Содержание к диссертации
Введение
Глава I. ОСОБЕННОСТИ БИОСИНТЕЗА КОМГОНЕНТОВ ЭФИРНОГО МАСЛА В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК РАСТЕНИЙ (Обзор литературы) 9
1.1. Эфирные масла и особенности их биосинтеза у мяты 9
1.2. Основные черты метаболизма растительных клеток в культуре 18
1.3 Эфирные масла в культурах тканей и клеток
растений. Культура тканей мяты 22
1.4. Факторы, влияющие на маслообразовательный процесс в условиях in vitro ЗО
1.5. Трансформация терпенов и их предшественников
в культурах клеток растений 40
Глава 2. МАТЕРИАЛ И МЕГОДЦ ИССЛЕДОВАНИЙ 51
Глава 3. ИССЛЕДОВАНИЕ НАКОПЛЕНИЯ ТЕРПЕНОВДОВ В КУЛЬТУРЕ ТКАНЕЙ И МЕТОК РАЗЛИЧНЫХ ВЦДОВ МЯТЫ 64
3.1. Инициация суспензионных культур 64
ЗЛЛ. Получение суспензионной культурьіМ.ріреггЬа 64
3.1.2. Получение суспензионной культуры М. canadensis ; 68
3.1.3. Влияние регуляторов роста на инициацию суспензионных культур 71
3.2. Динамика клеточной популяции суспензионной культуры мяты 76
3.3. Накопление эфирного масла в каллусных тканях мяты 88
3.4. Накопление эфирного масла в суспензионной культуре мяты 102
Глава 4. БИОТРАНСФОРМАЦИЯ МОНОТЕРПЕНОВ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК МЯТЫ 4.1. Общие закономерности процесса 110
4.2. Результаты биотрансформации ментона 115
4.3. Результаты биотрансформации изоментона, пи-перитона и пулегона 123
Глава 5. СТРУКТУШО-ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ И ГЕНЕТИЧЕСКИЕ АСПЕКТЫ БИОСИНТЕЗА ТЕРПЕНОИДОВ В КУЛЬТУРЕ КЛЕТОК МЯТЫ (Обсуждение результатов) 137
5.1. Биосинтез эфирного масла in vitro и in vivo : сходство и различия 137
5.2. Генетический контроль биогенеза терпеноидов в культуре клеток мяты 148
ВЫВОДЫ 157
ПРАКТИЧЕСКИЕ РЕКОМЕНДАЦИИ 159
ЛИТЕРАТУРА 160
- Эфирные масла и особенности их биосинтеза у мяты
- Инициация суспензионных культур
- Общие закономерности процесса
- Биосинтез эфирного масла in vitro и in vivo : сходство и различия
Введение к работе
Актуальность проблемы. Документами ХХУІ съезда партии и последующих пленумов ЦК КПСС предусматривается активное привлечение достижений фундаментальной науки для решения прикладных задач сельского хозяйства, в частности, генетики и селекции культурных растений /1,2/. На это указывает также постановление ЦК КПСС и Совета Министров СССР "О дальнейшем развитии физико-химической биологии и биотехнологии и использовании их достижений в медицине, сельском хозяйстве и промышленности /3/.
Одной из групп растений, прогресс в селекции которых тесно связан с развитием новых биологических подходов, являются эфиро-масличные культуры, в том числе мята. Использование мятного эфирного масла в медицине, пищевой и парфюмерно-косметической промышленности определяется присутствием в его составе наиболее ценного терпенового компонента - ментола. Возделываемые в настоящее время в производстве сорта мяты характеризуются относительно невысоким накоплением ментола в эфирном масле, что обусловливает необходимость селекции данной культуры на этот признак. Особенно актуальной эта задача становится в связи с активным вовлечением в селекционный процесс обладающих широким адаптивным потенциалом дикорастущих нементольных видов мяты /46,54,69/.
Теоретической основой селекции мяты на повышенное содержание ментола в эфирном масле являются представления о путях биосинтеза этого компонента и их генетической регуляции.Несмотря на значительный объем проведенных к настоящему времени исследований, результатом которых явилось создание ряда биогенетических схем /136, 146,155,167,194/, многое в биосинтезе ментола остается пока неясным.
Используемые для исследования этих вопросов генетические и биохимические методы не всегда дают однозначно интерпретируемую
5 информацию и нередко отличаются трудоемкостью и сложностью. В связи с этим представляется целесообразным расширение методических подходов к данной проблеме за счет использования новых модельных объектов, в частности, культур изолированных клеток, сочетающих простоту организации и доступность экспериментальным воздействиям с сохранением геномной структуры исходных организмов.
Кроме того, изучение способности изолированных клеток эфиро-масличных растений, в том числе мяты, продуцировать и трансформировать терпеноидные компоненты эфирных масел представляет значительный интерес в связи с оценкой перспектив биотехнологического получения этих ценных вторичных соединений.
Исследование образования эфирных масел в условиях культуры in vitro позволяет также рассмотреть ряд теоретических аспектов регуляции вторичного метаболизма в растительных клетках и связи этого процесса с уровнем дифференцировки системы и условиями ее функционирования.
Цель и задачи исследований. Целью работы является изучение возможности использования культуры клеток генетически различных форм мяты как модельного объекта для уточнения некоторых закономерностей биосинтеза терпеноидных соединений, в частности, ментола, и выявления генетических и биохимических механизмов накопления повышенных количеств этого компонента.
Для реализации поставленной цели было необходимо решить следующие задачи.
Получить клеточные культуры из листьев ментолсинтезирую-щих форм мяты, оптимизировать условия их выращивания и дать мор-фо-физиологическую характеристику объектов.
Оценить биосинтетическую способность полученных клеточных культур и факторы, влияющие на ее реализацию.
3. Исследовать процесс трансформации экзогенных монотерпенов изолированными клетками мяты и рассмотреть превращения основных предшественников ментола в клеточных культурах различного генетического происхождения.
Научная новизна. Впервые получены и исследованы клеточные культуры, происходящие из листьев возделываемых ментолсинтезирую-щих видов MflTbi:Mentha piperita(4n), Mrcanadensis (4n) и межвидовых гибридов с участием второго вида. Показана способность данных культур к образованию свободных и гликозидносвязанных монотерпенов и изучена изменчивость каллусных штаммов различного происхождения. Выделены штаммы, накапливающие ментол в качестве основного терпенового компонента. Определены факторы, нормализующие состав эфирного масла в культуре in vitro.
Исследован процесс трансформации экзогенных монотерпеновых кетонов в клеточных культурах различных видов мяты и выявлены системы (штамм - трансформируемый компонент), обеспечивающие высокий уровень накопления ментола в составе продуктов биотрансформации.
Выявлены генетически обусловленные биохимические механизмы повышенного накопления ментола у вида М. canadensis , связанные с активацией дополнительных путей биосинтеза. Предложена уточненная схема биогенеза ментола у мяты.
На основе полученных экспериментальных данных разработан косвенный метод оценки геномной структуры различных форм мяты по генам, контролирующим биосинтез основных терпеновых соединений.
Теоретическое и практическое значение. Существенно уточнены теоретические представления о путях биосинтеза ментола. Выявленные механизмы повышенного накопления ментола могут служить основой для селекции мяты на качество эфирного масла. Разработан-
7 ный косвенный метод оценки геномной структуры может быть использован для ускоренного подбора перспективных гибридных комбинаций в селекции мяты.
Выделенные каллусные штаммы мяты, продуцирующие ментол в качестве преобладающего компонента эфирного масла и осуществляющие биотрансформацию его основных предшественников, а также способы стимулирования образования названного соединения в культуре in vitro могут быть использованы при разработке биотехнологических методов получения указанного вещества. Предложен микрометод выявления клеточных линий для биотехнологии, обладающих необходимым направлением биотрансформации.
Основные положения, вынесенные на защиту.
Клетки ментолсинтезирующих форм мяты могут культивироваться in vitro в жидкой питательной среде Лина и Стабы в виде мелко-агрегированных суспензионных культур.
Изолированные ткани и клетки мяты сохраняют способность к биосинтезу монотерпенов, в том числе основного компонента эфирного масла исходных растений - ментола.
Степень реализации биосинтетических потенций тканевых и клеточных культур зависит от ряда генетических, эпигеномных и физиологических факторов (генотип исходных растений, штаммовые особенности, уровень морфологической дифференцировки, состав питательной среды, освещенность и др.). Оптимальное сочетание этих факторов позволяет получить в культуре in vitro эфирное масло, соответствующее по составу интактным растениям.
Культуры клеток мяты способны осуществлять трансформацию экзогенных монотерпеновых кетонов с образованием ментола в качестве одного из основных продуктов реакции. Процесс биотрансформации осуществляется на генетической основе и может быть исполь-
8 зован для исследования биогенетических взаимоотношений монотерпенов и анализа геномной структуры исходных растений по генам, контролирующим биосинтез эфирного масла. - Существуют три биогенетических пути образования непосредственного предшественника (-) ментола - (-) ментона: через (+) пулегон, (+) пиперитон и (+) изоментон. Клетки высокоментольного вида М. canadensis реализуют все указанные биогенетические возможности. Клетки М. piperita , отличающейся более низким уровнем накопления ментола, эффективно включают в биосинтез данного вещества лишь один из перечисленных предшественников - (+) пулегон.
Работа выполнена в лаборатории экспериментальной биологии ВНИИ эфиромасличных культур в 1979-83 г. по теме 01.29. "Исследовать закономерности биосинтеза эфирного масла с целью создания моделей оптимальных сортов эфиромасличных культур (мята, роза, лаванда, шалфей, герань) и совершенствования технологических приемов переработки сырья" (№ государственной регистрации 0184007560
Хромато-масс-спектрометрический анализ эфирного масла был выполнен в Институте физиологии растений им. К.А.Тимирязева АН СССР ст.научным сотрудником, канд.хим.наук Пауковым В.Н., которому автор выражает сердечную благодарность.
Автор глубоко признателен своему научному руководителю доктору биол.наук, профессору Резниковой С.А. за постоянную помощь и внимание, а также А.Х.Липскому, канд.хим.наук В.Н.Мельникову и кандидатам биол.наук П.С.Бугорскому и Л.А.Бугаенко, ценные консультации которых способствовали выполнению различных этапов настоящей работы.
Эфирные масла и особенности их биосинтеза у мяты
Эфирные масла представляют собой сложные смеси летучих веществ вторичного происхождения, продуцируемые растениями и обусловливающие их запах. Компоненты эфирных масел имеют разнообразную химическую природу, однако наиболее характерны для них моно-и сесквитерпены.
Способность к накоплению данных продуктов свойственна представителям различных систематических групп растений, в первую очередь, семейств Lamiaceae, Apiaceae, Asteraceae и др. Местами накопления эфирных масел в растениях могут служить различные органы: листья, цветки, плоды, корни и т.д. Установлено, что накопление и, очевидно, образование эфирных масел связано с функционированием секреторных структур различной сложности - от одноклеточных идиобластов и относительно малоспециализированного секреторного эпидермиса до высокоорганизованных желёзок /19,32/.
Одним из характерных представителей эфиромасличной флоры, имеющим большое практическое значение, является мята (Mentha ,SP.)- многолетнее травянистое растение семейства Lamiaceae Основная масса эфирного масла у данного растения накапливается в листьях и соцветиях /83/. Секреторные структуры мяты представлены высокоспециализированными образованиями эпидермального происхождения - 3-клеточными железистыми волосками и 10-клеточными эфиромасличными желёзками /92/.
В составе эфирного масла различных видов мяты обнаружено в общей сложности около 400 компонентов, среди которых преобладают соединения терпеноидной природы, в первую очередь монотерпены /37,167/. Состав и соотношение отдельных компонентов эфирного масла - генетически обусловленный признак /151/. Среди различных видов, внутривидовых форм, естественных и искусственных межвидовых гибридов рода Mentha выявлено несколько десятков различных" хемотипов, характеризующихся преобладанием в масле того или иного компонента /42,94.167,198/.
Из всего многообразия хемотипов в производстве возделыва ются главным образом формы, накапливающие в качестве основного компонента монотерпеновый спирт ментол, биологическая активность и приятный холодящий вкус которого определяют использование мятно го масла в медицине, пищевой и парфюмерно-косметической промышлен ности. Большинство ментолсинтезирующих форм мяты относятся к двум видам: мята перечная ( Mentha х piperita L. ) и мята канадская, или японская ( Mentha canadensis L., syn. M. arvensis var. piperascens Holm., M. haplocalyx Brig., M. sachalinensis Kudo /91/. Два названных вида су щественно различаются по происхождению и систематическому положению, морфобиологическим особенностям и содержанию ментола в эфирном масле (соответственно 40-50 и 70-80%) /55/. Возможно, что генетически обусловленное количественное несовпадение уровней накопления ментола у данных видов связано с различиями в системе его биосинтеза.
Инициация суспензионных культур
При инициации суспензионной культуры мяты перечной использовался роллерный аппарат (9 об./мин). Перед начальным субкультивированием клеток была проведена стандартная операция фракционирования суспензии в мерных цилиндрах с целью освобождения от недиссоциировавших остатков каллуса и снижения степени агрегиро-ванности /35,43/.
Полученная в результате фракционирования суспензия, как и ожидалось, была мелкоагрегированной (средний размер агрегата 5,6 клеток). Однако при этом она отличалась весьма низкой жизнеспособностью (8,3% живых клеток при жизнеспособности исходного каллуса 62,7%) и невысокой плотностью (3,8 Ю4 кл./мл). В ней преобладали недифференцированные клетки меристематического типа (более 60%).
По-видимому, эти признаки культуры отчасти были обусловлены травмированием клеток при суспендировании и последующим отбором мелкоклеточной и мелкоагрегированной фракции, отличающейся низ- кой жизнеспособностью (рис.3). Не исключена также связь данного явления со сдвигами в жизненном цикле клеток, обусловленными переводом в жидкую среду. Несмотря на высокую степень диссоциации, такая суспензия не могла считаться хорошей модельной системой для исследования биосинтеза терпеноидов и нуждалась в повышении плотности и жизнеспособности.
Поэтому в дальнейшем использовался мягкий режим культивирования клеток: операцию фракционирования не повторяли; в ходе субкультивирования применяли минимальное разведение С 1:3). При таких условиях выращивания жизнеспособность культуры уже к концу первого пассажа увеличилась до 31,6%, а во втором пассаже достигла величины, характерной для исходного каллуса (61,1%).
Число клеток в единице объема суспензии за 24 дня возрастало в 6-7 раз. Вследствие диспропорции между темпами размножения клеток и принятой нами степенью разбавления суспензии ее плотность быстро увеличивалась, составив к концу 3-го пассажа около 10 кл./мл или 156 мг/мл сырой биомассы. При повышении степени : разбавления до 1:6 рост плотности продолжался, хотя темпы его снизились (рис.4А). В результате в 5-8 пассаже культура достигла значительной степени загущения, что сопровождалось некоторым снижением жизнеспособности клеток. Причиной этого могло быть усиление их конкуренции за метаболиты или накопление в среде токсических продуктов жизнедеятельности.
Диспергированность клеток в суспензии также претерпевала закономерные изменения в ходе культивирования. В течение первых четырех пассажей культура росла по типу каллусной ткани, то есть без диссоциации новообразующихся клеток. В результате величина агрегатов непрерывно возрастала и к 4-му пассажу достигла среднего значения 37,9 кл./агрегат.
Общие закономерности процесса
Целью данной работы было изучение состояния ферментных систем, отвечающих за осуществление основных этапов биосинтеза ментола.
При внесении в клеточные культуры мяты экзогенных монотерпе-новых кетонов наблюдалась убыль последних, нередко сопровождавшаяся появлением в инкубационной среде новых соединений. Для точной интерпретации получаемых результатов необходимо было выяснить, какие процессы (биотические и абиогенные) при этом происходили, а также оценить их соотношение. С этой целью, наряду с жизнеспособными клеточными суспензиями, экзогенные монотерпены инкубировали также с различными системами, лишенными ферментативной активности. Субстратом для данных контрольных опытов, как правило, служил ментон, хотя испытывались также и другие монотерпены (изомен-тон, пулегон и др.).
Результаты экспериментов показали, что в отсутствие жизнеспособных клеток никакие качественные изменения субстрата не происходят. Это дало основание считать появляющиеся в ходе инкубации вещества, накопление которых происходило параллельно с убылью субстрата и значительно превышало количество эндогенных монотерпенов в культуре, продуктами ферментативной трансформации введенных соединений. Вместе с тем, были обнаружены также процессы абиогенного расходования экзогенных монотерпенов (табл.20).
Так, инкубирование 2 мг ментона с дистиллированной водой на роллерном аппарате в течение 25 ч приводило примерно к двукратному уменьшению количества монотерпена. Очевидно, причиной этого являлось его испарение из водно-спиртового раствора, усиливавшееся вследствие непрерывного перемешивания последнего. Замена воды жидкой питательной средой Лина и Стабы не оказывала существенного влияния на расходование монотерпенов в системе, что свидетельствовало об отсутствии химического взаимодействия введенного соединения с компонентами среды. Использование в качестве инкубационной среды клеточной суспензии, предварительно инактивированной кипячением, приводило к небольшому, но достоверному увеличению потерь монотерпенов по сравнению с описанными выше вариантами. Возможно, это было обусловлено адсорбцией некоторой части инкубируемого вещества на поверхности клеток.
Таким образом, в описанное выше явление расходования введенных в клеточную суспензию веществ могли вносить вклад процессы их испарения и адсорбции. Вместе с тем, это не исключало наличия биогенных путей расходования монотерпенов, в частности, их катаболи-ческого разрушения или перехода в связанную форму. В пользу этого свидетельствовали значительные размеры потерь монотерпенов (вплоть до их практически полного исчезновения из системы после 24 ч инкубации), не объяснимые полностью описанными выше механизмами, а также зависимость скорости данного процесса от генетических особенностей культуры.
Очевидно, для лучшего понимания механизмов биотрансформации необходимо было установить, в каком компартменте суспензионной культуры (внутри клеток или же в культуральной жидкости) осуществляется процесс и где локализуются его продукты.
Биосинтез эфирного масла in vitro и in vivo : сходство и различия
.Идя интерпретации полученных экспериментальных данных сопоставим условия и результаты биосинтеза монотерпенов in vitro и in vivo . Представляется очевидным, как из общетеоретических соображений, так и исходя из полученных результатов, что изолированные клетки сохраняют наследственную информацию исходных растений о путях биосинтеза эфирного масла. Более того, результаты опытов (особенно по биотрансформации монотерпенов) показывают, что в них присутствуют достаточно активные ферментные системы, способные осуществлять процесс биосинтеза. К такому же выводу приводят и некоторые литературные данные, в частности, результаты Банторпа с соавторами /105/.
В такой ситуации наблюдавшиеся отклонения в количестве и составе продуцируемого клетками in vitro эфирного масла, очевидно, можно связать с условиями реализации этих генетических и биохимических потенций, в первую очередь, с отсутствием специализированных секреторных образований. Поэтому рассмотрение полученных результатов позволяет уточнить роль данных структур в маслообразовательном процессе.
Полученные данные показывают, что процесс биосинтеза может осуществляться и в отсутствие специализированных секреторных структур. На этом основании некоторые авторы делают вывод о том, что и в органах целого растения способность к образованию компонентов эфирного масла свойственна всем составляющим их клеткам, тогда как функция железистых структур сводится к роли "депо", накапливающего продукты биосинтеза /231/.
Вместе с тем, как в литературе, так и в наших результатах можно обнаружить факты, не вполне укладывающиеся в эту концепцию. Так, почти все авторы, изучавшие локализацию эфирного масла в культурах тканей гистохимическими методами, отмечали его присутствие лишь в некоторых клетках, которые иногда по внешним признакам не отличались от клеток, не накапливавших эфирного масла /45,48,63,84/. Имеются такие данные и в отношении тканевых культур мяты, в том числе одного из изучавшихся нами штаммов /45/.
Это говорит о том, что в условиях in vitro клеточная популяция не является однородной в отношении биосинтеза эфирного масла и в ее составе выделяются некоторые объекты, проявляющие повышенную биосинтетическую способность.
