Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА І.Обзор литературы 11
1.1 .Сохранение биологического разнообразия растений методами биотехнологии 11
1.2. Факторы, влияющие на процессы регенерации в культуре изолированных клеток, тканей и органов растений 18
1.3. Модели регенерации растений в культуре in vitro 29
1.4. Основные этапы микроразмножения растений 45
ГЛАВА 2.Материал и методы исследования 61
ГЛАВА 3. Культура изолированных тканей редких и исчезающих видов растений 71
3.1. Adonis vernalis 71
3.2. Brachanthemum baranovii 76
3.3. Dendranthema sinuatum 90
3.4. Представители рода Fritillaria 100
3.5. Rhododendron ledebourii 104
ГЛАВА 4. Культура изолированных тканей уникальных форм и сортов растений 112
4.1. Actinidia chinensis 112
4.2. Allium сера 118
4.3. Begonia rex 127
4.4. Camellia sinensis 133
4.5. Представители рода Cerasus 147
4.6. Представитель рода Clematis 151
4.7. Daucus sativus 157
4.8. Представители рода Fragaria 166
4.9. Представители рода Grossularia 172
4.10. Представитель рода Hemerocallis 179
4.11. Представители рода Iris 182
4.12. Представители рода Malus 193
4.13. Представители рода Primula 202
4.14. Stevia rebaudiana 212
ГЛАВА 5. Адаптация растении-регенерантов к условиям выращивания ex vitro 218
ГЛАВА 6. Включение биотехнологических методов в систему сохранения и воспроизводства растительных ресурсов 233
6.1. Коллекции растений in vitro 233
6.2. Изучение регенерантов 238
6.3. Экономические аспекты применения методов биотехнологии 249
Выводы 260
Список литературы 264
- Факторы, влияющие на процессы регенерации в культуре изолированных клеток, тканей и органов растений
- Основные этапы микроразмножения растений
- Представители рода Fritillaria
- Адаптация растении-регенерантов к условиям выращивания ex vitro
Введение к работе
Актуальность проблемы. Сохранение биологического разнообразия -одна из важнейших задач в деле охраны природы, которой уделяют большое внимание во всем мире. Связано это с ограниченностью необходимых для существования человека биологических ресурсов и угрозой их истощения. С начала XX века исчезновение сортов, видов и даже родов происходит по экспоненте (Драгавцев, 1995; Коропачинский, 1997). Особую актуальность имеют исследования по разработке методов сохранения растений, ареалы и численность которых резко снижается, а также для уникальных форм, расширяющих и улучшающих сортимент возделываемых растений. Стратегия сохранения биологического разнообразия заключается в сохранении его in situ и ex situ. Наряду с традиционными способами сохранения растений ex situ все большее значение приобретает использование для этих целей культуры изолированных тканей и органов (Камелин, 1997).
Привлечение методов биотехнологии, базирующихся на культивировании изолированных органов, тканей и клеток растений для решения проблем сохранения биологического разнообразия имеет преимущества перед традиционно используемыми подходами. Методы биотехнологии позволяют получать оздоровленный материал от пораженных вирусными и грибными болезнями растений, а также материал, свободный от нематод; осуществлять быстрое размножение ценного экземпляра растения; получать в больших количествах вегетативное потомство трудно размножаемых в обычных условиях видов и форм растений; работать в лабораторных условиях круглый год и планировать выпуск растений к определенному сроку; размножать растения без вывода их из ювенильной фазы; длительно хранить пробирочные растения и создавать «банк» ценных форм (Высоцкий, 1986).
Однако широкому использованию биотехнологий для многих видов и даже сортов растений препятствует то, что морфогенетический потенциал и регенерационная способность культивируемых тканей часто строго зависят от генотипа и условий культивирования. Отсутствие надежных способов адаптации регенерантов к условиям ex vitro приводит к значительной потере регенерантов и, в некоторых случаях, существенно снижает возможности использования биотехнологических методов, как для сохранения биологического разнообразия, так и для производства высококачественного посадочного материала ценных растений.
Следует отметить, что исследования в области культуры ткани для решения проблем сохранения генофонда растений имеют свои особенности. Довольно часто они связаны с отсутствием возможности свободного выбора объекта, а также дефицитом исходного материала нужного растения. Это, безусловно, оказывает влияние на постановку задач исследований, и, в некоторых случаях, позволяет решить их только эмпирическим путем.
Цель и задачи исследований. Основная цель исследований заключалась в разработке и совершенствовании методов культуры изолированных тканей растений для использования в системе сохранения и воспроизводства растительных ресурсов.
В соответствии с поставленной целью в задачи исследования входило:
- изучить влияние регуляторов роста на регенерационные процессы на стадиях собственно размножения и укоренения;
- выявить роль типа экспланта и его видовой принадлежности в процессах регенерации растений в культуре in vitro;
- определить модель регенерации, обеспечивающую наиболее высокую эффективность микроразмножения для конкретных видов растений;
- установить влияние продолжительности культивирования изолированных тканей на их регенерационную способность;
- усовершенствовать технику и приемы адаптации растений-регенерантов к условиям выращивания ex vitro;
- определить место методов биотехнологии в стратегии мероприятий сохранения биологического разнообразия растений ex situ. Научная новизна. Впервые изучен морфогенетический потенциал и предложены способы сохранения генофонда для редких и исчезающих видов флоры Алтая. В результате детального изучения процессов регенерации впервые разработаны эффективные способы микроразмножения для ряда уникальных новых форм и сортов растений, полученных или интродуцированных во ВНПОЧСК и ЧП (Грузия), в НИИ садоводства Сибири им. М.А.Лисавенко, в Южно-сибирском ботаническом саду Алтайского государственного университета. Показана целесообразность подбора основных питательных сред и регуляторов роста на каждом этапе микроразмножения. Усовершенствованы конкретные приемы адаптации регенерантов к условиям ех vitro с использованием гидропонных установок и впервые продемонстрирована их высокая эффективность для многих видов растений.
Эффективность использования методов биотехнологии в стратегии мероприятий сохранения биологического разнообразия связана с сокращением сроков получения необходимого количества растений за счет высокого коэффициента размножения в культуре in vitro, с сокращением используемых площадей под коллекциями, а также с возможностью более ранней комплексной оценки новых форм по хозяйственно-полезным признакам за счет ускорения роста и развития регенерантов в условиях открытого грунта.
На защиту выносятся следующие положения:
1. Сохранение биоразнообразия редких, исчезающих видов представителей родов Adonis, Brachanthemum, Dendranthema, Fritillaria, Rhododendron, а также уникальных форм и сортов растений представителей родов Actinidia, Allium, Begonia, Camellia, Cerasus, Clematis, Daucus, Iris, Fragaria, Grossularia, Hemerocallis, Malus, Primula, Stevia, характеризующихся низкой способностью к воспроизводству в естественных условиях произрастания и/или при традиционных способах их размножения, достигается путем использования биотехнологических методов.
2. Повышение эффективности регенерационных процессов в культуре изолированных клеток, тканей и органов достигается за счет подбора (минеральный состав) и модификации (регуляторы роста) питательной среды для культивирования в зависимости от вида, формы или сорта растения.
3. Эффективность методов биотехнологии в системе сохранения биоразнообразия и воспроизводства растительных ресурсов обеспечивается двухэтапным приемом адаптации регенерантов к условиям выращивания ex vitro на гидропонных установках «Минивит».
Практическая значимость. Для конкретных видов растений разработаны и усовершенствованы следующие методы регенерации in vitro:
- для Iris hybrida - метод эмбриокультуры;
- для сортов и форм Camellia sinensis, гибридов рода Malus - методы регенерации растений в культуре изолированных тканей семядолей;
- для Actinidia chinensis, гибрида №1 Primula х polyantha, Brachanthemum baranovii, Dendranthema sinuatum, Daucus sativus - методы регенерации в культуре каллуса от листьев, Allium сера - в культуре каллуса от завязей, а для трех видов рода Iris (I. ensata, I. sibirica, I. hybrida) - в культуре каллуса от лепестков венчика цветка;
- для Begonia rex - методы прямой регенерации в культуре изолированных эксплантов листьев и эксплантов чешуи луковиц для двух видов рода Fritillaria (F.meleagris и F.verticillata);
- для Actinidia chinensis, двух форм рода Grossularia, гибридов рода Cerasus, гибридов и сортов рода Fragaria, двух видов рода Primula (P. polyantha и Р. prugonicenses), Rhododendron ledebourii, представителя рода Clematis (сорт Мефистофель), представителя рода Hemerocallis (сорт Алан), Brachanthemum baranovii, Dendranthema sinuatum, Adonis vernalis и Stevia rebaudiana - методы регенерации путем активации пролиферации существующих меристем.
На основе указанных моделей регенерации разработаны эффективные технологии микроразмножения для названных видов, форм и сортов растений, усовершенствована технология адаптации растений-регенерантов к условиям выращивания ex vitro. Результаты проведенных исследований являются основой для создания коллекций in vitro, сохранения биоразнообразия растений и их ускоренного воспроизводства.
Разработан способ регенерации in vitro, обеспечивающий ускоренное получение большого числа растений Camellia sinensis (А.с. № 1621825 от 23.01. 1991). С применением технологии микроразмножения получен сорт Р. polyantha - Весеня (А.с. № 35188 от 6.02.2001).
Результаты законченных исследований положены в основу методических указаний «Методы получения и ранняя диагностика гибридного потомства / Allium сера L.» (2001) и «Регенерация, размножение in vitro и интродукция эндемиков флоры Алтая: Brachanthemum baranovii (Krasch. et Poljak) Krasch. и Dendranthema sinuatum (Ledeb.) Tzvel.» (2004), изложены в монографии . «Методы биотехнологии в селекции, размножении и сохранении генофонда растений» (2004).
В отделе биотехнологии растений ЮСБС АлтГУ создана живая коллекция различных видов растений, включающая представителей редких и исчезающих видов, а также уникальных форм и ценных сортов хозяйственно-важных растений.
Культивируемые in vitro ткани некоторых видов растений активно используются в учебном процессе в качестве модельных систем для изучения физиологических процессов, протекающих в растительных клетках.
Апробация работы. Результаты исследований докладывались и обсуждались на ежегодных заседаниях ученого совета ВНПОЧСК и ЧП (Грузия) (1983 - 1994), Южно-сибирского ботанического сада АлтГУ (1995 -- 2004 гг.) и v НИИ им. М.А.Лисавенко (1997 - 2004 гг.), на Всесоюзной конференции молодых ученых и специалистов (Махарадзе-Анасеули, 1985), международных научных и научно-практических конференциях: «Биология культивируемых клеток и биотехнология» (Новосибирск, 1988), "Биология клеток растений in vitro, биотехнология и сохранение генофонда" (Москва, 1997), «Современные проблемы научных исследований и развития садоводства, субтропического растениеводства и цветоводства» (Сочи, 1998), «Проблемы стабилизации и развития сельскохозяйственного производства Сибири, Монголии и Казахстана в XXI веке» (Новосибирск, 1999), «Проблемы охраны растительного мира Сибири» (Новосибирск, 2001), «Биотехнология на рубеже двух тысячелетий» (Саранск, 2001), «Биология клеток растений in vitro и биотехнология» (Саратов, 2003), а также на региональной научно-практической конференции «Научно экономические проблемы регионального садоводства» (Барнаул, 2002), на XI съезде Русского ботанического общества «Ботанические исследования в азиатской России» (Новосибирск - Барнаул, 2003) и на научной сессии СО РАСХН, посвященной 35-летию образования СО РАСХН «Сельскохозяйственная наука - агропромышленному комплексу Сибири» (Новосибирск, 2004).
Публикации результатов исследований. Основные положения диссертационной работы опубликованы в 37 печатных работах, в т.ч. в 2 методических рекомендациях, 2 авторских свидетельствах и монографии.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 325 стр., состоит из введения, 6 глав, выводов, содержит 55 рисунков и 69 таблиц. Список литературы включает 583 наименования, в том числе 306 на иностранных языках.
Факторы, влияющие на процессы регенерации в культуре изолированных клеток, тканей и органов растений
Регенерация (лат. regeneratio - восстановление, возрождение) -восстановление организмом поврежденных или утраченных частей тела. В основе любого регенерационного процесса многоклеточного растения лежит образование клеток эмбрионального типа, делящихся митотически, из которых формируется один или несколько недостающих органов и восстанавливается целостность растительного организма (Кефели, 1984; Полевой, Саламатова. 1991).
Необходимо отметить, что даже из одной вегетативной клетки любого органа в экспериментальных условиях можно восстановить целый организм. В этом проявляется свойство тотипотентности растительных клеток (лат. totus -весь, целый и potentia - сила), то есть способности полностью реализовать генетическую программу развития с образованием целого организма, является одной из примечательных особенностей культивируемых клеток растений. В основе тотипетентности клеток растений лежит присущая всем клеткам высших организмов омнипотентность ядра, то есть полное сохранение свойственной зиготе генетической программы всеми клетками организма, и кроме того, в отличие от клеток высших животных, отсутствие строгого запрета к повторной экспрессии генов. Последнее позволяет надеяться индуцировать активность тех генов, которые отвечают за переход в меристематическое состояние с последующей дифференцировкой стеблевого или корневого апексов, или эмбриогенной структуры (Бутенко, 1964).
Для успешной регенерации целых растений в культуре изолированных клеток, тканей и органов, необходимо учитывать ряд факторов, в том числе, происхождение экспланта, состав питательной среды и физические условия культивирования.
Эксплант - фрагмент ткани или органа, инкубируемый самостоятельно или используемый для получения первичного каллуса (Чайлахян и др., 1982). Выбор экспланта в работе по регенерации играет решающую роль. Прежде всего, эксплант должен содержать меристемоидные клетки, или клетки, способные превращаться в меристемоидные. Такие клетки чаще всего локализованы в специальных тканях или органах.
Так, в апикальных и латеральных почках имеются меристемы, обладающие высоким морфогенетическим потенциалом. Они используются для размножения многих растений, как травянистых, например, Rhodiola rosea (Кафтан и др., 1988), Indica rice (Sanduhu et al.,1995), эндемичного растения Индии Trichopus zeylanicus (Krishnan et al., 1995), лекарственного растения Tridax procumbens (Sahoo et al.,1996), Colocasia esculenta (Chand et al.,1998), так и древесных, например, Prunus domestica (Neskovic, 1985), Vitis vinifera (Diaz et al., 1999), Diospyros kaki (Chamhum et al., 1999). Использование апикальных или латеральных меристем позволяет получать генетические копии растений, то есть клонировать их.
Часто в качестве эксплантов, особенно для индукции каллусных культур, используют фрагменты листа. Выбор листьев связан с тем, что они, во-первых, обладают высоким морфогенетическим потенциалом, а во-вторых, у исследователей появляется возможность использовать растения, находящиеся на любой стадии развития. Имеются сообщения о регенерации представителей как травянистых, так и древесных видов растений в каллусе, индуцированном от листьев путем стеблевого органогенеза или соматического эмбриоидогенеза: Gossypium hyrsutum (Hirimburegama, Gamage, 1994), Phlox drummondii (Li et al., 1996), Psophocarpus tetragonolobus (Rina A. et al.,1996), Sterculia urens (Purohit, Dave, 1996), Fragaria ananassa (Takahiro, 2002), Acacia sinuate (Vengadesan et al., 2002). Регенерировать растения из листьев можно без каллусогенеза: прямым путем, как например, у Begonia х tuberhybrida (Peck, Comming, 1984), Pyrus communis (Лебедев и др., 1999).
Высоким морфогенетическим потенциалом обладают ткани луковиц у ксинофитума, нарциссов, тюльпанов (Выхристова, Смирнова, 1981), нуцеллус у цитрусовых (Das et al., 2000), ткани семядолей, например, у плодовых (Rubos, Pryke, 1984; Наош et al.,2000), участки корней у Clerodendrum viscosum (Prasad et al., 1984) и Psordea corylifolia (Suresh, Kumar, 2002).
Однако есть и такие экспланты, которые используется редко - это часть цветка - лепестки. В тех случаях, когда удается индуцировать нормальные процессы морфогенеза в культуре изолированных лепестков, использование их имеет ряд преимуществ перед другими типами эксплантов. Во-первых, упрощается метод стерилизации исходного растительного материала; во-вторых, появляется возможность размножения лучшего и/или единственного гибрида уже оцененного и отобранного по декоративности цветка; в-третьих, полностью исключается возможность повреждения уникального растения-донора экспланта. Примерами растений, у которых изолированные ткани лепестков обладают высокой регенерационной способностью, являются растения рода Rosa (Berardi, 1989), Dianthus (Fisher et al., 1993; Masaru et al.,1994), Crocus (Чуб и др.,1994).
У одного и того же растения различные экспланты проявляют разную способность к регенерации. Например, при изучении регенерационной способности каллуса, индуцированного от трех типов эксплантов (фрагменты семядолей, эпикотиль и апекс побега) у Cercospora canescens, было установлено, что частота и интенсивность регенерационных процессов была выше у каллусов из апексов (Kaushal et al., 1997).
Для каждого типа экспланта существует свой критический размер, который существенно уменьшает степень пролиферации клеток и отражается на регенерации. Это особенно важно учитывать при работе с культурой изолированных зародышей, когда разрабатываются высокоэффективные системы регенерации. В культуре незрелых зародышей размер экспланта является одним из главных факторов (Deng, Wei, 2000).
В зависимости от вида растения должны быть учтены сроки изоляции эксплантов и фаза развития растения-донора эксплантов. Ряд авторов сообщает, что экспланты двух видов рода Dioscorea (Asokan et al., 1983), трех промышленных сортов Gladiolus (Dantu, Bhojwani, 1987) изолировали во время хранения, то есть в фазу покоя и такие экспланты обладали повышенной регенерационной способностью. У нескольких сортов рода Rhododendron при оценке пригодности цветочных почек для размножения было установлено, что максимальная регенерационная способность у них также проявляется при изоляции в период покоя растений (Pavingerova et al., 2000). Однако большинство растений лучше поддается переводу в культуру in vitro в фазу активного роста. Поэтому часто в качестве доноров-эксплантов используют различные части активно растущих проростков (Zhou et al., 1993, Спасеноски, Колева, 1995, Wingender et. al., 1996; Fiore et al., 1997), а для большинства древесных растений - апексы, изолированные от активно растущих побегов (Bondok et al., 1986; Founda et al., 1994).
Основные этапы микроразмножения растений
Термин «микроразмножение», впервые использованный в 1968 году Хартманном и Кестером, оказался широко распространенным и принятым для данной технологии. Но как и все термины, в процессе развития он также пришел к своему специальному значению, которое сформулировано в обзорной статье английского ученого А.Д. Крикориана «Клонирование высших растений из асептически культивируемых тканей и клеток» и до сих пор наиболее полно отражает его суть. Под микроразмножением обычно понимают какую-либо асептическую процедуру, включающую манипуляции растительными органами, тканями или клетками, результатом которой являются многочисленные растения, и которая позволяет миновать обычный половой процесс или существующие традиционные способы вегетативного размножения. Подразумевают, что при клональном микроразмножении каждое полученное растение фенотипически и генотипически идентично растению, из которого оно произошло (Krikorian, 1982).
Традиционно растения размножают семенами или вегетативным способом, который является трудоемким процессом, требующим много времени. Поэтому в последние годы возрос интерес к использованию методов культуры тканей для размножения растений. Первоначально этот метод был разработан для травянистых растений, а в последующем применен и к древесным, для которых он оказался даже более важным, чем для травянистых растений. В 80-е годы началось интенсивное применение новой технологии для древесных растений. Успех применения новой технологии во многом зависел от ряда требований, которым должны были удовлетворять применяемые тканевые культуры к вегетативному размножению. Сутью первого требования является высокая способность систем к органогенезу или эмбриоидогенезу. Конечным продуктом системы должны быть растения или зрелые эмбриоиды; второго - закаливание и способность к переносу и выживанию их в полевых условиях; третьего - использование культуры тканей должно сочетаться или иметь преимущества перед существующей системой размножения (Sommer, 1983).
Мурасиге (Murashige, 1974; 1976) выделил три этапа, или три стадии микроразмножения: I - введение в культуру in vitro эксплантов; II -собственно размножение; III - укоренение и подготовка к пересадке в почву. Самым критическим моментом из всех этапов микроразмножения оказалась процедура переноса укорененных растений-регенерантов в нестерильные условия выращивания, поэтому позже был выделен IV этап микроразмножения как самостоятельный: этап (стадия) адаптации полученных растений-регенерантов к условиям выращивания их in vivo (Anderson, 1980). Введение в культуру in vitro эксплантов Целью первой стадии микроразмножения растений является достижение длительного выживания свободных от инфекции растительных эксплантов. В виду того, что поверхность растительных тканей сильно загрязнена разнообразной бактериальной и грибной микрофлорой, а питательная среда является отличным субстратом для ее развития, требуется процедура поверхностной стерилизации растительного материала. Для стерилизации используют различные стерилизующие вещества. Однако всегда придерживаются принципа, по которому следует выбирать наиболее пригодный стерилизующий раствор. Принцип прост: вещество должно обеспечивать большой процент неповрежденных тканей, способных к росту и новообразованиям, при наименьшем проценте инфекции. Этого принципа следует придерживаться и при выборе длительности стерилизации, то есть экспозиции (Бутенко, 1971).
Для поверхностной стерилизации растительных тканей используют различные хлорсодержащие соединения: хлорамин Б, гипохлориты натрия, калия, кальция. Препараты, содержащие активный хлор, обладают бактерицидным эффектом для широкого круга микроорганизмов как грамположительных, так и грамотрицательных микроорганизмов. Поэтому в некоторых случаях достаточным оказывается применение только растворов определенной концентрации названных препаратов для получения свободного от инфекции растительного материала. Например, использование NaOCl (7%) было эффективно при стерилизации семян Fagopyrum esculentum (Гумерова и др., 2003) и ТгШсит (2%) (Копертех, Стрибная, 2003), цветочных почек Rhododendron (5%) (Pavingerova et al., 2000). Однако иногда хлорсодержащие вещества применяют в комбинации с другими дезинфицирующими средствами. Семена томата, например, перед стерилизацией в 5 - 9% растворе Са(ОС1)2 предварительно выдерживали 2 минуты в 2% растворе КМпС 4 (Внучкова, 1977), а семена сорго перед стерилизацией в хлорамине (7%) предварительно погружали на 30 с в 70% этиловый спирт (Цаценко, 1999).
В качестве стерилизующих агентов используются соли тяжелых металлов. Известно, что поверхностные структуры живой микробной клетки заряжены, как правило, отрицательно, а ионы металлов - положительно, что может быть одной из причин происходящей адсорбции на поверхности клетки ионов металлов. Внутрь клетки ионы металлов поступают путем различного транспорта. Даже в малых концентрациях они действуют как сильные ферментативные яды, нарушая и изменяя метаболизм клетки. Из металлов наиболее токсичными являются ртуть и серебро. Для них ингибирующее влияние на жизнеспособность микроорганизмов наблюдается в диапазонах концентраций 10" - 10" М (Сенцова, Максимов, 1985).
Для стерилизации растительного материала часто в качестве стерилизующего вещества используют сулему (HgC ), которая была эффективна при введении в культуру in vitro апикальных почек Rosa dameascena (0.1%) (Kornova et al.,2000), семян Capsicum annuum (0.1%) (Mythili et al.,2001), бутонов Daucus carota (0.5%) (Тюкавин и др., 1999).
Представители рода Fritillaria
Стебли в нижней части искривленные, твердые и деревянистые со светло-коричневой корой. Однолетние побеги многочисленные, раскинутые, восходящие и прямостоящие. Все растение, включая и одревесневшую часть, густо покрыто листвой. Листорасположение очередное. Листья сверху тускло-зеленые, голые или слегка волосистые с заметными точечными железками. Снизу - беловатые от войлочного опушения. Прикорневые и нижнестеблевые листья на длинных черешках, перисто-раздельные или перисто-рассеченные.
Корзинки цветков ромашковидные 3 - 5 см в диаметре, розоватые с оттенком сиреневого, фиолетового, белого, нередко яркого тона. Центр их золотисто-желтый за счет трубчатых цветков. Корзинки расположены по одной на верхушке однолетнего стебля и его облиственных боковых ветвей (Коропачинский, 1983; Редкие и исчезающие виды..., 1989; Флора Сибири, 1997).
D. sinuatum обитает в горно-степном и гольцовом поясах гор по скалам и осыпям, каменистым склонам, реже в зарослях кустарничков на высоте от 600 (500) до 2400 (1400) м над уровнем моря (Соболевская, 1984; Красная книга РСФСР, 1988). Цветет в августе - сентябре. Размножается семенами, которые начинают вызревать с конца августа. Плодоношение в природе наблюдается лишь в годы с поздними осенними заморозками, при этом семена полностью не вызревают (Коропачинский, 1983). Этот вид занесен в Красные книги (Красная книга РСФСР, 1988; Красная книга республики Алтай,1996) и имеет статус уязвимого вида.
Первые опыты культуры D. sinuatum не давали положительных результатов. В ЦСБС растения, привезенные с Алтая, приживались, перезимовывали, но на следующий год погибали. Точно также вид вел и при интродукции в Полярно-Альпийский ботанический сад. Причем здесь D. sinuatum была высеяна семенами, привезенными с мест естественного произрастания растений (Соболевская, 1984). В Омске интродукция этого растения потребовала многократных повторений. В данных условиях растение плодоносило, хотя семена вызревали не каждый год. В Барнауле культивирование вида осуществлялось с 1955 г. В 1983 г. местная экспозиция составляла 20 экземпляров. Цикл сезонного развития в условиях культуры завершался плодоношением. При обилии снега интродуценты выпревали (Редкие и исчезающие виды..., 1983).
Более поздние опыты по первичной интродукции вида в ЦСБС также показали, что он является малоперспективным для выращивания в культуре (Семенова, 1997). Однако D. sinuatum успешно выращивается в Алтайском ботаническом саду (г. Лениногорск), НИИ садоводства Сибири и ЮСБС (г.Барнаул). Для этого потребовалось создание условий, соответствующих экологическим требованиям. Растения этого вида развиваются и обильно цветут на сухих малоснежных каменистых местах с промерзающей почвой. В Горно-Алтайске, по данным З.И.Лучник, растения выпревали в годы, когда почва оставалась талой в течение всей зимы. Особенно страдали одно-, двулетние сеянцы (Лучник, 1951).
Длительное и эффективное цветение в поздний осенний период делает D. sinuatum ценным декоративным растением. Оно неприхотливо, в высокой степени морозоустойчиво, приспособлено для озеленения сухих каменистых участков. При использовании в садах и парках оно может служить для украшения каменистых горок и откосов (Крашенинников, 1949; Верещагина, 1996).
Ограниченность способов размножения (только семенное при нерегулярном вызревании семян), выпревание сеянцев, а также узкая стенотопность вида сильно затрудняют сохранение D. sinuatum традициоными методами (Соболевская, 1984; Верещегина, 1996). Альтернативным способом сохранения этого вида может стать использование методов клонального микроразмножения растений в условиях in vitro, которые позволяют получать нужное количество растений в короткие сроки без ущерба для природных популяций (Соловьева и др., 2003). Культура пазушных почек
В качестве исходного материала для введения этого растения в культуру in vitro использовали проростки, выращенные в стерильных условиях на питательной среде В5) дополненной 1 мкМ БАП и 1 мкМ ПС. Эффективность введения в культуру in vitro составила около 80%. Через два месяца у проростков появились два первых настоящих листа. У них удалили корешки, и пересаживали на свежую питательную среду В5 с 0.5 мкМ БАП. На этой среде к концу пассажа у 90% эксплантов регенерировали адвентивные побеги (от 1 до 6 шт./экспл.) высотой 10-15 мм. Эти побеги были использованы в качестве доноров эксплантов (пазушных почек) для изучения их регенерационной способности. Было изучено влияние цитокининов БАП и Кн и их концентраций (0.5 -20 мкМ) на регенерационную способность пазушных почек D. sinuatum in vitro (табл.13).
Полученные результаты показали, что оба цитокинина - БАП и Кн -являлись индукторами регенерации побегов. Однако интенсивность регенерации зависела от используемой концентрации. Так, для получения большего количества нормально развитых побегов необходимо использовать БАП в диапазоне концентраций 0.5 - 5 мкМ, так как на таких питательных средах у одного экспланта в среднем регенерирует от 7 до 9 адвентивных побегов (рис.7).
При использовании Кн такую же интенсивность регенерации удалось получить при введении его в состав среды не менее, чем 5 - 10 мкМ. Превышение указанных концентраций цитокининов (для БАП - более 5 мкМ, а для Кн - более 10 мкМ) отрицательно сказывалось на морфологии регенерирующих побегов: побеги становились короче, приобретали форму розетки с видоизмененными из-за гипергидратации листьями.
Адаптация растении-регенерантов к условиям выращивания ex vitro
Actinidia chinensis Planch, (сем. Actinidiaceae) представляет собой древовидную лиану. В настоящее время сорта, созданные на основе этого вида, получили широкое распространение в странах Западной Европы, США, Японии, Австралии. Некоторые сорта актинидии китайской способны переносить зимы средней полосы России, однако до сих пор эта культура не получила в нашей стране широкого распространения. Работы по актинидии велись в основном ботаническими садами и ВИР им.Н.И.Вавилова (Наумова, 1988). Культурные сорта актинидии китайской могут произрастать на Черноморском побережье Кавказа. Они выдерживают морозы до -9С, в этих районах перспективно проведение селекционной работы, направленной на получение межвидовых гибридов актинидии, что позволит расширить южные границы возделывания этой плодовой культуры.
Необходимо отметить большую трудоемкость и низкий выход посадочного материала при традиционных способах вегетативного размножения. Так, при укоренении зрелых и зеленых черенков в контролируемых условиях с использованием ауксинов, частота их укоренения составила 43.5%, а без применения ауксинов этот показатель был в полтора раза ниже (Radulovich, Plamenak, 1987). При размножении семенами необходимо их стратифицировать, при этом большая часть семян все-таки не прорастает.
Одним из факторов, способствующим сохранению биоразнообразия этого вида и улучшению существующего сортимента, является возможность быстрого размножения ценных форм и гибридов. Имеются положительные примеры использования методов биотехнологии для ускоренного размножения in vitro двух видов Actinidia - A.arguta и A.kolomicta (Высоцкий, 1986). Кроме того, одна из ведущих фирм в Италии по производству посадочного материала актинидии («Dalpane Vivai») около 7% саженцев получает методом in vitro (Наумова, 1988).
Целью наших исследований явилось изучение регенерационной способности изолированных органов и тканей A.chinenesis.
В культуру in vitro вводили семена, извлеченные из зрелых плодов ценной формы, выращенной и отобранной среди интродуцированных во ВНПОЧСК и ЧП (Грузия) сеянцев.
Семена проращивали стерильно на питательной среде В5, дополненной 2.15 мкМ Кн. На две недели культуральные сосуды помещали в темноту, а затем переносили в условия фотопериода. Через месяц появились проростки. Их пересадили на безгормональную среду. К концу пассажа они достигали в высоту 4-5 см. Полученные сеянцы служили источником эксплантов -пазушных почек или фрагментов листьев.
На этапе собственно размножения для индукции развития многочисленных побегов в основании экспланта (микрочеренок с одной пазушной почкой) использовали среду В5с 2.25 -4.5 мкМБАП и 0.2 - 0.4 мкМ НУК. В основании пучков побегов формировалась каллусная масса, в которой развивались меристематические зоны, дающие начало адвентивным побегам. Число побегов, в одном пучке колебалось от 20 до 50 шт. В таких пучках побегов выделялось от 3 до 6 ведущих побегов. Эти побеги можно было использовать на стадии укоренения или для повторного микроречеркования.
Для получения побегов нормальных пропорций, конгломерат полученных побегов переносили на питательную среду В5, дополненную 0.25 мкМ БАЛ, а также 0.4 мкМ ИМК и 3.5 - 7 мкМ ГК. К концу пассажа побеги достигали высоты 2.5 - 4.5 см и были пригодны для укоренения или повторного микрочеренкования. Укоренение побегов проводили на агаризованных питательных средах, содержащих половинный набор минеральных солей по Bs и дополненных ИМК или НУК (табл.19, рис. 14). Как видно из представленных данных, на питательной среде с 2 - 4 мкМ ИМК все побеги укоренялись. На этих питательных средах была сформирована наиболее мощная корневая система. Использование других концентраций ИМК оказалось неэффективно по следующим причинам: - низкая частота укоренения (на среде с 1 или 20 мкМ ИМК); - развитие корней из каллусной массы на базальной части побега (на среде с 10 или 20 мкМ ИМК). Применение НУК оказалось нецелесообразным из-за низкого процента укоренения побегов и развития каллуса на их базальной части. Помимо агаризованных питательных сред, на этапе укоренения были использованы жидкие питательные среды ( В5), дополненные 2-10 мкМ ИМК или НУК, но ни в одном из изученных вариантов не было отмечено корнеобразование. На жидких питательных средах базальные части побегов изгибались и выступали над поверхностью жидкой питательной среды, а через 10-15 суток они погибали (Таварткиладзе и др., 1990). Культура изолированных листьев В качестве эксплантов использовали листья размножаемых в культуре in vitro растений. На листьях делали поперечные надрезы центральной жилки листа и листовой пластинки. Экспланты помещали на питательные среды, дополненные 4 мкМ БАП и 20 мкМ одного из ауксинов (НУК, ИМК, 2,4-Д или АТХП). Экспланты культивировали в условиях темноты. Через 5—10 суток, в зависимости от варианта, наблюдали начало каллусообразования. К концу пассажа во всех вариантах образовался каллус, характеристики которого зависели отвведенного в состав питательнойсреды ауксина. Результаты этого эксперимента представлены в таблице 20.
