Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1 Ареал распространения рода Panax, биология видов P. japonicus и P. ginseng 8
1.2 Ценность растений рода Panax для медицины 11
1.3 Гинзенозиды: химическая принадлежность, структурные формулы 12
1.4 Биологическая активность индивидуальных гинзенозидов 15
1.5 Биосинтез гинзенозидов: ключевые ферменты, предшественники 17
1.6 Накопление гинзенозидов в растениях видов P. japonicus и P. ginseng 19
1.7 Накопление гинзенозидов в культуре клеток растений рода Panax 21
1.8 Влияние условий культивирования на рост биомассы и синтез гинзенозидов в культурах клеток растений рода Panax 24
1.9 Связь роста, дифференцировки и биосинтеза гинзенозидов в культурах клеток растений рода Panax 31
Глава 2. Материалы и методы исследования
2.1 Объекты исследования 33
2.2 Условия культивирования 33
2.3 Определение ростовых и цитофизиологических параметров суспензионных культур клеток женьшеня 34
2.4 Измерение количества ДНК 36
2.5 Анализ количества и состава гинзенозидов методом ВЭЖХ 37
2.6 Статистическая обработка материала 38
Глава 3. Характеристика роста и биосинтеза гинзенозидов суспензионных культур клеток P. japonicus var. repens и P. ginseng, культивируемых на стандартных питательных средах
3.1 Ростовые и цитофизиологические параметры суспензионной культуры клеток P. japonicus var. repens 39
3.2 Биосинтез гинзенозидов в суспензионной культуре клеток P. japonicus var. repens 44
3.3 Ростовые и цитофизиологические параметры суспензионной культуры клеток P. ginseng 47
3.4 Биосинтез гинзенозидов в суспензионной культуре клеток P. ginseng 49
Глава 4. Цитофизиологические параметры и биосинтез гинзенозидов при длительном выращивании суспензионных культур клеток P. japonicus var. repens и P. ginseng на средах с различными сочетаниями регуляторов роста
4.1. Влияние сочетаний синтетических ауксинов и цитокининов на рост и цитофизиологические характеристики суспензионной культуры P. japonicus var. repens ". 53
4.2. Влияние сочетаний ауксинов и цитокининов на биосинтез гинзенозидов в суспензионной культуре P. japonicus var. repens 56
4.3. Влияние сочетаний синтетических ауксинов и цитокининов на рост и цитофизиологические характеристики суспензионной культуры P. ginseng 59
4.4. Влияние сочетаний ауксинов и цитокининов на биосинтез гинзенозидов в суспензионной культуре P. ginseng 64
Выводы 77
Список литературы 78
Приложение 99
- Ценность растений рода Panax для медицины
- Условия культивирования
- Биосинтез гинзенозидов в суспензионной культуре клеток P. japonicus var. repens
- Влияние сочетаний ауксинов и цитокининов на биосинтез гинзенозидов в суспензионной культуре P. japonicus var. repens
Введение к работе
Актуальность. Целебные свойства растений рода Panax известны около 6000 лет и обусловлены уникальной композицией биологически активных веществ, центральное место среди которых принадлежит тритерпеновым гликозидам даммаранового ряда - гинзенозидам. Гинзенозиды обладают иммуностимулирующей и антиоксидантной активностями, нормализуют кровяное давление, стимулируют синтез РНК и ДНК, обладают противодиабетическим действием. По структуре агликона тритерпеновые гликозиды даммаранового ряда делят на две группы: 20(S)-протопанаксадиол (Rb-rpynna - Rbb Rb2, Re, Rd- гинзенозиды) и 20(S)-протопанаксатриол (Rg-группа - Rf, Rgb Re-гинзенозиды). Биологическое действие соединений обеих групп различно, в частности, гликозиды Rb-группы подавляют активность ЦНС, понижают артериальное давление, а гликозиды Rg-группы увеличивают активность ЦНС и повышают артериальное давление. Поэтому, эффективность применения в лечебных целях препаратов женьшеня, в большей степени, зависит от композиции гинзенозидов, что подтверждается обоснованностью дифференцированного применения отдельных частей корня P. ginseng С.A. Meyer в традиционной китайской медицине.
В связи с тем, что количество растений рода Panax в природе крайне ограничено, широко исследуется возможность получения гинзенозидов биотехнологическим путем, используя культуру in vitro. Большинство из полученных линий клеток женьшеня отличаются от натуральных корней меньшим количеством и ограниченным составом гинзенозидов (Ходаковская и др., 1995; Langhansova et al., 2005). В настоящее время активно проводятся работы по получению высокопродуктивных штаммов представителей рода Panax, а также по исследованию их роста и биосинтеза гинзенозидов. При этом большое внимание уделяется оптимизации условий выращивания клеток, прежде всего составу питательных сред (Wu, Zhong, 1999). Хорошо известно, что регуляторы роста и их соотношение -важнейшие факторы, определяющие возможность существования популяций изолированных клеток. Они оказывают влияние, как на рост и дифференцировку клеток, так и на их метаболизм. Эффект определяется не только спецификой самого
фитогормона, но также зависит от природы вторичных соединений, а подчас от вида растения и даже от штамма культивируемых клеток.
Изучение в сравнительном аспекте цитофизиологических характеристик суспензионных культур клеток P. japonicus var. repens С.А. Meyer и P. ginseng С.А. Meyer, а также их способности к синтезу вторичных метаболитов, дает возможность установить особенности их существования, как самостоятельных биологических систем. Кроме того, влияние регуляторов роста на биосинтез гинзенозидов у разных видов женьшеня в условиях in vitro до сих пор окончательно не выяснено.
Цель и задачи исследования. Цель настоящей работы состояла в изучении влияния типа синтетического ауксина на процессы роста, цитофизиологические и цитогенетические характеристики, биосинтез гинзенозидов в культуре клеток растений двух видов рода Panax: P. japonicus var. repens С.А. Meyer и P. ginseng С.А. Meyer.
В связи с этим были поставлены следующие задачи:
1. Изучить ростовые, цитофизиологические и цитогенетические
характеристики суспензионных культур клеток двух видов женыненей.
2. Определить накопление гинзенозидов в отдельных циклах
субкультивирования суспензионных культур клеток P. japonicus var. repens и
P. ginseng.
Изучить влияние типа синтетического ауксина на ростовые и цитофизиологические характеристики суспензионных культур клеток женыненей.
Изучить влияние типа синтетического ауксина на накопление гинзенозидов в суспензионных культурах P. japonicus var. repens и P. ginseng.
Рассмотреть возможную связь между ростовыми, цитофизиологическими характеристиками и синтезом тритерпеновых гликозидов в суспензионных культурах клеток P. japonicus var. repens и P. ginseng.
Научная новизна работы. Проведено сравнительное изучение длительно культивируемых суспензионных культур клеток двух видов женьшеня. Установлены
различия ростовых, цитофизиологических и биосинтетических показателей суспензионных культур P. japonicus var. repens и P. ginseng.
Показано, что основное влияние на накопление биомассы, агрегированность, эндоредупликацию ядерной ДНК, содержание и качественный состав гинзенозидов исследуемых культур оказывает химическая природа синтетического ауксина. У обеих суспензионных культур женьшеня НУК вызывает цитодифференцировку, проявляющуюся в увеличении доли крупных многоклеточных агрегатов, увеличении объёма клеток, возрастании числа клеток с удвоенным количеством ядерной ДНК, а также приводит к повышению синтеза гинзенозидов.
Установлено, что между уровнем синтеза гинзенозидов и цитофизиологическими характеристиками суспензий клеток существует зависимость - повышение синтеза гинзенозидов связано с процессами цитодифференцировки.
Впервые экспериментально показано, что в случае активного биосинтеза соотношение индивидуальных гинзенозидов, следовательно, и соотношение содержания гинзенозидов Rg и Rb групп достаточно стабильно.
Практическая значимость работы. В результате проведенных исследований, получены данные о гормональной регуляции роста и накопления тритерпеновых гликозидов даммаранового ряда в суспензиях клеток двух видов Panax. Охарактеризованы высокопродуктивные штаммы суспензионных культур P. japonicus var. repens и P. ginseng, которые могут быть рекомендованы для биотехнологического производства гинзенозидов. Результаты исследований дополняют данные о взаимосвязи цитодифференцировки клеток и уровня синтеза гинзенозидов в условиях in vitro.
Апробация работы. Основные положения работы были представлены на VIII Международной конференции "Биология клеток растений in vitro и биотехнология" (Саратов, 2003); V съезде общества физиологов растений России и Международной конференции «Физиология растений - основа фитобиотехнологии» (Пенза, 2003); VI съезде общества физиологов растений России и Международной конференции «Современная физиология растений: от молекул до экосистем» (Сыктывкар, 2007);
IX Международной конференции "Биология клеток растений in vitro и биотехнология" (Звенигород, 2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 работ.
Структура и объем диссертации. Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследования, изложения полученных результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы и приложения. Работа изложена на 107 страницах машинописного текста, содержит 30 рисунков, 10 таблиц. Список цитируемой литературы включает 194 наименования, из них 133 на иностранных языках.
Принятые сокращения и обозначения: ВККК ВР - Всероссийская коллекция культивируемых клеток высших растений; 2,4-Д - 2,4-дихлорфеноксиуксусная кислота; НУК - а-нафтилуксусная кислота; БАП - 6-бензиламинопурин; ВЭЖХ -высокоэффективная жидкостная хроматография; CV- коэффициент вариации.
Ценность растений рода Panax для медицины
Все представители рода Panax обладают явно выраженной физиологической активностью на организм человека. Из 12 произрас тающих на Земле видов, применение в медицине получили P. ginseng, P. japonicus, P. notoginseng, P. quinquefolium и P. vietnamensis (Choi, 2007). Безусловно, самый известный P. ginseng, именно его собственно и называют женьшень.
Женьшень настоящий используют в восточной медицине более 6 тысяч лет. В древних китайских фармакопеях он фигурировал как ценное и давно применяющееся лекарственное растение. Первые письменные упоминания о женьшене как средстве, повышающем умственную деятельность, тонус и долголетие можно найти в первом фармакологическом справочнике китайского императора Шень-нуна «Шэнь-нун Бэнь-цао», составленном еще в IV в. до н. э. В X веке его описал таджикский ученый и мыслитель Авиценна в книге «Канон врачебной науки». Однако одним из важнейших источников знаний о женьшене стал 52-томный труд китайского фармаколога и врача Ли Ши-ченя «Бэнь-цао Кань-му», появившийся в 1592 году. Сложившиеся еще с глубокой древности представления о «всеисчеляющей силе» этого растения, отражают многие из его народных названий, - такие как «корень жизни», «стосил», а также латинское название рода Panax, происходящее от греческого слова панацея, что значит средство от всех болезней (pan - все, axos - лекарство).
Изучение медико-биологических свойств P. ginseng началось относительно недавно - только с середины 20-го столетия (Брехман, 1957; Брехман, Гриневич, 1959; Брехман и др., 1966). Первые исследования в этом направлении определили его тонизирующее, стимулирующее и адаптогенное действия. К настоящему времени накоплена обширная научная информация, отражающая его влияние на центральную нервную систему (Benishin et al., 1991; Benishin, 1992; Tohda et al., 2004). Экстракт из корня женьшеня оказывает иммуномодулирующее (Kim et al, 1990; Kenarova et al., 1990), противодиабетическое (Yokozawa et al., 2004; Xie et al., 2005) и противолучевое (Sonnenborn, Proppert, 1991) действия, улучшает кровоснабжение мозга, увеличивает потребление кислорода, активизирует кроветворение (Lee, 1992), стимулирует синтез РНК и ДНК (Cho et al., 1995). В научной литературе имеются сообщения об антиоксидантной активности P. ginseng (Han et al., 1985; Zhang et al., 1996a; Keum et al., 2000; Kim et al., 2002; Liu et al., 2003; Kang et al, 2006).
Интенсивно изучается физиологическая активность представителей других видов Panax. На втором месте по лекарственной ценности после P. ginseng стоит P. quinquefolium. Его рекомендуют при умственной и физической усталости, анемии и неврастении. Он обладает более сильной антиоксидантной активностью, чем P. ginseng (Ни, Kitts, 2001). Экстракт P. japonicus не оказывает стимулирующего действия и не снижает утомления, однако, имеет транквилизирующее, жаропонижающее, отхаркивающее, антистрессовое и противоязвенное действия, не характерные для P. ginseng (Saito et al., 1977; У Yamahara et al., 1987). Современные фармакологические исследования P. notoginseng определили иммуностимулирующее (Gao et al., 1996), H гемостатическое (White et al., 2001), противораковое (Konoshima et al., 1996; Konoshima, 1999; Chen et al., 2001), противовоспалительное (Li, Chu, 1999) и противодиабетическое (Liu et al., 2004) действия. Препараты P. vietnamensis рекомендуют в качестве тонизирующего, стимулирующего и адаптагенного средства, применяют при ангине и бронхиальной астме (Lutomski, 1992). Таким образом, действие экстрактов представителей каждого вида Panax достаточно специфично.
Химический состав растения начали исследовать только с 1854 года, когда американский химик С. Гарикс сообщил о выделении из P. quinquefolium сапонина панаквилона. В 60-х годах прошлого века химики России и Японии определили, что сапонинами растений рода Panax являются тритерпеновые гликозиды. В России эти работы проводились в Тихоокеанском Институте Биоорганической Химии РАН под руководством академика Г.Б. Елякова (Еляков и др., 1962; 1965; 1967; 1972; Стригина и др., 1962; Уварова и др., 1962; 1965; Elyakov, 1964). В Японии их возглавили О. Тапака и S. Shibata в Фармацевтическом институте Медицинского Университета Хиросимы (Shibata et al., 1962; 1963a,b; 1965; 1966; Tanaka et al., 1966; 1967; 1972; Nagai et al., 1971;1972). В результате проведенных работ было установлено, что все тритерпеновые гликозиды растений рода Panax (рис. 1) подразделяются на две группы: гликозиды тетра- и пентациклических тритерпенов. Первые в качестве агликона представлены тритерпеновыми спиртами ряда даммарана (I-III), вторые - олеаноловой кислоты (IV).
Условия культивирования
Исследуемые суспензии клеток выращивали на средах, соответствующих паспорту каждой культуры. Основой стандартной питательной среды послужила MS-среда (Murashige, Skoog, 1962) с добавлением витаминов по Уайту (Бутенко, 1964). Состав сред, используемых в ВККК ВР для культивирования суспензий клеток P. japonicus и P. ginseng, представлен в таблице 6. Культивирование суспензий проводили в 0,5-литровых круглых плоскодонных колбах на качалке (90-100 об./мин) при 24-26С в темноте. Продолжительность каждого субкультивирования (пассажа) - 21 сутки. Соотношение среды и исходного инокулюма для суспензий клеток P. japonicus и P. ginseng составляло 6:1 и 5:1 соответственно.
В экспериментах по изучению влияния фитогормонов на рост и синтез гинзенозидов обе клеточные суспензии инокулировали на среды, отличающиеся , сочетаниями ауксинов и цитокининов, при этом их концентрации выравнивали в молярном отношении.
Число клеток подсчитывали в камере Фукса-Розенталя после мацерации суспензии в 20%-ном растворе хромовой кислоты при 60С в течение 15 мин. Плотность клеток рассчитывали по формуле: х=1000хМ/3,2, где М - среднее число клеток на камеру из 6-ти повторностей.
Для определения сырой массы отбирали аликвоты по 10 мл, клетки отделяли от среды культивирования на бумажных фильтрах под вакуумом, промывали два раза водой и взвешивали. Сухую массу клеток получали после высушивания образцов при 60С в течение суток. Индексы роста культур по числу клеток, сырой и сухой биомассе рассчитали по формуле: I = Хтах/Х0, где Хтах и Х0 - максимальное и начальное значения показателя роста. Для анализа динамики роста клеток кривые строили в полулогарифмическом масштабе. Биомассу для анализа ростовых параметров отбирали на 0, 3, 7, 10, 14, 17 и 21сутки.
Размеры клеток измеряли с помощью окуляр-микрометра. Анализировали не менее 200 клеток каждого морфологического типа. За условный средний объем клеток в образце принимали частное от деления сырой массы на число клеток.
Жизнеспособность клеток определяли после окрашивания 0,1% раствором эозина при просмотре не менее 300 клеток. Живыми считали клетки, цитоплазма которых не прокрашивалась в течение 2-3 минут. Жизнеспособность определяли отношением живых клеток к их общему числу и выражали в процентах.
Для характеристики агрегированности культуры выделяли группы агрегатов с числом клеток до 10, 10-20, 20-50 и более 50. Размер клеточных агрегатов определяли на световом микроскопе. Агрегаты различали по количеству входящих v в него клеток; агрегированность - по соотношению групп агрегатов. Просчитывали не менее 200 единиц культивирования на 1 препарат, агрегированнность выражали с в процентах.
Для определения митотической активности в течение цикла выращивания ,--измеряли митотический индекс. Ежесуточно считали число митозов на давленых препаратах, предварительно фиксированных смесью этиловый спирт : уксусная кислота (3 : 1) и окрашенных карболовым фуксином. На каждом препарате анализировали по 1000 клеток; просчитывали 3 препарата на каждую точку фиксации.
Для подсчета числа хромосом клетки отбирали в экспоненциальной фазе роста суспензионной культуры и фиксировали в течение трех суток смесью 96% этанола и ледяной уксусной кислоты (3:1).Число хромосом подсчитывали на проекционных изображениях 100 метафазных пластинок, предварительно сфотографированных под микроскопом.
На графиках и таблицах представлены средние арифметические значения ростовых параметров из 3-4 биологических повторностей (3-4 колбы) для каждого срока, пассажа и варианта. Если не отражено на графике, то стандартные отклонения не превышали 10% от величин средних значений.
Биосинтез гинзенозидов в суспензионной культуре клеток P. japonicus var. repens
Важным этапом исследования является изучение способности к синтезу вторичных соединений. Ранее А.Л. Чайко с соавторами (Чайко и др., 1999) показали присутствие тритерпеновых гликозидов даммаранового ряда (гинзенозидов) на начальных этапах становления (11-й цикл субкультивирования) исследуемой суспензионной культуры. Настоящая работа была предпринята для того, чтобы выяснить изменились ли параметры биосинтеза гинзенозидов в длительно культивируемой суспензионной культуре клеток P. japonicus var. repens.
Количество и состав тритерпеновых гликозидов даммаранового ряда в биомассе суспензии женьшеня японского изучали в течение 70, 100 и 150-го циклов субкультивирования. Из приведенных результатов (рис. 8, прил. табл. 3) видно, что накопление гинзенозидов в течение одного цикла колеблется: в 70-м и 100-м субкультивировании оно находилось в пределе 1,2-2,1%, в 150-м -изменялось от 2,5% до 4,0%. Следует отметить, что среднее содержание гинзенозидов в течение 70, 100 и 150-го циклов субкультивирования составило 1,67%, 1,53% и 3,1% соответственно.
Несмотря на различия в абсолютных значениях, характер изменения количества данных соединений в разных циклах выращивания оставался одинаков. Первый небольшой подъем содержания гинзенозидов (рис. 8) наблюдался в начале экспоненциальной фазы роста (3-е сутки), к середине этой фазы (5-7-е сутки) их накопление несколько снижалось. Далее на протяжении цикла субкультивирования обнаруживалось еще два подъема содержания гинзенозидов - в конце экспоненциального (10 -14-е сутки) и в начале стационарного периодов. В целом, наблюдалась тенденция повышения количества гинзенозидов к концу пассажа.
Как показал качественный анализ биомассы, в суспензии женьшеня японского присутствовали все семь основных тритерпеновых гликозидов даммаранового ряда (прил. табл. 3). Из результатов, представленных на рис. 9, видно, что по сравнению с 70-м к 150-му субкультивированию значительно уменьшилось содержание Rf- и увеличились доли Rgr и Re- гинзенозидов, а доли Rbp, Rb2,-, Re- и Rd-гинзенозидов оставались практически постоянными. Мажорными во всех образцах определены Rgr и Re- гинзенозиды.
Поскольку фармакологическое действие соединений Rb и Rg группы различно, то для характеристики биологической активности женьшеня важным фактором является не только общее содержание, но и соотношение гинзенозидов. Величина отношения Rg/Rb-групп соединений в биомассе суспензии женьшеня японского с 70-го по 150-й пассаж в среднем находилась в пределах 5,5-6,8 (рис. 10).
Итак, на основании полученных данных, можно сделать следующее заключение: биосинтетическая активность суспензии клеток P. japonicus var. repens в условиях in vitro повышалась, состав гинзенозидов на протяжении периода исследования не менялся, но наблюдалось перераспределение индивидуальных гинзенозидов по отношению к их общей сумме. Накопление тритерпеновых гликозидов даммаранового ряда в цикле культивирования имеет колебательный характер, с увеличением уровня содержания к концу пассажа. клеток P. ginseng
Определение ростовых и цитоморфологических показателей суспензионной культуры клеток P. ginseng проводили в 150-м цикле субкультивирования. Полученные результаты представлены в таблице 8, а графическое изображение роста суспензии клеток женьшеня настоящего приведено в полулагорифмической системе координат (рис. 11). Ростовая кривая числа клеток характеризуется отсутствием лаг-периода, сразу начинается фаза экспоненциального роста, которая длится 9 суток. Затем наступает стационарный период, сменяющийся к 18 суткам фазой деградации. График накопления сырой и сухой биомассы повторял ход кривой числа клеток. Накопление биомассы продолжалось до конца цикла культивирования.
Влияние сочетаний ауксинов и цитокининов на биосинтез гинзенозидов в суспензионной культуре P. japonicus var. repens
Проведенные исследования показали, что на интенсивность роста и агрегированность суспензии клеток P. japonicus var. repens в большей степени оказывал влияние вид используемого ауксина, чем цитокинина. В вариантах с добавлением НУК отмечался наибольший рост биомассы и укрупнение агрегатов. Следует отметить, что вид ауксина не оказывал существенного влияния на жизнеспособность клеток. Гидролизат казеина несколько снижал жизнеспособность культуры, но не влиял на агрегированность и рост суспензии P. japonicus var. repens.
В обзоре литературы обсуждался вопрос о том, что синтез гинзенозидов в культурах клеток представителей рода Panax зависит от концентрации и химической природы вносимых регуляторов роста. Следующей задачей нашей работы было изучение влияния регуляторов роста на накопление тритерпеновых гликозидов даммаранового ряда. Определение гинзенозидов проводили на 21 сутки 4-го субкультивирования. Максимальное содержание исследуемых соединений было зафиксировано в варианте КН, минимальное - в вариантах КД с добавлением и без добавления гидролизата казеина (рис. 20, прилож. табл. 9). В серии сред с добавлением НУК синтез гинзенозидов в среднем составил 2,8% (CF=16%), что в 1,3 раза выше, чем на средах, содержащих 2,4-Д - 2,1% (CF=17%). При сравнении результатов, полученных на средах с добавлением гидролизата казеина и без него (рис. 20, прилож. табл. 9), видно, что его присутствие в вариантах БН и КД незначительно снижало накопление гинзенозидов.
ВЭЖХ-анализ показал, что на всех модифицированных средах клетки суспензии P. japonicus var. repens способны к синтезу всех 7-ми основных гинзенозидов, ранее обнаруженных в суспензионной культуре 70-150-го циклов субкультивирования (рис. 21, прилож. табл. 9, 10). Как и в контроле, превалировали соединения Rg-группы.
Мажорным соединением в биомассе клеток являлся Re- гинзенозид, вторым можно было выделить Rgi-гинзенозид (рис. 21, прилож. табл. 10). На средах с добавлением НУК процент Re- и Rgi-гинзенозидов (от общей суммы гинзенозидов) соответствовал контролю (прилож. табл. 10) и в среднем составил 48% (СГ=13%) и 33% (CV=9%) соответственно. При культивировании суспензии клеток на средах с 2,4-Д доля Re гинзенозида увеличилась в 1,3 раза, а доля Rgi-гинзенозида уменьшилась в 2,6 раза. Следовательно, можно заключить, что химическая природа ауксина влияла на перераспределение индивидуальных гинзенозидов Rg-группы.
Как видно из результатов, представленных на рис. 22 (прилож. табл. 9), в суспензии P. japonicus var. repens не выявлено влияние вида синтетического ауксина на отношение соединений Rg/Rb групп: на всех сочетаниях регуляторов роста, за исключением варианта БН, данный показатель находился в диапазоне 4,2-4,5.
