Содержание к диссертации
Стр.
Введение 6
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Систематика, распространение и история изучения 10
видов женьшеня.
1.2. Химический состав физиологически активных 13
соединений женьшеня и их фармакологическое действие.
1.2.1. Тритерпеновые гликозиды растений рода 14
Panax.
-
Тритерпеновые гликозиды Panax japonicus 19
-
Другие биологически активные соединения 21
женьшеня.
1.2.4. Физиологическая активность биологически 24
активных соединений женьшеня
1.2.5. Физиологическая активность биологически 30
активных соединений P.japonicus
1.2.6. Методы анализа тритерпеновых гликозидов 31
женьшеня
1.3. Женьшень in vitro 33
1.3.1. Культура клеток и тканей растений рода 3
Panax 3
1.3.2. Получение культур клеток и тканей 34
женьшеня
1.3.3. Другие способы культивирования женьшеня 36
in vitro
1.3.4. Физиологическая характеристика культур 38
клеток женьшеня
-
Оптимизация питательных сред 42
-
Использование элиситоров в культуре 46
клеток и тканей женьшеня
1.3.7. Глубинное выращивание суспензионных 48
культур клеток рода Panax
1.3.8. Режимы выращивания суспензионных 54
культур клеток рода Panax
Глава 2. Материалы и методы исследования 57
-
Объект исследования 57
-
Анализ роста культуры клеток 59
-
Методы определения производных параметров роста 60
-
Химический анализ содержание гинзенозидов в 61
биомассе культуры клеток женьшеня
Результаты и обсуждение
ГлаваЗ. Влияние начальной плотности на ростовые и 63
биосинтетические характеристики суспензионной
культуры клеток P. japonicus var.repens
3.1 Ростовые характеристики суспензионной культуры 63
клеток P. japonicus var. repens при выращивании с
разной начальной плотностью.
3.2. Накопление тритерпеновых гликозидов в клетках 66
женьшеня ползучего in vitro, выращиваемых при
разной начальной плотности суспензии
Глава 4. Влияние углеводного состава среды на ростовые и 69
биосинтетические характеристики суспензионной
культуры клеток P. japonicus var.repens
4.1. Ростовые характеристики суспензионной культуры 69
клеток Рjaponicus var. repens при выращивании на
средах с разным содержанием сахарозы
4.2 Накопление тритерпенових гликозидов в 73
суспензионной культуре клеток P.japonicus при
выращивании в средах с разным содержанием
сахарозы.
Глава 5. Изучение влияния метилжасмоната на ростовые и 7
биосинтетические характеристики суспензионной 5
культуры клеток P. japonicus vox.repens при
выращивании клеток в колбах на качалке.
5.1. Ростовые характеристики суспензионной культуры 76
P.japonicus var. repens при добавлении разных доз
метилжасмоната.
5.2 Накопление тритерпеновых гликозидов в 77
суспензионной культуре клеток P.japonicus var.
repens в колбах на качалке при внесении разных доз
метилжасмоната
Глава 6. Исследование влияния фитогормонов на ростовые и 80
биосинтетические характеристики суспензионной
культуры P.japonicus var. repens.
6.1. Ростовые характеристики суспензионной культуры 80
P.japonicus var. repens при выращивании на средах с
разным содержанием ауксинов в колбах на качалке.
6.2. Накопление тритерпеновых гликозидов в 84
суспензионной культуре клеток P.japonicus var.
repens на средах с разным содержанием ауксинов при выращивании в колбах на качалке.
6.3. Ростовые характеристики культуры клеток 85
P.japonicus var. repens при выращивании на средах с
разным содержанием ауксинов в биореакторе.
6.4. Накопление тритерпеновых гликозидов при 90
выращивании культуры клеток P.japonicus var.
repens на средах с различным содержанием ауксинов в биореакторе.
6.5. Ростовые характеристики суспензионной культуры 96
клеток P.japonicus var. repens на средах с разным содержанием ауксинов в режиме полупротока.
6.6. Накопление тритерпеновых гликозидов в 99
суспензионной культуре P.japonicus var. repens при выращивании на средах с разным содержанием
ауксинов в режиме полупротока.
Глава 7. Выращивание суспензионной культуры клеток 103
P.japonicus var.repens в режиме проточного культивирования (хемостата)
7.1. Ростовые характеристики суспензионной культуры 104
клеток P.japonicus var.repens при выращивании в
режиме протока (хемостата).
7.2. Накопление тритерпеновых гликозидов в 106
суспензионной культуре клеток P.japonicus var.
repens при выращивании в режиме протока
(хемостата)
Заключение ПО
Выводы 112
Список литературы 113
Введение к работе
Актуальность темы. Культура клеток высших растений может служить удобным объектом для изучения ряда физиологических и биохимических проблем, быть моделью для изучения закономерностей роста и развития растительной клетки. В условиях in vitro растительные клетки, выйдя из под контроля организма, формируют уникальную биологическую систему -популяцию соматических клеток. Это позволяет производить на их основе уникальные исследования, детально изучать механизмы роста и развития популяции, первичного и вторичного метаболизма растительной клетки. Наиболее перспективным представляется исследование вторичного метаболизма в клетках высших растений in vitro. Это может быть использовано в качестве нетрадиционного подхода к решению одной из фундаментальных проблем физиологии растений - функциональной значимости вторичных метаболитов в жизнедеятельности клетки и целого организма.
Помимо использования в фундаментальных исследованиях, культура клеток высших растений является универсальным инструментом, с помощью которого можно решать многие практические задачи. В частности, растительные клетки in vitro могут служить источником ценных веществ растительного происхождения
В настоящее время в мире наблюдается тенденция к широкому использованию лекарственных средств, полученных на основе растительного сырья. Особый интерес уделяется препаратам, направленным на усиление защитных свойств организма и повышение иммунитета, обладающими адаптогенными свойствами. Из всего растительного разнообразия растения рода Рапса (женьшень) являются, пожалуй, самыми знаменитыми лекарственными растениями, обладающими подобными свойствами. Женьшень на протяжении веков пользовался легендарной славой панацеи, т.е. всеисцеляющего средства, и в результате разноплановых исследований многие ожидания, связанные с его лекарственными свойствами, подтвердились. Однако, усиление интереса к препаратам, созданным на основе женьшеня, привело к печальным последствиям экологического плана - невосполнимому уничтожению этих реликтовых растений. Например, в Дальневосточном крае нашей страны практически полностью уничтожены дикорастущие формы женьшеня настоящего, причем учитывая биологию его развития, потери действительно невосполнимы.
Растения рода женьшень содержат разнообразные биологически-активные соединения, обуславливающие их лекарственные свойства. Однако уникальными и наиболее интересными из них являются тетрациклические тритерпеновые гликозиды даммаранового ряда - гинзенозиды (панаксизиды). Эти ценные вторичные метаболиты, имеющие высокую биологическую активность. На сегодняшний день открыто более пятидесяти гинзенозидов, ведутся работы по выявлению механизма их действия на человеческий организм. Наибольшее внимание исследователей привлекает в первую очередь гликозиды, полученные из женьшеня настоящего - P.ginseng, т.к. он является традиционным лекарственным растением восточных народов. Однако существуют другие представители рода Panax, использование которых в качестве продуцентов полезных веществ весьма перспективно. К таким растениям можно отнести женьшень ползучий P. japonicus var repens, который многие авторы рассматривают как подвид Panax japonicus -эндемичный вид, произрастающий на Дальнем Востоке нашей страны. Состав гинзенозидов данного вида женьшеня необычен, в нем преобладают гликозиды с олеаноловой кислотой в качестве агликона (чикусетсу-гинзенозиды).
Суспензионная культура клеток данного вида предоставляет возможность исследовать не только закономерности роста, но и особенности биосинтеза тритерпеновых гликозидов при различных способах и методах культивирования. Она может служить моделью для изучения изменения содержания гинзенозидов в зависимости от состава питательных сред, добавления элиситоров, использования биореакторов разных объемов, использования различных режимов культивирования и т.д. Получение тритерпеновых гликозидов с помощью культуры клеток P. japonicus var repens имеет большую практическую и теоретическую ценность.
Цель работы заключалась в изучении закономерностей процесса роста суспензионной культуры клеток Panax japonicus var. repens и особенностей биосинтеза клетками in vitro тритерпеновых гликозидов при различных способах и режимах выращивания культуры.
Исходя из цели, были поставлены следующие задачи исследования:
Изучить качественный и количественный состав тритерпеновых гликозидов в суспензионной культуре клеток Panax japonicus var .repens;
Изучить влияние различных факторов культивирования (начальная плотность культуры, фитогормональный состав среды, содержание углеводов в среде, добавление элиситора метилжасмоната) на ростовые характеристики культуры и синтез тритерпеновых гликозидов;
Изучить влияние различных способов культивирования (в колбах, в биореакторах различной конструкции и объема) на рост культуры и биосинтез гинзенозидов;
4. Изучить влияние различных режимов культивирования (периодический, полупроточный и проточный) на ростовые и биосинтетические показатели культуры.
Научная новизна.
Впервые проведено комплексное исследование ростовых и биосинтетических характеристик суспензионной культуры клеток женьшеня ползучего Panax japonicus var. repens. Изучено влияние различных факторов культивирования (начальная плотность культуры, состав и количество в среде фитогормонов, сахарозы, метилжасмоната) на рост культуры и накопление в клетках гинзенозидов. Впервые осуществлено полупроточное и проточное выращивание культуры клеток Panax japonicus var. repens в биореакторах и показаны высокие ростовые и биосинтетические характеристики культуры при выращивании в этих режимах.
Практическое значение работы.
В результате проведенных исследований полученные данные о возможности выращивания данного штамма в биореакторах, объем которых может быть в дальнейшем доведен до полупромышленных и промышленных величин. Изучена возможность выращивания культуры в режимах, отличных от периодического - полупроточном и проточном. Предложены пути повышения биосинтеза тритерпеновых гликозидов в биомассе с помощью изменений фитогормонального состава питательных сред и добавления элиситора метилжасмоната.
На защиту выносится -Ростовые характеристики культуры при разных способах выращивания культуры; -Результаты анализа содержания тритерпеновых гликозидов при разных способах выращивания культуры.
Работа выполнена в Отделе биологии клетки и биотехнологии Института физиологии растений РАН в лаборатории физиологии культивируемых клеток.
