, 1976), VIII-ом (Апатиты, 1979), 1Х-ом (Сыктывкар, 1983), Х-ом (Якутск, 1986), Всесоюзном симпозиуме «Физико-химические основы функционирования надмолекулярных структур клетки» (МГУ, Москва, 1974), П-ом Международном ботаническом конгрессе (Ленинград, 1975), 1-ом Всесоюзном симпозиуме «Липиды биологических мембран» (Львов, 1976), П-ом (Ташкент, 1980), Ш-ем (Пущино, 1984), Всесоюзном совещании по вопросам адаптации древесных растений к экстремальным условиям среды (Петрозаводск, 1981), Всесоюзной конференции по проблемам физиологии и биохимии древесных растений (Красноярск, 1982), П-ой Всесоюзной конференции по клеточным механизмам адаптации» в 1985 г. (Карадагская биостанция Института южных морей Крымской обл., 1985), Всесоюзном симпозиуме «Математические и вычислительные методы в биологии» (Пущино, 1985), Всесоюзной конференции «Экстрактивные вещества древесных растений» (Красноярск, 1986), Всесоюзном совещании «Организмы, популяции и сообщества в экстремальных условиях» (Москва, 1986), VI-ом Всесоюзном симпозиуме «Роль циклических пуклеотидов и вторичных посредников в регуляции ферментативных реакций» (Петрозаводск, 1988), Ш-ей Всесоюзной конференции по проблемам физиологии и биохимии древесных растений (Петрозаводск, 1989). Кроме того, наши результаты по расщеплению глицеролипидов листьев цитируются в фундаментальных изданиях: 9-томном Biochemistry of plants (1980), 2-том-пом Responses of plants to environmental stresses (1980), 1-томном Frdst survival of plants: responses and adaptation of freezing stress (1987) и международных журналах: Plant Physiology, Phytochemistry, Physiologia Plantarum.
Публикации и авторские свидетельства. Основные результаты работы опубликованы в 49 статьях. По материалам работ получено 2 авторских свидетельства и удостоверение на рационализа^ торское предложение.
На защиту выносятся результаты исследований и развиваемое автором представление о перестройке глицеролипидов и их жир-
покислотного состава в процессе развития растений и их реакции па внешние условия, а также разработанные и усовершенствованные методы анализа глицеролипидов и ацетил-Ко А-синтетазы. Структура диссертации. Диссертация состоит из введения,
7 глав, выводов, списка литературы и 2-х приложений. Работа
изложена на 461 страницах, включая 247 стр. машинописного
текста и иллюстрирована 111 рисунками и 56 таблицами. Список
литературы включает 664 работы, отечественных 233, зарубеж
ных 431.
Методика. Объектами исследования были хвоя и почки 15—18-летних деревьев сосны обыкновенной (Plnus silvestris L.), листья и почки 10—12-летних деревьев березы повислой (Betula pendula Roth.), произрастающих в сфагново-лишайниковом сосняке в 50 км к северо-западу от г. Петрозаводска, а также листья шпината (Spinacia oleraceae L.) и картофеля культурного (Solarium tuberosum L.), возделываемых на Агробиологической станции Института биологии Карельского филиала АН СССР. Использовали также листья различающихся по способности к клубне-, плодо- и корнеплодообразованию на длинном дне видов картофеля, томатов и свеклы, которые выращивали в полевых условиях в Пушкинских лабораториях ВИРа (Ленинградская обл.). Название видов и их характеристика дана в наших работах (Родионов, Захарова, 1985 и 1987).
Растения картофеля, являющиеся объектом исследования по влиянию света и пониженной температуры на состав глицеролипидов листьев, выращивали из клубней в контролируемых условиях. В одних опытах со светом выращенные в темноте в течение 21 суток растения картофеля затем выдерживали 28 суток при непрерывном освещении белым светом (освещенность 7,5 тыс. лк, лампы ЛБД-40), в других — растения выращивали в оранжерее при естественном освещении на смеси Киопа до 17-дневного возраста, после чего переносили на аналогичную смесь, в которой нерадиоактивный ортофосфат заменен на 23-Р-ортофосфат, и выдерживали в течение 5 суток в этих же условиях, в-третьих — растения выращивали при постоянной освещенности 10 тыс. лк до 92-дневного возраста и затем переносили в водный раствор 1-14С-ацетата. Меченные по фосфору и углероду липиды анализировали с помощью одно- и двумерной ХТСС (Родионов, 1978).
8 следующей серии опытов 25-диевные растения картофеля, вы
ращенные при 7,4 тыс. лк, затеняли различным количеством слоев
марли или затемняли плотной черной тканью и выдерживали
трое суток, а в пятой и шестой 28-дпевные растения затемняли
на срок от 0 до 121 часа.
3 Зак. 2616
В одной из серии опытов с пониженной температурой 52-диев-ные растения картофеля, выращенного в вегетационных сосуда* на смеси Кнопа, подвергали искусственному заморозку в холодильных камерах (Дроздов, 1966) —4 с льдообразованием (вс время заморозка на листья наносили кристаллики льда) и с пе реохлаждением —4 (кристаллики льда не наносили) или закаливания к заморозку (температура 0—2, продолжительности трое суток). Во второй серии опытов, где исследовалась скорость реакции расщепления ФЛ, срезанные листья картофеля промораживали в холодильнике при —9 С в течение 1,5 час; в третьей серии — срезанные листья устойчивого к заморозкам вида картофеля дикого (S. acaule var. scheiteri) и неустойчивых к заморозкам видов примитивного культурного (S. rybinii) и культурного, выращенных из семян, подвергали 1—1,25-часовым заморозкам 0, —2, —3, —4, —5, —6 и —8 С. В первой серии растения после заморозков выдерживали в оранжерее; во второй и третьей— при комнатной температуре; в четвертой серии опытов растения разных видов картофеля, выращенные из семян в полевых условиях, подвергались воздействию осеннего ночного заморозка, а днем отбирали пробы на анализ; в пятой серии январскую хвою сосны с мороза —19,5, переносили в жидкий азот —196, где выдерживали 16 часов, затем в течение суток оттаивали при 0—2 и двое суток при 21. Контрольную пробу хвои оттаивали при 21 в течение трех суток, минуя промораживание в жидком азоте.
Июньскую двулетнюю хвою сосны, отобранную в лесу при температуре 22,2 С, промораживали при —10 С в течение 16 часов и оттаивали таким же способом, как и зимнюю.
В экспериментах по влиянию гомогенизации на состав глице-ролипидов листьев срезанные дольки листьев картофеля культурного и дикого (S. acaule var schreiteri), а также шпината гомо-генезировали по методике Смирнова (1960, 1962).
Выделение органелл из листьев, получение ацетоновых порошков. Хлоропласты выделяли из листьев по методике Смирнова (1960, 1962), за исключением того, что их осаждали при 1000 g и в отдельных случаях очищали в градиенте плотности сахарозы (Родионов, 1970). Фракции хлоропластов (1000 g), митохондрий + гран хлоропластов (18 000 g), микросом (105000 g, осадок) и надосадочной жидкости получали путем дифференциального центрифугирования. Субклеточные фракции выделяли из листьев шпината в неводной среде по методу Кириченко (1965). Ацетоновые порошки из субклеточных фракций готовили по методу Беренса (Behrens, 1956).
Анализ липидов. Пробы хвои, листьев и почек древесных растений периодически отбирали в количестве 10 или 20 г с 3—5 ярусов сверху у 8—30 деревьев, а листьев травянистых растений тех
же ярусов (5 или 10 г), фиксировали в кипящем метаноле или этаноле. Сухой остаток после удаления растворителя измельчали у древесных растений с применением жидкого азота, липиды извлекали и очищали от нелипидных загрязнений (Folch et al., 1957). Липиды разделяли и идентифицировали с помощью разработанных или модифицированных нами методов (см. ниже).
ЖК глицеролипидов метилировали по методу Верещагина и др. (1963). МЭЖК получали без силикагеля или в присутствии сили-кагеля (Цыганов, 1971). МЭЖК разделяли ГХ. ЖК идентифицировали с помощью метчиков и по графикам зависимости относительных объемов удерживания от числа атомов углерода. Индекс ненасыщениости (индекс двойной связи), характеризующий степень ненасыщениости ЖК липидов, вычисляли по методу Лай-онса и др. (Lyons et al., 1964).
Определение нуклеотидов, пигментов, белков и другие методы. Ссылки на использованные методы анализа нуклеотидов, белков даны в наших экспериментальных работах (Царегородцева, Родионов, 1968; Родионов и др., 1970; Родионов, Захарова, 1970 и др.). Хлорофилл, каротинойды определяли по Арнону (Arnon, 1949), интенсивность потенциального фотосинтеза листьев — по методу Заленского и др. (1955), суммарного расхода 14С-ассими-лятов на отток и дыхание — как описано нами ранее (Родионов, 1967), реакцию Хилла — по восстановлению феррицианида (Arnon, Wattley, 1963).
