Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1. Морфогенез в культуре клеток растений 8
1.1.1. Факторы, влияющие на реализацию морфогенного потенциала in vitro 10
1.1.1.1. Влияние генотипа 10
1.1.1.2. Влияние фитогормонов на морфогенез 15
1.2. Особенности секреции у растений 19
1.3. Секреция макромолекул культурами клеток растений 23
1.3.1. Секреция белков и гликопротеинов 23
1.3.1.1. Секреция белков и морфогенный потенциал культивируемых клеток 23
1.3.1.2. Влияние экзогенных факторов и условий культивирования на секрецию белков и гликопротеинов 25
1.3.1.3. Участие секретируемых белков в регуляции дифференцировки и морфогенеза 27
1.3.2. Выделение полисахаридов культурами клеток 40
1.3.2.1. Особенности секреции полисахаридов культурами клеток растений 40
1.3.2.2. Роль внеклеточных полисахаридов в культурах клеток растений 45
1.3.2.3. Роль олигосахаринов 46
2. Материалы и методы исследования 49
2.1. Объект исследования 49
2.2. Условия культивирования 50
2.3. Приготовление цитогенетических препаратов 52
2.4. Определение митотической активности 53
2.5. Определение жизнеспособности клеток 53
2.6. Приготовление препаратов для гистологических и электронно-микроскопических исследований 53
2.7. Выделение фракции водорастворимых белков из каллусной ткани 54
2.8. Выделение полимеров из среды культивирования 54
2.9. Получение фракции поверхностных полимеров 55
2.10. Выделение арабиногалактановых белков 56
2.11. Определение содержания моносахаридов 59
2.12. Электрофорез белков в полиакриламидном геле 59
2.13. Определение активности пероксидазы 61
2.14. Влияние реагента Ярива на воспроизводство ПЭКК в морфогенном каллусе гречихи 62
2.15. Определение уровня тирозинового фосфорилирования белков 62
3. Результаты и их обсуждение 63
3.1. Динамика экстраклеточных полимеров каллусных культур гречихи татарской
с различной морфогенной активностью в ходе культурального цикла 64
3.2. Сравнение внутриклеточных и внеклеточных белков морфогенного и неморфогенного каллусов 74
3.3. Динамика полипептидного спектра поверхностных белков морфогенного каллуса в ходе пассажа 86
3.4. Влияние ингибитора секреции белков брефельдина А на процесс воспроизводства проэмбриональных клеточных комплексов в морфогенном каллусе гречихи 90
3.5. Арабиногалактановые белки, секретируемые морфогенными и неморфогенными культурами 96
3.5.1. Секретируемые арабиногалактановые белки в морфогенных и неморфогенных культурах гречихи татарской 100
3.5.2. Влияние ингибитора арабиногалактановых белков реагента Ярива на рост и морфогенез в каллусных культурах гречихи татарской 100
3.5.3. Электронно-микроскопическое изучение клеток морфогенного каллуса гречихи татарской при действии реагента Ярива 111
3.5.4. Влияние реагента Ярива на фосфорилирование белков in situ по остаткам тирозина 119
Заключение 124
Выводы 127
Список литературы 129
- Влияние экзогенных факторов и условий культивирования на секрецию белков и гликопротеинов
- Особенности секреции полисахаридов культурами клеток растений
- Сравнение внутриклеточных и внеклеточных белков морфогенного и неморфогенного каллусов
- Влияние реагента Ярива на фосфорилирование белков in situ по остаткам тирозина
Введение к работе
Культивируемые клетки растений выделяют в питательную среду большое количество разнообразных соединений, многие из которые жизненно необходимы для пролиферации клеток и сохранения их морфогенетических потенций. Например, установлено, что активация деления в суспензионных культурах при переносе на новую среду зависит от плотности культуры: чем ниже начальная плотность культуры, тем дольше лаг-фаза (Sakano et al., 1995), а в некоторых случаях культивирование при низкой плотности вызывает апоптоз (McCabe et al., 1997). Напротив, добавление кондиционированной среды позволяет клеткам пролиферировать и при низкой плотности культивирования (Bellincampi, Morpurgo, 1987; Bellincampi, Morpurgo, 1989; Huang et al., 1990). Вероятно, в кондиционированной среде накапливаются определенные факторы, которые поддерживают жизнеспособность клеток и позволяют им делиться при низкой плотности культивирования. Ни один из известных до сих пор гормонов не способен заменить собой кондиционированную среду. «Факторы кондиционирования» объединяют широкий класс разнообразных молекул. К ним относятся: арабиногалактановые белки (McCabe et al., 1997; Toonen at al., 1997), липохитоолигосахариды (Dyachok et al., 2002), олигосахариды (Schroder et al.,1998), пептиды (Matsubayashi, Sakagami, 1996; Kobayashi et al., 1999b). Установлено, что факторы кондиционирования могут как стимулировать, так и ингибировать эмбриогенный потенциал и развитие соматических зародышей in vitro (Gavish et al., 1992; Toonen at al., 1997; Maes et al., 1997; Kobayashi et al., 1999b). В связи с этим питательная среда может рассматриваться как экстраклеточный компартмент клетки, а динамика секреции молекул - как важная составляющая общего метаболизма культуры, оказывающая влияние на дифференцировку клеток и морфогенез in vitro.
Сравнительное исследование динамики секреции и состава молекул, секретируемых культурами с различным морфогенным потенциалом, может быть одним из подходов для выявления соединений, регулирующих морфогенетическую активность клеток. Цель и задачи исследований.
Цель проводимых исследований заключалась в определении роли внеклеточных полимеров в процессах роста и морфогенеза в культурах клеток гречихи татарской Fagopyrum tataricum (L.) Gaertn. с различным морфогенным потенциалом. Для достижения указанной цели были поставлены следующие задачии:
1. Проследить динамику содержания внеклеточных полимеров (белков и полисахаридов) в ходе культурального цикла.
2. Сравнить спектры внутриклеточных белков, поверхностных белков и белков из среды культивирования морфогенного и неморфогенного каллусов и выявить характерные особенности.
3. Проследить динамику спектра поверхностных белков морфогенного каллуса в ходе пассажа.
4. Определить влияние ингибитора везикулярной секреции брефельдина А на процесс воспроизводства проэмбриональных клеточных комплексов в морфогенном каллусе гречихи.
5. Установить качественный и количественный состав секретируемых арабиногалактановых белков в каллусных и суспензионных культурах гречихи татарской.
6. Выявить влияние ингибитора арабиногалактановых белков реагента Ярива на рост и морфогенез в каллусных культурах гречихи татарской.
Положения, выносимые на защиту.
1. Количество внеклеточных белков и полисахаридов существенно выше в морфогенных культурах гречихи татарской, чем в неморфогенных культурах. Динамика спектра внеклеточных белков и гликопротеинов в морфогенных культурах связана с процессом образования и развития проэмбриональных клеточных комплексов.
2. Спектр внеклеточных белков и гликопротеинов у морфогенных культур более разнообразен, чем у неморфогенных. Секреция белков необходима для воспроизводства ПЭКК в морфогенных культурах гречихи татарской.
Количество и спектр секретируемых арабиногалактановых белков существенно различается у морфогенных и неморфогенных культур гречихи татарской. Морфогенные культуры секретируют в 30-100 раз больше арабиногалактановых белков, чем неморфогенные. Спектр внеклеточных АГБ морфогенных культур содержит 2 полипептида, а неморфогенных только 1 полипептид.
Арабиногалактановые белки, выделяемые морфогенными культурами гречихи татарской участвуют в воспроизводстве ПЭКК.
Влияние экзогенных факторов и условий культивирования на секрецию белков и гликопротеинов
Известно, что рост каллусных культур и регенерация сильно зависят от генотипа растений. Например, частота морфогенеза у 12 сортов капусты Brassica oleracea значительно варьировала от сорта к сорту, хотя общее количество регенерирующих каллусов зависело от содержания гормонов в среде культивирования (Dietert et al., 1982). Шукла и Соуни (Shukla, Sawhney, 1997) показали зависимость морфогенеза от генотипа на примере рапса двух форм (фертильной и с ядерной мужской стерильностью). Различная способность к соматическому эмбриогенезу была показана у Arachis hypogaea (Ozias-Akins et ah, 1992), и у Trifolium pratense (Keyes et al., 1980). Из четырех изученных сортов кукурузы три сорта формировали каллусные культуры, способные к геммогенезу, и один - культуры, способные к соматическому эмбриогенезу (Green, Phillips, 1975). Наоборот, у Carthamus tinctorius L. из восьми сортов только один оказался неспособным к формированию эмбриогенных каллусов и регенерации через соматический эмбриогенез (Mandal et al., 2001). Лу и Озиас-Аткинс (Lu, Ozias-Akins, 1982) сообщили о развитии соматических зародышей из каллусов, полученных из 12 сортов кукурузы Zea mays, но частота морфогенетического отклика значительно колебалась в зависимости от сорта. При использовании в качестве эксплантов незрелых зародышей, доля эксплантов, формирующих эмбриогенный каллус, значительно варьирует в зависимости от генотипа. Проведенный анализ более 50 линий и гибридов кукурузы также подтвердил это предположение (Долгих, 2005). В настоящее время можно считать установленной генетическую обусловленность признака «регенерационная способность» и его четкую зависимость от генотипа у кукурузы (Чеченева и соавт., 1990), томата (Лутова и др., 1994), пшеницы (Чернышева и др., 1988) и других растений. В некоторых случаях гены, контролирующие регенерацию в культуре ткани, локализуются сгруппированно, в определенных участках хромосом. Установлено, что в процессе соматического эмбриогенеза у люцерны работают два кодоминантных гена (Hernandez-Fernandez, Christie 1989; Kielly, Bowley 1992). В работе Омельянчука и соавт. (Omelianchuk et al., 1992) на культуре клеток пшеницы показано участие группы Rht генов, контролирующих рост междоузлий и определяющих чувствительность клеток растений к гиббереллшгу, в регуляции развития побегов in vitro.
Удобной системой для изучения генов, регулирующих морфогенез, является соматический эмбриогенез. Обнаружено, что в процессе индукции соматического эмбриогенеза происходит экспрессия различных генов (Chung, Khurana, 2002), которые можно разделить на следующие группы:
Гены «домашнего хозяйства» (housekeeping genes), которые обеспечивают основные метаболические и физиологические процессы, необходимые для клеточной дифференцировки. К таким генам относится ген топоизомеразы I (top Г), проявление активности которого связано с метаболизмом ДНК и Ген top I максимально экспрессируется на стадии торпедо, когда отмечается высокая митотическая активность (Balestrazzi et al., 1996; 2001). Геном, активирующимся на ранних стадиях соматического эмбриогенеза у моркови является ген СЕМ-1 (Kawahara et al., 1992), который активно экспрессируется главным образом на стадии глобулы, в меньшей степени, - на сердцевидной стадии. Этот ген кодирует фактор элонгации EF-1 (elongation-factor la), необходимый для биосинтеза белка на рибосомах. Экспрессия данного гена, по-видимому, связана с необходимостью высокой скорости белкового синтеза на ранних этапах соматического эмбриогенеза. Японскими исследователями (Takahata et al., 2004) был выделен ген C-ESE-1 (Carrot Early Somatic Embryogenesis-1), экспрессирующийся на ранних стадиях соматического эмбриогенеза в суспензионной культуре моркови после исключения 2,4-Д из среды культивирования. Ген C-ESE-1 кодировал белок, который являлся гликопротеином и обладал агглютинирующей активностью. Этот белок специфически экспрессировался в примордиальных клетках соматических зародышей. Интересно отметить, что трансгенные клеточные культуры со сниженной экспрессией гена C-ESE-1 характеризовались большими межклетниками и снижением количества полисахаридов на клеточной поверхности.
Гены ответа клеток на действие фитогормонов (hormone-responsive genes). Показано, что кратковременная обработка высокими концентрациями 2,4-Д приводила к индукции соматического эмбриогенеза в эксплантах моркови и люцерны, при этом клетки переходили из фазы Gi в S-фазу клеточного цикла. Было обнаружено, что такой переход связан с экспрессией генов циклинов (cdk-гены). Обнаружен ген cdc2MS, кодирующий сс!с2-зависимую протеинкиназу, участвующую в контроле клеточного цикла (Hata et al., 1991). Таким образом, обработка высокой концентрацией ауксина, являясь стрессовым воздействием, одновременно является триггером, запускающим клеточное деление, и стимулирует клетки к дифференцировке с образованием соматических зародышей (Dudits et al., 1991). Выявлен ряд генов, индуцируемых ауксином, так называемые SAUR-гспы (small auxine up-regulated), среди них гены pJCW 1 upJCW2, которые идентифицированы на культуре клеток сои (Walker, Key, 1982). Обнаружено, что экспрессия кДНК-клонов этих генов в трансформированных клетках люцерны была индуцирована ауксином и наблюдалась только в клетках эмбриогенной суспензии, способных к образованию соматических зародышей. Наряду с акусин 13 индуцируемыми генами были идентифицированы гены, индуцируемые абсцизовой кислотой. Так, показано, что абсцизовая кислота индуцирует экспрессию гена AtECP-63, кодирующего белок LEA (late embryogenic protein), содержание которого увеличивается в процессе перехода соматического зародыша к стадии торпедо (Yang etal., 1997).
Гены, обеспечивающие работу сигнальных каскадов. Это группа генов, кодирует ряд протеинкиназ, участвующих в сигнальных каскадах в процессе соматического эмбриогенеза. У люцерны идентифицированы гены ASET1- ASET3, экспрессия которых обнаружена на ранних этапах развития соматических зародышей в эмбриогенных линиях, и не выявлена в неэмбриогенных линиях (Giroux, Pauls, 1997). Экспрессия генов SERK (somatic embryogenesis protein kinase) также необходима при индукции соматического эмбриогенеза и обнаружена при образовании глобулярного зародыша из компетентных клеток (Torii et al., 1996). На эмбриогенной культуре арабидопсиса была выявлена экспрессия гена AtSERK-1 (arabidopsis thaliana somatic embryogenesis protein kinase), который кодировал протеинкиназу, локализованную на внешней стороне цитоплазматической мембраны клеток. Было обнаружено, что способность к соматическому эмбриогенезу у каллуса, полученного из проростков арабидопсиса со сверхэкспрессией этого гена, была в три-четыре раза выше, чем у растений дикого типа.
Особенности секреции полисахаридов культурами клеток растений
Участие АГБ в регуляции роста растений установлено, главным образом, на основании экспериментов с реагентами Ярива, обработка которыми ингибирует рост клеточных культур (Serpe, Nothnagel, 1994), пыльцевых трубок (Roy et al., 1998), проростков (Willats, Knox, 1996), развитие соматических зародышей (Thompson, Knox, 1998). Показано, что остановка роста, вызванная реагентами Ярива, может быть связана как с ингибированием растяжения клеток (Willats, Knox, 1996), так и с ингибированием их пролиферации (Thompson, Knox, 1998). Основная гипотеза, которая поддерживается многими исследователями, состоит в том, что АГБ участвуют в морфогенезе растений как маркеры клеточной идентичности или даже как регуляторные молекулы. Эта гипотеза первично основывалась на том, что экспрессия и/или модификация некоторых АГБ имеет пространственно-временные формы (т.е. наблюдается в разных тканях или клетках и в разное время) и коррелирует с определенными этапами развития растений.
Использование моноклональных антител (MAT) МАС207 (Pennell, Roberts, 1990) и JIM8 (Pennell et al., 1991), специфичных к АГБ, продемонстрировало, что экспрессия определенных АГБ-эпитопов четко контролируется в связи с дифференциацией цветка и корня (Jauh, Lord, 1996; Knox et al., 1989; 1991).
Показано (Sherrier et al., 1999), что экспрессия отдельных АГБ, принадлежащих к разным субклассам классических АГБ (классические, Lys-богатые, арабиногалактановые пептиды, фасциклинподобные АГБ) изменяется по-разному при переходе тканей корня к дедифференциации (образованию каллуса) и редифференциации (образованию почек из каллуса или корня). Интересно, что образование почек из тканей корня и из каллуса, полученного из корня, сопровождалось различной экспрессией одного, двух АГБ, принадлежащих к разным субклассам. К сожалению, принципиальный вопрос, «является ли появление на поверхности определенных АГБ эпитопов результатом диффереицировок или, наоборот, формирование новых АГБ эпитопов вызывает процессы дифференцировки», остается до конца не разрешенным.
К настоящему времени получены достаточно веские аргументы в пользу того, что АГБ вовлечены как в соматический, так и в зиготический эмбриогенез. Развитие соматических зародышей в культивируемых клетках растений происходит из специализированных структур - проэмбриогенных масс (ПЭМ), или согласно другой терминологии - проэмбриональных клеточных комплексов (ПЭКК) (Williams, Maheswaran, 1986). Индукция соматического эмбриогенеза in vitro активируется уменьшением или удалением ауксина 2,4-Д из среды культивирования. Показано (Stacey et al., 1990), что при культивировании клеток моркови в среде с 2,4-Д лишь отдельные поверхностные клетки ПЭМ экспрессируют эпитоп JIM4. Снижение концентрации 2,4-Д в среде культивирования вызывало появление этого АГБ-эпитопа на поверхности почти всех клеток ПЭМ. При переходе соматического зародыша моркови к стадии сердечка эпитоп JIM4 появлялся на границе между будущим корнем и стеблем, а на стадии торпедо - в клетках проваскуолярной ткани. Использование МАТ к АГБ ЛМ8 позволило Пеннелю и соавт. (Pennell et al., 1992) установить, что эпитоп JIM8 появляется в клеточных стенках клеток моркови на очень коротком этапе культивирования - когда в них индуцируется эмбриогенная программа. Интересно, что инициация культуры не сопровождалась экспрессией эпитопа JIM8, а в ходе образования ПЭМ эпитоп JIM8 быстро терялся. На основании этих результатов было сделано предположение, что появление эпитопа JIM8 в клеточных стенках определенных клеток «маркирует» их состояние перехода на путь соматического эмбриогенеза. Однако впоследствии исследователи (Toonen et al., 1997) проследили развитие клеток, меченных JIM8, и показали, что только некоторые из этих клеток затем развиваются в соматические зародыши. Ревизия гипотезы Пеннеля и соавт.. (Pennell et al., 1992) была проведена затем МакКейбом и соавт. (McCabe et al., 1997). На основании выполненных исследований был сделан вывод о том, что эмбриогенной способностью обладают только маленькие, сферические, вакуолизированные клетки, которые имеют JIM8 антиген в клеточной стенке. Эти клетки, обозначенные как тип В, в дальнейшем подвергаются поляризации и асимметрично делятся. Одна из дочерних клеток (тип F) - маленькая, сферическая, вакуолизированная - имеет на поверхности JIM8 антиген. Другая клетка (тип С) -маленькая, сферическая, с плотной цитоплазмой - не имеет на поверхности JIM8 антигена. Компетентными к развитию в соматический зародыш является только клетки, принадлежащие к типу С, но для этого требуются растворимые сигнальные молекулы, поступающие от клеток типа В или других клеток ЛМ8(+) популяции. В исследованиях Кройгера и ван Хольста (Kreuger, van Hoist, 1993) было показано, что соматический эмбриогенез в суспензионной культуре моркови может изменяться при добавлении экзогенных АГБ. АГБ, выделенные из старой неморфогенной культуры, ингибировали морфогенный потенциал молодых, способных к соматическому эмбриогенезу, культур. Напротив, тотальная фракция АГБ из семян моркови увеличивала количество эмбриогенных клеток или даже восстанавливала эмбриогенный потенциал «старой», утратившей регенерационную способность культуры. Однако в последующих исследованиях (Kreuger, van Hoist, 1995), когда смесь АГБ была очищена и получены МАТ к определенным фракциям АГБ, оказалось, что АГБ из семян моркови, связываемые MAT ZUM15, снижают эмбриогенный потенциал культуры клеток моркови, а АГБ, связываемые МАТ ZUM18, наоборот, его увеличивают. Таким образом, было установлено, что стимулирующее или ингибирующее влияние фракции АГБ на клетки определяется соотношением конкретных АГБ-эпитопов, которые входят в состав общей фракции АГБ. Интересно, что эффект, оказываемый фракцией АГБ ZUM18, варьировал в зависимости от используемой концентрации, а действие вносимого фактора проявлялось при очень низкой концентрации (порядка 2 нМ). Кроме того, активность этой фракции не зависела от видовой принадлежности объекта: ZUM18 фракция АГБ семян томата увеличивала эмбриогенный потенциал суспензий моркови, a ZUM18 фракция АГБ семян моркови стимулировала соматический эмбриогенез в клеточных линиях цикламена (Kreuger, van Hoist, 1995; Kreuger et al., 1995).
Роль ГФИ якоря в функционировании АГБ остается пока непонятной. Следует отметить, что среди белков растений к настоящему времени идентифицировано лишь несколько белков, имеющих ГФИ якорь. Однако компьютерный анализ генома арабидопсиса позволяет предположить, что число таких белков превышает 200. Доля АГБ среди них составляет приблизительно 16% (Borner et al., 2002). Некоторые белки животных, имеющие ГФИ якорь, вовлечены в каскады сигнальной трансдукции (Peles et al., 1997; Kleeff et al., 1998; Resta et al., 1998). Поскольку трансдукция сигнала осуществляется через взаимодействие с другими мембранносвязанными белками, то в этом случае АГБ растений должны взаимодействовать с молекулами, имеющими как внутриклеточный, так и экстраклеточный домен. Число таких интегральных белков плазмалеммы, идентифицированных в растениях, увеличивается с каждым годом, например, ассоциированная с клеточной стенкой киназа (wall associated kinase - WAK) и киназа рецептора соматического эмбриогенеза (somatic embryogenesis receptor kinase - SERK) (Lease et al., 1998). Тем не менее, к настоящему времени имеются лишь косвенные указания на то, что АГБ могут взаимодействовать с одним из таких белков, а именно WAK (Gens et al., 2000).
Сравнение внутриклеточных и внеклеточных белков морфогенного и неморфогенного каллусов
Участие АГБ в регуляции роста растений установлено, главным образом, на основании экспериментов с реагентами Ярива, обработка которыми ингибирует рост клеточных культур (Serpe, Nothnagel, 1994), пыльцевых трубок (Roy et al., 1998), проростков (Willats, Knox, 1996), развитие соматических зародышей (Thompson, Knox, 1998). Показано, что остановка роста, вызванная реагентами Ярива, может быть связана как с ингибированием растяжения клеток (Willats, Knox, 1996), так и с ингибированием их пролиферации (Thompson, Knox, 1998). Основная гипотеза, которая поддерживается многими исследователями, состоит в том, что АГБ участвуют в морфогенезе растений как маркеры клеточной идентичности или даже как регуляторные молекулы. Эта гипотеза первично основывалась на том, что экспрессия и/или модификация некоторых АГБ имеет пространственно-временные формы (т.е. наблюдается в разных тканях или клетках и в разное время) и коррелирует с определенными этапами развития растений.
Использование моноклональных антител (MAT) МАС207 (Pennell, Roberts, 1990) и JIM8 (Pennell et al., 1991), специфичных к АГБ, продемонстрировало, что экспрессия определенных АГБ-эпитопов четко контролируется в связи с дифференциацией цветка и корня (Jauh, Lord, 1996; Knox et al., 1989; 1991).
Показано (Sherrier et al., 1999), что экспрессия отдельных АГБ, принадлежащих к разным субклассам классических АГБ (классические, Lys-богатые, арабиногалактановые пептиды, фасциклинподобные АГБ) изменяется по-разному при переходе тканей корня к дедифференциации (образованию каллуса) и редифференциации (образованию почек из каллуса или корня). Интересно, что образование почек из тканей корня и из каллуса, полученного из корня, сопровождалось различной экспрессией одного, двух АГБ, принадлежащих к разным субклассам. К сожалению, принципиальный вопрос, «является ли появление на поверхности определенных АГБ эпитопов результатом диффереицировок или, наоборот, формирование новых АГБ эпитопов вызывает процессы дифференцировки», остается до конца не разрешенным.
К настоящему времени получены достаточно веские аргументы в пользу того, что АГБ вовлечены как в соматический, так и в зиготический эмбриогенез. Развитие соматических зародышей в культивируемых клетках растений происходит из специализированных структур - проэмбриогенных масс (ПЭМ), или согласно другой терминологии - проэмбриональных клеточных комплексов (ПЭКК) (Williams, Maheswaran, 1986). Индукция соматического эмбриогенеза in vitro активируется уменьшением или удалением ауксина 2,4-Д из среды культивирования. Показано (Stacey et al., 1990), что при культивировании клеток моркови в среде с 2,4-Д лишь отдельные поверхностные клетки ПЭМ экспрессируют эпитоп JIM4. Снижение концентрации 2,4-Д в среде культивирования вызывало появление этого АГБ-эпитопа на поверхности почти всех клеток ПЭМ. При переходе соматического зародыша моркови к стадии сердечка эпитоп JIM4 появлялся на границе между будущим корнем и стеблем, а на стадии торпедо - в клетках проваскуолярной ткани. Использование МАТ к АГБ ЛМ8 позволило Пеннелю и соавт. (Pennell et al., 1992) установить, что эпитоп JIM8 появляется в клеточных стенках клеток моркови на очень коротком этапе культивирования - когда в них индуцируется эмбриогенная программа. Интересно, что инициация культуры не сопровождалась экспрессией эпитопа JIM8, а в ходе образования ПЭМ эпитоп JIM8 быстро терялся. На основании этих результатов было сделано предположение, что появление эпитопа JIM8 в клеточных стенках определенных клеток «маркирует» их состояние перехода на путь соматического эмбриогенеза. Однако впоследствии исследователи (Toonen et al., 1997) проследили развитие клеток, меченных JIM8, и показали, что только некоторые из этих клеток затем развиваются в соматические зародыши. Ревизия гипотезы Пеннеля и соавт.. (Pennell et al., 1992) была проведена затем МакКейбом и соавт. (McCabe et al., 1997). На основании выполненных исследований был сделан вывод о том, что эмбриогенной способностью обладают только маленькие, сферические, вакуолизированные клетки, которые имеют JIM8 антиген в клеточной стенке. Эти клетки, обозначенные как тип В, в дальнейшем подвергаются поляризации и асимметрично делятся. Одна из дочерних клеток (тип F) - маленькая, сферическая, вакуолизированная - имеет на поверхности JIM8 антиген. Другая клетка (тип С) -маленькая, сферическая, с плотной цитоплазмой - не имеет на поверхности JIM8 антигена. Компетентными к развитию в соматический зародыш является только клетки, принадлежащие к типу С, но для этого требуются растворимые сигнальные молекулы, поступающие от клеток типа В или других клеток ЛМ8(+) популяции. В исследованиях Кройгера и ван Хольста (Kreuger, van Hoist, 1993) было показано, что соматический эмбриогенез в суспензионной культуре моркови может изменяться при добавлении экзогенных АГБ. АГБ, выделенные из старой неморфогенной культуры, ингибировали морфогенный потенциал молодых, способных к соматическому эмбриогенезу, культур. Напротив, тотальная фракция АГБ из семян моркови увеличивала количество эмбриогенных клеток или даже восстанавливала эмбриогенный потенциал «старой», утратившей регенерационную способность культуры. Однако в последующих исследованиях (Kreuger, van Hoist, 1995), когда смесь АГБ была очищена и получены МАТ к определенным фракциям АГБ, оказалось, что АГБ из семян моркови, связываемые MAT ZUM15, снижают эмбриогенный потенциал культуры клеток моркови, а АГБ, связываемые МАТ ZUM18, наоборот, его увеличивают. Таким образом, было установлено, что стимулирующее или ингибирующее влияние фракции АГБ на клетки определяется соотношением конкретных АГБ-эпитопов, которые входят в состав общей фракции АГБ. Интересно, что эффект, оказываемый фракцией АГБ ZUM18, варьировал в зависимости от используемой концентрации, а действие вносимого фактора проявлялось при очень низкой концентрации (порядка 2 нМ). Кроме того, активность этой фракции не зависела от видовой принадлежности объекта: ZUM18 фракция АГБ семян томата увеличивала эмбриогенный потенциал суспензий моркови, a ZUM18 фракция АГБ семян моркови стимулировала соматический эмбриогенез в клеточных линиях цикламена (Kreuger, van Hoist, 1995; Kreuger et al., 1995).
Роль ГФИ якоря в функционировании АГБ остается пока непонятной. Следует отметить, что среди белков растений к настоящему времени идентифицировано лишь несколько белков, имеющих ГФИ якорь. Однако компьютерный анализ генома арабидопсиса позволяет предположить, что число таких белков превышает 200. Доля АГБ среди них составляет приблизительно 16% (Borner et al., 2002). Некоторые белки животных, имеющие ГФИ якорь, вовлечены в каскады сигнальной трансдукции (Peles et al., 1997; Kleeff et al., 1998; Resta et al., 1998). Поскольку трансдукция сигнала осуществляется через взаимодействие с другими мембранносвязанными белками, то в этом случае АГБ растений должны взаимодействовать с молекулами, имеющими как внутриклеточный, так и экстраклеточный домен. Число таких интегральных белков плазмалеммы, идентифицированных в растениях, увеличивается с каждым годом, например, ассоциированная с клеточной стенкой киназа (wall associated kinase - WAK) и киназа рецептора соматического эмбриогенеза (somatic embryogenesis receptor kinase - SERK) (Lease et al., 1998). Тем не менее, к настоящему времени имеются лишь косвенные указания на то, что АГБ могут взаимодействовать с одним из таких белков, а именно WAK (Gens et al., 2000).
Влияние реагента Ярива на фосфорилирование белков in situ по остаткам тирозина
Выделение экстраклеточных полимеров проводили из агаризованной среды по модифицированной нами методике. Для этого агаризованную среду отделяли от каллуса и затем центрифугировали в системе из двух пробирок (8000 g, 30 мин). Собранную жидкость пропускали через фильтры «Miracloth», а затем «Millipore» (США) с диаметром пор 0,22 мкм. Затем одной части фильтрата добавляли этанол до конечной концентрации 80% и оставляли на 12-24 ч при 4 С для осаждения полимеров. Образовавшийся осадок собирали центрифугированием (8000 g, 10 мин). Затем осадок высушивали в струе воздуха при комнатной температуре до полного испарения этанола. В дальнейшем эту фракцию использовали для спектрофотометрического анализа моносахаридов. Известно, что этанол способствует осаждению как полисахаридов, так и высоко гликозилированных белков (Fry, 1988), поэтому, чтобы получить фракцию белков, свободную от полисахаридов, к оставшейся части фильтрата добавляли ТХУ до конечной концентрации 15-20% для осаждения белков. Через 1 ч раствор центрифугировали (12000 g, 10 мин) и осадок отмывали охлажденным 80%-ным ацетоном и высушивали струе воздуха при комнатной температуре до полного испарения ацетона. В дальнейшем, эту фракцию использовали для определения содержания белка, по методу Брэдфорд (Bradford, 1976). Для выделения полимеров из жидкой среды культвирования, ее оделяли от клеток суспензии фильтрованием через три слоя фильтра «Miracloth», цетрифугировали (8000 g, 10 мин), а затем пропускали через фильтр «Millipore» (США) с диаметром пор 0,22. Белки и полисахариды выделяли методами осаждения описанными выше.
Получение фракции поверхностных полимеров проводили по модифицированной методике, предложенной Чапман и соавт. (Chapman et al., 2000). Каллусную культуру собирали с агаризованной среды, помещали в Трис-НС1 буфер рН 7.4, содержащий (мМ): Трис - 50, сахароза - 300, КС1 - 5, ЭДТА - 5, аскорбиновая кислота - 25, ДТТ - 10, PMSF - 1, (соотношение: 1г ткани на 5 мл буфера) и выдерживали в течение 1,5 ч на шейкере. Проведенные нами методические исследования позволии уменьшить время инкубации с 4-х ч до одного часа, поскольку основная масса белков и полисахаридов переходила в инкубационный раствор уже после первого часа инкубации в буфере (рис. 3). По нашему мнению, сокращение времени инкубации каллусной ткани в буфере позволяет избежать возможной деградации экстрагируемых полимеров. Затем полученную суспензию профильтровывали через три слоя «Miracloth». Фильтрат центрифугировали, (20000 g, 10 мин), а затем пропускали через фильтр «Millipore» (США) с диаметром пор 0,22 мкм. Белки осаждали добавлением этанола до конечной концентрации 80%.
Образовавшийся осадок собирали центрифугированием (5000 g, 10 мин). Затем осадок высушивали в струе воздуха при комнатной температуре до полного испарения ацетона. Полученный осадок использовали для последующего анализа. Содержание белка измеряли по методу Брэдфорд (Bradford, 1976). Количество полисахаридов определяли с помощью о-толуидинового реактива по методике Усова и Яроцкого (1974).
В большинстве работ для выделения и очистки арабиногалактановых белков (АГБ) используют специфическую преципитацию арабиногалактановых белков с (1,3,5-трис[4-/?-0-глюкопиранозил-гидроксифеішлазо]2,4,6-тригидроксибензол) синтетического тривалентного фенилгликозидного красителя, способного образовывать комплексы с арабиногалактановыми белками (АГБ), кратко - (fi-D-глюкозил)зреагент Ярива. Оптимум преципитации наблюдается при соотношении АГБ и реагента Ярива 1:1 (Jermyn, Yeow, 1975). Важно отметить, что близкие по составу к АГБ молекулы, например, арабиногалактаны, которые имеют сходную углеводную часть, но не имеют белкового кора, не преципитируются (J3-D- глюкозил)зреагентом Ярива. За основу был принят метод выделения АГБ, предложенный Кройгером и ван Хольстом (Kreuger, van Hoist, 1993), в который нами были вненесы некоторые модификации. Выделение АГБ проводили по следующей схеме (рис. 4). Внеклеточные полимеры из раствора поверхностных полимеров или из среды культивирования осаждали ацетоном (доводя его содержание до 80% от конечного объема), оставляли на ночь при 4 С, осадок отделяли центрифугированием). Полученный осадок высушивали, растворяли в небольшом количестве воды (до 1 мл). Затем, для преципитации АГБ добавляли (Р-0-глюкозил)зреагент Ярива, приготовленный согласно методу, предложенному Яривом и соавт. (Yariv et al., 1962) из реактивов производства «Sigma» (США) и оставляли на 12-24 ч, при 4 С. Осадок отделяли центрифугированием (12000 g, 10 мин). Затем, для диссоциации комплекса реагент Ярива-АГБ, были использованы 10% Na2S03, 10% Na2S203 и 0.1 М NaOH, однако наиболее оптимальным агентом для удаления реагента Ярива оказался 0,1 М раствор NaOH, т.к. его добавление приводило к полному растворению осадка. Диссоциацию проводили 0,1 М раствором NaOH с добавлением 0,15 М NaCl до полного растворения осадка. Затем белки очищали от NaOH и NaCl с помощью спин-колонок, заполненых сефадексом G-50. В результате получали раствор АГБ. Определение концентрации АГБ проводили методом радиальной диффузии в агарозном геле (Van Hoist, Clarke, 1986) и дот-блоттинга (Smallwood et al., 1996). Для радиальной диффузии аликвоты, содержание 100-300 мкг белка вносили в цилиндрические лунки, сделанные в 1%-ом агарозном геле, содержащем 0,15 М NaCl и 10 мкг/мл регента Ярива и оставляли на 12 ч при комнатной температуре. Количество АГБ в образце определяли по размеру кольца преципитации. Для дот-блоттинга, аликвоты объемом 20 мкл и содержащие по 100 мг белка наносили на цитроцеллюлозную мембрану «Sigma» (США) и оставляли до полного высыхания. Затем мембрану инкубировали 1 ч в растворе реагента Ярива (1 мг реагента Ярива растворяли в 20 мл 0,1 М фосфатного буфера рН 7.2 с добавлением ДМСО до конечной концентрации 0,2%). Далее мембрану споласкивали несколькими порциями дистиллированной воды и высушивали. Количество АГБ оценивали по величине и интенсивности окраски пятен. Калибровочную кривую строили по известным концентрациям гуммиарабика («Sigma», США).
