Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Трансдукция сигналов в растениях 10
1.1.1. Рецепторы 10
1.1.2. G-белки 15
1.1.3. Протеинкиназы и протеинфосфатазы 16
1.1.4. Факторы транскрипции 18
1.1.5. Генетическая детерминированность взаимоотношений растения и патогена 19
1.2. Сигнальные системы растений 21
1.2.1. МАР-киназная сигнальная система 23
1.2.2. Липоксигеназная сигнальная система 24
1.2.3. Фосфатидатная сигнальная система 25
1.2.4. Кальциевая сигнальная система 26
1.2.5. НАДФН-оксидазная сигнальная система 29
1.2.6. Ж--синтазная сигнальная система 30
1.2.7. Протонная сигнальная система 32
1.3. Аденилатциклазная сигнальная система 33
1.3.1. Аденилатциклаза 34
1.3.2. цАМФ как вторичный мессенджер 41
1.3.3. Фосфодиэстераза цАМФ 45
1.3.4. цАМФ-зависимые протеинкиназы 48
1.3.5. цАМФ-связывающие белки 49
1.3.6. цАМФ-регулируемые ионные каналы 50
1.4. Взаимодействие сигнальных систем 51
1.5. Фитопатогены и их метаболиты 53
1.5.1. Специфические и неспецифические факторы вирулентности 53
1.5.2. Элиситоры и супрессоры фитопатогенов 56
1.6. Clavibactermichiganensissubsp.sepedonicus (cms) 61
1.7. Цель и задачи исследования 64
2. Объекты и методы исследования 66
2.1. Растительный материал 66
2.2. Культивирование бактериальных клеток 67
2.3. Выделение и очистка ЭПС 67
2.4. Метод дифференциального центрифугирования в градиенте сорбита для выделения фракции ядер и хлоропластов 68
2.5. Подготовка образцов для определения активности «растворимой» и трансмембранной АЦ 68
2.6. Приготовление образцов для определения концентрации цАМФ. 69
2.7. Иммуноферментный метод (ИФА) 70
2.8. Приготовление образцов для электронной микроскопии 71
2.9. Метод иммуно-электронной цитохимии для выявления цАМФ с использованием первичных антител против цАМФ (ПАТ) и вторичных антител, меченных золотом (ВАТ) 72
2.10. Метод капиллярного электрофореза для идентификации цАМФ и доказательства отсутствия в растительной пробе других циклических нуклеотидов 73
2.11. Спектроскопия ЯМР для идентификации цАМФ и доказательства отсутствия в растительной пробе других циклических нуклеотидов 76
3. Результаты исследования и их обсуждение 79
3.1. Выявление активности и оптимума рН трансмембранной (плазмалемной) аденилатциклазы. Влияние ЭПС Cms на эти показатели 79
3.2. Выявление активности аденилатциклазы во внутриклеточных компатрментах растений in vitro устойчивого и восприимчивого к Cms сортов картофеля. Влияние на активность данного фермента ЭПС Cms 87
3.2.1. Выявление методом ИФА трансмембранной и «растворимой» форм аденилатциклазы в ядрах и хлоропластах 87
3.2.2. Ультраструктурная иммуноцитохимия 95
3.3. Влияние ЭПС Cms на динамику концентрации внутри- и внеклеточного цАМФ в суспензионных клетках картофеля 109
3.4. Участие цАМФ в развитии системного сигнала под влиянием ЭПС Cms в пробирочных растениях картофеля 114
Заключение 122
Выводы 129
Список литературы 131
- Генетическая детерминированность взаимоотношений растения и патогена
- Специфические и неспецифические факторы вирулентности
- Метод капиллярного электрофореза для идентификации цАМФ и доказательства отсутствия в растительной пробе других циклических нуклеотидов
- Выявление методом ИФА трансмембранной и «растворимой» форм аденилатциклазы в ядрах и хлоропластах
Введение к работе
Возбудители инфекционных заболеваний растений (тысячи видов грибов, сотни видов бактерий и другие фитопаразиты) являются важнейшим биотическим фактором, приводящим к значительным потерям урожая сельскохозяйственных растений. Эта проблема не может не вызвать особый научный и практический интерес у широкого круга специалистов.
Система земледелия в условиях интенсификации сельского хозяйства невозможна без организованной защиты растений. Наиболее эффективна и приемлема с точки зрения охраны окружающей среды интегрированная защита растений, предусматривающая не механическое абсолютное истребление отдельных видов вредных организмов, а направленная на сдерживание их накопления на безопасном уровне с минимальными отрицательным последствиями для окружающей среды.
Для современной защиты растений важно комплексной применение биологических, агротехнических и химических методов. Это не только повышает их эффективность, но и дает возможность снизить уровень использования химических средств защиты.
Высокая эффективность любого способа защиты растений от болезней может быть обеспечена только при глубоком знании процессов, определяющих характер развития болезни. Кроме создания новых сортов растений, обладающих высоким уровнем устойчивости к патогенным микроорганизмам, и поиском новых форм защиты существующих сортов, необходимо детальное изучение фундаментальных основ иммунитета растений, физиологии больного растения, генетики и физиологии патогенов, что позволяет лучше понять взаимоотношения в системе «возбудитель болезни - растение-хозяин».
В процессе эволюции у клеток выработались приспособления, позволяющие воспринимать, преобразовывать и усиливать приходящие из окружающей среды сигналы и с помощью генетического аппарата реагировать на них, перестраивая свой обмен веществ и структуру, и выделять различные летучие и нелетучие соединения во внеклеточное пространство. Одни из них выполняют функции защитных веществ против патогенов, другие могут рассматриваться в качестве сигнальных молекул, вызывающих ответ других клеток, расположенных на большом расстоянии от места действия на растения первичного сигнала [Тарчевский, 2002].
Одной из важнейших проблем современной биологии является расшифровка механизмов реагирования прокариотических и эукариотических организмов на изменение условий их существования, особенно на действие экстремальных факторов, вызывающих у клеток состояние стресса. Необходимо отметить, что общие принципы работы сигнальных систем в значительной степени универсальны. Универсальность ДНК - основного вместилища информации - определяет сходство механизмов ее обслуживания в клетках микроорганизмов, растений и животных. Это касается универсальности структуры, рецепторов, встроенных в клеточные мембраны, ассоциированых с ними G-белков, структуры стартовых ферментов сигнальных систем и ферментов, ответственных за синтез и деградацию небелковых вторичных посредников, структруры протеинкиназ, протеинфосфатаз, факторов регуляции транскрипции, РНК-полимераз, рибосом и обслуживающих их работу белков.
В настоящее время принято считать, что в клетках функционирует восемь сигнальных систем. В силу многих причин изученность этих систем неодинакова. Аденилатциклазная сигнальная система растений является одной из наименее изученных, хотя очевидно, что ее роль в защитных ответах в условиях абиотического и биотического стрессов очень существенна. Например, почти нет данных по участию аденилатциклазной сигнальной системы растений в защитных реакциях от патогенов. В частности, практически отсутствуют работы по изучению функционирования аденилатциклазной сигнальной системы при бактериозах. При контакте растений с бактериальными возбудителями возможна как элиситация, так и супрессия защитных ответов. Как правило, это зависит от регуляции фермента первой реакции в сигнальной системе. В аденилатциклазной сигнальной системе таким ферментом является аденилатциклаза.
Исходя из таких предпосылок, целью данной работы было изучение роли аденилатциклазы в защитных реакциях клеток растений картофеля при бактериальном патогенезе и связь ее активности с устойчивостью сорта к данному патогену.
Список сокращений, используемых в тексте GPCR - (G-protein coupled receptors) - рецепторы, сопряженные с G- белками Cms - Clavibacter michiganensis subsp. sepedonicus
ЭПС - экзополисахариды G-белок - ГТФ-связывающий белок SAR - systemic acquired resistance - системная приобретенная устойчивость LAR - localized acquired resistance - локальная приобретенная утойчивость
ЖАК - жасмоновая кислота
СК - салициловая кислота
Ме-ЖАК - метиловый эфир жасмоновой кислоты
МАР-киназа - митоген активированная протеинкиназа
ФЛС - фосфолипаза С
ФИФ - фосфатидилинозитолбисфосфат
ПК - протеинкиназа цАМФ - 3',5'-циклический аденозинмонофосфат
АЦ - аденилатциклаза мАЦ - мембраносвязанная аденилатциклаза рАЦ - «растворимая» аденилатциклаза цГМФ - циклический гуанозинмонофасфат цЦМФ - циклический цитидинмонофосфат цУМФ - циклический уридинмонофосфат цТМФ - циклический тимидинмонофосфат
ФДЭ - фосфодиэстераза CRE - цАМФ-реактивный элемент HRE - гормон-реактивный элемент CREB - CRE-связывающий белок CRB - CREB-связывающий белок ф.б. - фосфатный буфер
ПАТ \ первичные антитела против цАМФ BAT - вторичные антитела, меченые золотом
ПТБС - буфер для промывки, используемый в ИФА (0.02 М ф.б., рН 7.0 +
0.15 М NaCl + 0.3% Твин-20)
ПБС - ПТБС без Твин-20
Генетическая детерминированность взаимоотношений растения и патогена
В процессе эволюции у клеток растений, так же как и у животных выработались приспособления, позволяющие воспринимать, преобразовывать и усиливать приходящие из окружающей среды сигналы химической и физической природы, и с помощью генетического аппарата реагировать на них, не только адаптируясь к изменившимся условиям, но и выделяя различные летучие и нелетучие соединения во внеклеточное пространство. Одни из них выполняют роль защитных веществ, другие могут рассматриваться в качестве сигнальных молекул, вызывающих ответ других клеток, готовых на большом расстоянии от места действия первичного сигнала.
Первичные сигналы приводят к активации различных внутриклеточных сигнальных систем, которые, в свою очередь, вызывают реакцию со стороны генома клеток, проявляющуюся в перепрограммировании экспрессии генов. По сути дела, сигнальные системы регулируют работу основного вместилища информации - молекул ДНК. С другой стороны, они сами находятся под контролем генома.
В настоящее время интенсивно исследуются МАР-киназная, аденилатциклазная, фосфатидатная, кальциевая, липоксигеназная, НАДФН-оксидазная, NO-синтазная и протонная сигнальные системы растений, а также их роль в онтогенетическом развитии растений и в формировании ответа на изменяющиеся условия существования, на действия различных абиотических и биотических стрессов. Особое внимание уделяется изучению функционирования сигнальных систем клеток растений при различных патогенезах [Тарчевский, 2001].
О существовании межклеточных системных сигналов, оповещающих растительные ткани о грозящей опасности, стало известно в 90-х годах прошлого столетия [Enyedi et al., 1992]. Впервые понятие системной приобретенной устойчивости (systemic acquired resistance - SAR), так же как термин локальная приобретенная устойчивость (localized acquired resistance -LAR) были введены немецким ученым Россом на основании исследования табака, инфицированного вирусом табачной мозаики. SAR развивалась в тканях инфицированного растения, свободных от заражения через 48-72 часа, тогда как локальная - непосредственно в месте инфицирования [Ryals, Uknes, Ward, 1994]. Существуют по крайней мере два параллельных пути передачи межклеточных сигналов. Первый из них связан с молекулами, сигнализирующими о поранении растительной ткани, независимо от того, является ли это поранение механическим или вызвано некротрофными патогенами и вредителями. Сигнальной молекулой этого типа является, например, жасмоновая кислота (ЖАК). Второй тип сигнальных молекул специфичен только для патогенной инфекции - бактериальной, грибной или вирусной. Сигнальной молекулой второго типа является салициловая кислота (СК) Дьяков и др., 2001; Thatcher et al., 2005]. СК хорошо соответствует требованиям к системным сигнальным молекулам: она легко распространяется по сосудам флоэмы, системно возрастает в десятки раз под влиянием патогенов и способна индуцировать у растений некоторые защитные механизмы [Metraux, 2001]. После СК жасмоновая кислота (ЖАК) и ее метиловый эфир (Ме-ЖАК) являются наиболее реальными претендентами на участие в SAR, однако до сих пор не установлено, являются ли они системными сигнальными молекулами, либо внутриклеточными мессенджерами, а возможно, сочетают в себе обе функции [Wasternack, Parthier, 1997]. Содержание ЖАК и Ме-ЖАК увеличивается после механического поранения растительных тканей, а также после обработки элиситорами суспензионной культуры клеток различных видов растений. Ме-ЖАК участвует в передаче раневого сигнала через атмосферу, поскольку является летучим соединением при комнатной температуре. Летучесть Ме-ЖАК наряду с его биологической активностью позволяет предположить, что он, подобно этилену, может осуществлять аллелопатическое взаимодействие между растениями или их органами [Lee, Lobler, 1998].
Митоген-активируемые серин-треонинового типа протеинкиназы (МАРК) и МАР-киназный сигнальный каскад (сигнал — рецептор — G-белки — киназа киназы МАР-киназы (МАРККК) — киназа МАР-киназы (МАРКК) — МАР-киназа (МАРК) — факторы транскрипции — геном), достаточно полно изучены на животных объектах [Zhang, Klessing, 1997; Seger, Crebs, 1995].
МАР-киназное семейство представлено в широком круге организмов, включая животных, Xenopus, Drosophila, дрожжи, Dictyostelium и растения [Kyriakis, Avruch, 1996]. МАР-киназный каскад «включается» при митозе (чем и объясняется название этих протеинкиназ), а также при различных воздействиях окружающей среды (например, при низкой температуре [Jouannik et al., 1999], гипоосмотическом стрессе, механическом раздражении растений, повреждении тканей, действии патогенов) [Тарчевский, 2001]. Зависимость функционирования МАР-киназного каскада от различных воздействий нашла отражение в названиях некоторых МАР-киназ, например, WIPK и SIPK (соответственно «would-induced protein kinases» и «salicilate-induced protein kinases» - индуцируемые механическим повреждением и салицилат-индуцируемые протеинкиназы). Оказалось, что активация WIPK осуществляется не только при поранении, но и при их инфицировании вирусом табачной мозаики [Zhang, Klessing, 1997], а активация SIPK - при действии олигосахаридных элиситоров и белковых элиситинов [Zhang et al., 1998].
Активация МАР-киназ носит преходящий характер, а это означает, что должны быть эффективные механизмы их ингибирования. Инактивация МАР-киназной сигнальной системы осуществляется, в первую очередь, за счет дефосфорилирования МАРК с помощью протеинфосфатаз. Все имеющие отношение к МАР-киназному сигнальному каскаду протеинфосфатазы подразделяются на 3 группы: 1) ферменты двойной специфичности, осуществляющие дефосфорилирование остатков тирозина и треонина в МАР-киназах; 2) тирозиновые протеинфосфатазы; 3) серин-треониновые протеинфосфатазы [Тарчевский, 2001].
Специфические и неспецифические факторы вирулентности
Аденозин 3 ,5 -циклический монофосфат был впервые открыт в 1956 году Сазерлендом, как термостабильный фактор, опосредующий действие адреналина и глюкагона на активацию животной фосфодиэстеразы. За исключением безъядерных эритроцитов, цАМФ, как было обнаружено, является вездесущим в животных клетках, где он медиирует действие коротких воздействий окружающей среды, действие на клетки гормонов, таких как вазопрессин, секретин, окситоцин, адреналин, норадреналин и глюкагон. Связывание одного из этих гормонов со специфическим рецепторным сайтом на плазматической мембране клетки активирует аденилатциклазу, которая синтезирует цАМФ из АТФ. цАМФ используется внутри клетки, действуя как «вторичный мессенджер», связываясь со специфичными сайтами на регуляторных субъединицах цАМФ-зависимой протеинкиназы. В результате этого протеинкиназа становится способна к фосфорилированию ключевых ферментов, таких как гликогенфосфорилаза и липаза, посредством этого регулируя их активности.. В 1965 году Макман и Сазерленд [Makman, Sutherland, 1965; цит. по Brown, Newton, 1981] обнаружили цАМФ в клетках Е. соїі. Пастан и Перлман [Pastan, Perlman, 1972; цит. по Brown, Newton, 1981] позднее показали, что в бактериях цАМФ связывается со специфическими рецепторными белками, связанными с lac опероном. Таким образом, цАМФ является «вторичным мессенджером» не только в животных тканях, но также функционирует как мессенджер регуляции генной экспрессии в бактериях. Первоначальная, более древняя по времени роль цАМФ у одноклеточных организмов заключалась в его функции первичного внеклеточного посредника - сигнала тревоги в критических ситуациях: при изменении окружающей среды, при исчезновении питательных веществ и др. [Николаева, Крупнова, 2003].
В низшем грибе миксомицете Dictiostelium discoideum, цАМФ функционирует как «акразин», т.е. как агрегационный фактор в течение амебоидной стадии развития. Агрегация начинается, когда небольшое количество общей популяции начинает импульсно выделять цАМФ. Выделенный цАМФ начинает связываться с рецепторами на поверхности плазматической мембраны реагирующей амебы.
Работами последних лет также доказано присутствие циклического 3 ,5 -АМФ (цАМФ) в клетках высших растений. Ранее появлялись работы, где утверждалось, что цАМФ не является компонентом растительного организма [Amrhein, 1974; Amrhein, 1977]. Эти работы на протяжении ряда лет производили своеобразный «негативный эффект» на развитие этой потенциально важной области биохимии растений. Однако в последнее время методами газожидкостной хроматографии и масс-спектрометрии установлено, что цАМФ-подобное вещество, выделяемое из клеток высших растений, является циклическим 3 ,5 -АМФ.
С момента открытия цАМФ и обнаружения его в растениях, перед исследователями постоянно стоит проблема унифицирования методологии определения цАМФ. Самым достоверным на настоящий момент считается ионизационный масс-спектрометрический метод быстрой атомной бомбардировки (FAB) [Newton et al., 1999]. Однако далеко не каждому исследователю доступен этот метод, поэтому в количественном определении цАМФ обычно применяются методы масс-спектрометрии, газожидкостной хроматографии, изотопного разведения по Джилману, радиоиммунный и др. [Newton et al., 1980; Van Onckenen et al., 1982; Roef et al., 1996; Gilman, 1970; Adams et al., 1991]. Реже используется метод биолюминесценции, позволяющий отслеживать динамику цАМФ в живой клетке [Fagan et al., 2001]. Как будет показано ниже (см. главу «Объекты и методы исследования») иммуноферментный анализ, модифицированный для определения цАМФ, также является достаточно корректным.
Что касается концентраций цАМФ, определяемых в растительных образцах, то по литературным данным можно сделать вывод, что концентрация цАМФ в клетках разных видов растений может колебаться от предельно низких (фемтомолярной) до весьма значительных (десятки микромолей) [Яворская, Калинин, 1984; Cooke et al., 1994; Ти, 1979]. В некоторой степени такой разброс в получаемых данных зависит от используемых методов и от степени очистки препаратов, но в то же время факторы внешней среды также оказывают немаловажное влияние на уровень данного вторичного мессенджера. Обнаружено изменение уровня цАМФ в зависимости от фазы роста клеток, изменения режима питания, морфологии и др. [Яворская, 1990; Truelsen, Wyndaele, 1978; Sharaf, Roney, 1982]. Колебательный характер содержания цАМФ наблюдали в каллусной ткани табака [Sharaf, Roney, 1982] и подсолнечника [VanOnckenen et al., 1984], на различных фазах клеточного цикла [Семенов и др., 1993], а также в стрессовых условиях [Яворская, 1990].
На основе экспериментальных данных было установлено, что у одноклеточных и многоклеточных организмов существует еще один способ регуляции концентрации цАМФ - выделение циклонуклеотидов в окружающую среду [Ивашкин и др., 1987; Каримова и др., 1993; Орлов, Максимова, 1999]. Так, у прокариотов внеклеточный уровень цАМФ составлял 98% общего количества нуклеотида в клетках [Шиян, Лазарева, 1988]. При инкубации клеток животных с гормонами 80-90% всего синтезированного цАМФ обнаруживалось вне клетки. Секреция цАМФ из клеток энергозависима, подавляется ингибиторами формирования микротрубочек, различными простагландинами, активируется гормонами и повышается с увеличением активности аденилатциклазы [Fehr et al., 1990]. Клетки водорослей, мхов и высших наземных растений также выделяют значительное количество цАМФ. Хотя физиологическая значимость этого феномена не выяснена, предполагается роль цАМФ как фактора, определяющего межклеточные взаимодействия, на что указывает тот факт, что плазматические мембраны прокариотов, животных клеток и растений проницаемы для циклонуклеотида [Яворская, 1990; Fehr et al., 1990].
Функциональная роль цАМФ в растительных организмах активно исследуется, но в то же время остается много неясных вопросов. Существуют данные о том, что цАМФ вовлечен в растительный клеточный цикл в синхронизированных клетках табака [Ehsan et al., 1998]. Также цАМФ играет существенную роль во время роста и реориентации пыльцевой трубки [Moutinho et al., 2001]. Более того, основываясь на анализе концентрации цАМФ, активности аденилатциклазы и фосфодиэстеразы до и после перекрестного опыления была предположена тесная взаимосвязь между самонесовместимостью и уровнем цАМФ [Tsuruhara, Tezuka, 2001]. цАМФ также играет роль в регуляции закрытия устьиц и свеллинга протопластов через свободный цитозольный кальций [Curvetto et al., 1994]. В суспензионных клетках моркови и люцерны цАМФ способен стимулировать вход кальция и элиситор-индуцированное накопление фитоалексина [Cooke et al., 1994]. Bundschedler с соавторами [Bundschedler et al., 2001] доказали, что вход кальция, стимулированный грибным элиситором и окислительным взрывом может происходить с участием цАМФ-сигнализации.
Метод капиллярного электрофореза для идентификации цАМФ и доказательства отсутствия в растительной пробе других циклических нуклеотидов
Элиситоры - определенные метаболиты фитопатогенов и растений (при взаимодействии последних с патогеном), приводящие к включению защитных реакций в растительных тканях. Собирательный термин «элиситор» был предложен впервые в 1972 году [Keen et al., 1972] для обозначения химических сигналов, возникающих в местах инфицирования растений патогенными микроорганизмами, и получил широкое распространение.
Элиситоры играют роль первичных сигналов и приводят в действие сложнейшую сеть процессов индукции и регуляции фитоиммунитета. Это проявляется в синтезе защитных белков, нелетучих растительных антибиотиков - фитоалексинов, выделении антипатогенных летучих соединений и др. В настоящее время охарактеризована структура множества природных элиситоров. Некоторые из них продуцируются микроорганизмами, другие (вторичные элиситоры) образуются при ферментативном расщеплении высокополимерных соединений кутикулы и полисахаридов клеточных стенок растений и микроорганизмов, третьи представляют собой стрессовые фитогормоны, синтез которых в растениях индуцируется патогенами и абиогенными стрессорами. В этой части обзора будут рассмотрены биогенные элиситоры микроорганизмов.
Наиболее исследованы элиситоры из клеточных стенок грибов. Ими могут быть два типа полисахаридов: р-связанные глюканы и хитозан [Ильинская, Озерецковская, 1991].
Некоторые из известных на сегодняшний день элиситоров могут содержать в своем составе белковые или полипептидные компоненты. Первым индуктором такого типа, описанным у грибов, был мониликолин А, выделенный из мицелия Monilinia fructicola. Этот элиситор оказался специфичен только для фасоли. Белковый фактор индукции фитоалексинов был найден также у бактерий. Из бактерии Pseudomonas solanacearum был выделен фактор, который индуцировал СВЧ-ответ в клетках картофеля [Huang et al., 1998]. Наиболее изученными белковыми элиситорами можно считать небольшие (10 КДа) консервативные гидрофильные обогащенные цистеином элиситины, секретируемые всеми исследованными видами Phytophtora и Pythium [Zhang et al., 1998], к ним относится, например, криптогеин [Keller et al., 1999]. Большое число исследований посвящено гликопротеинам как элиситорам иммунных ответов растений. Так, из Phitophthora megasperma var. sojae выделены гликопротеины, обладавшие способностью индуцировать образование глицеоллина в семядолях сои [Keen, Legrand, 1980]. Причем для проявления элиситорной активности существенной являлась углеводная, а не белковая часть гликопротеина.
Повреждение растительных клеточных стенок приводит к освобождению углеводных фрагментов, которые индуцируют образование фитоалексинов. Предполагается, что их механизм действия схож с механизмом действия гормонов, которые распространяются по растению, связываются со специфическими рецепторами на клеточных мембранах и инициируют каскад защитных реакций [Ильинская, Озерецковская, 1991]. Такие молекулы получили название конститутивных или эндогенных элиситоров. Другое их название - олигосахарины [Hahn,1996]. Образование олигосахаринов in vivo происходит в результате ферментативной деградации полисахаридов клеточных стенок растений и грибов, а не в ходе синтеза их из молекул мономеров. Под действием различных стрессовых агентов, включая механическое поранение тканей растений и их инвазию фитопатогенами, происходит усиленный распад полисахаридов клеточной стенки с высвобождением олигосахаринов, которые, связываясь со специфическими рецепторами, включают триггерные механизмы обеспечения выживаемости растения. Также олигосахарины регулируют растяжение клеток растений, стимулированное ростовыми гормонами, контролируют процессы морфогенеза, индукцию этилена, вызывают быстрые изменения в ионных потоках и проницаемости плазматической мембраны, индуцируют in vivo фосфорилирование белков [Озерецковская, Роменская, 1996].
По данным Переход с соавторами (1998), фрагменты ксилоглюкана клеточных стенок картофеля, образующиеся под действием целлюлазы, влияют на устойчивость картофеля к Phytophtora infestans. Высокомолекулярные продукты ферментолиза являлись элиситорами защитных реакций клубней картофеля, а низкомолекулярные олигосахариды - их супрессорами [Ильинская, Озерецковская, 1991].
Ненасыщенные жирные кислоты С-20 ряда образуют еще один обширный класс сигнальных молекул, участвующих в элиситации защитного сигнала и обеспечивающих системную устойчивость растений к болезням. Ранее из мицелия возбудителя фитофтороза был выделен элиситор -липогликопротеидный комплекс (ЛГП), инициирующий устойчивость к болезням и поранению у картофеля, томатов и сахарной свеклы [Озерецковская и др., 1987; Чалова и др., 1988]. В отличие от углеводсодержащих элиситоров, абсцизовая кислота не взаимодействует с рецепторами, а депонируется в мембранах растительных клеток, замещая линолевую и линоленовую кислоты [Озерецковская и др., 1994].
В отличие от элиситоров, о механизмах действия супрессоров известно намного меньше. Вообще супрессию, то есть блокаду защитных реакций растений патогенами, можно рассматривать достаточно широко - начиная от капсул экстраклеточных полисахаридов на поверхности некоторых бактерий до токсинов или ферментов патогенов, подавляющих реакции устойчивости растений [Васюкова, Озерецковская, 1991]. Супрессоры не обязательно должны обладать токсичными свойствами. Существует группа нетоксичных супрессоров, которые, не повреждая растительные клетки, препятствуют распознаванию хозяином паразита. Такие вещества получили название импединов. Супрессоры такого плана известны для многих патосистем: Pseudomonas solanacearum - пасленовые, Pseudomonas phaseolicola - фасоль, Uromycesphaseoli - фасоль и ряда других [Васюкова, Озерецковская, 1991]. Кроме того, существует ряд супрессоров, обладающих расоспецифичностью, то есть эти молекулы способны подавлять иммунный ответ в клетках тканей совместимых сортов. Исследования последних лет показали, что на роль таких супрессорных молекул в патосистеме Phitophtora infestans - картофель могут претендовать цитоплазматические водорастворимые низкомолекулярные р-1,3 - р-1,6 - глюканы. Они могут различаться между собой по степени полимеризации, количеству и распределению по цепи фрагментов, из которых под действием экзо-р-1,3 -глюканазы образуются три- и тетрасахариды. Интересными представляются данные, свидетельствующие о временном подавлении иммунных ответов такими глюканами - супрессорами [Озерецковская, 1994]. Как было сказано выше, в качестве супрессоров растительных защитных ответов могут выступать некоторые ферменты фитопатогенов, например деполимеразы клеточных стенок. Эти ферменты призваны деградировать клеточную стенку растений. Поэтому к ним относятся различные пектиназы, кутиназы, целлюлазы, ксиланазы [Walton, 1994; Collmer, Bauer, 1994].
Выявление методом ИФА трансмембранной и «растворимой» форм аденилатциклазы в ядрах и хлоропластах
Суспензионную культуру быстро отфильтровывали, фиксировали в жидком азоте и гомогенизировали в буфере выделения следующего состава: 50 мМ трис-НС1, рН 7.4, 0.1 мМ теофиллина, 1мМ дитиотреитола, 0.5 мг/мл растворимого поливинилпирролидона ("Fluka" Швеция), связывающего фенолы. Для дополнительного связывания фенолов (при определении содержания цАМФ) [Каримова и др., 1990] при гомогенизации использовали ионообменную смолу Dowex-50 ("Sigma", США) в весовом соотношении 1:5 (смола: растительный материал). Далее смесь фильтровали через два слоя мелкоячеистого капрона и центрифугировали 40 мин при 20000 g на центрифуге К 24. Для повышения специфичности иммунной реакции в иммуноферментном анализе (ИФА), образец очищали от присутствия других циклических нуклеотидов с помощью нейтральной окиси алюминия.
Пробирочные растения картофеля. Пробирочные растения картофеля фиксировали целиком в жидком азоте, затем делили на участки длиной примерно 4 см. Далее подвергали процедурам, описанным для суспензионной культуры клеток.
Очистка осадка и супернатанта от примесей других циклических нуклеотидов с помощью нейтральной окиси алюминия. На колонку с нейтральной окисью алюминия с толщиной слоя 1 см3, уравновешенную буфером выделения, наносили 1 мл супернатанта или осадка, ресуспендированного в буфере выделения. Элюцию проводили тем же буфером, и анализ спектра веществ осуществляли с помощью хроматографического оборудования ("Uvicord", Швеция), при длине волны 276 нм. Стандартами служили аденозин, 5-АМФ, цАМФ, цГМФ, цТМФ, цЦМФ ("Sigma", США) в концентрации 100 пМ. В этом случае цАМФ элюировался раньше других соединений и обнаруживался уже во втором мл, что согласуется с литературными данными [White, Zenser, 1971]. Общий объем элюата составлял 8 мл. Далее элюат упаривали на роторном испарителе под вакуумом досуха, сухой остаток растворяли в 100% диметилсульфоксиде («Реахим», Россия), чтобы удалить загрязнение солями, затем центрифугировали при 20000 g. Диметилсульфоксид из осадка удаляли ацетоном («Экос-1», Россия). Пробу высушивали на воздухе при комнатной температуре. Количество цАМФ определяли ИФА.
Анализ начинали с иммобилизации антигена на поверхности планшета. С этой целью в лунки полистироловых планшетов для ИФА («Ленинградский ЗМП», Россия, ТУ 64-2-278—79) вносили по 0.1 мл смеси следующего состава: 1 мл исследуемого образца + 0.08 мл 25%-ного глутарового альдегида («Sigma», США) + 1 мг/мл БСА («Sigma», USA). Планшеты инкубировали 15 часов при 37С и лунки трижды промывали буфером ПТБС (0.02 М Na-фосфатный буфер, 0.1 М NaCl («Реахим», Россия), 0,3 % твин-20 («Ferak», Германия), рН 7,0). Затем для предотвращения неспецифического связывания антител с твердым носителем в каждую лунку добавляли по 0.1 мл лошадиной сыворотки («Аллерген», Россия), разведенной 1:10 ПБС (ПТБС без твина) и планшеты выдерживали 1 ч при 37С. После этого в лунки вносили по 0.1 мл первичных кроличьих антител, специфичных против цАМФ ("Sigma", США) в концентрации 60 мкг/мл, разведенных в ПБС. Материал инкубировали 2 ч при 37С и промывали трижды ПТБС. Затем повторяли обработку образцов лошадиной сывороткой. Далее в лунки вносили по 0.1 мл меченных пероксидазой вторичных козьих антител ("Sigma", США), разведенных 1:800 в 0.1 М карбонатно-бикарбонатном буфере, рН 8.3 и, через 1 ч инкубации при комнатной температуре, отмывали трижды ПТБС. После этого осуществляли трехразовое промывание лунок планшетов 0.2 М фосфатно-цитратным буфером, рН 5.6, для удаления детергента, создающего высокий фон неспецифического окрашивания при развитии цветной реакции на пероксидазу. Затем в каждую лунку добавляли 0.1 мл 0,16% ортофенилендиамина («Sigma», США)г растворенного в том же самом фосфатно-цитратном буфере и 3 мкл 3% перекиси водорода. Окраска развивалась в течение 20 мин. Реакцию останавливали добавлением 0.1 мл/лунку 4 N серной кислоты («Реахим» Россия). Измерения интенсивности поглощения света растворами проводили на спектрофотометре С-101-46 (Германия) при длине волны 490 нм. Контролем служила буфер выделения без растительных образцов. Калибровочную кривую строили по цАМФ ("Sigma", США). Нижний предел определения данного метода - 10 пМоль цАМФ в пробе. Эксперименты проводили в восьми аналитических и трех биологических повторностях. Расчет количества цАМФ в пробе вели на мг белка. Белок в растительной пробе определяли по методу Брэдфорд [Яворская, Калинин, 1984]. Результаты обрабатывали статистически с вычислением стандартной ошибки среднего, а также устанавливали достоверность различий между вариантами опыта (Коэффициент Стьюдента ) [Брехман, 1970].
Корни опытных (инкубированных в течение 15 мин с ЭПС Cms) и контрольных пробирочных растений нарезали на сегменты размерами 5 мм и фиксировали 2% глутаровым альдегидом на 0,1 М фосфатном буфере, рН 7,4 в течение 2 часов. Дофиксацию проводили 1% четырехокисью осмия («Реахим», Россия) на 0,1М фосфатном буфере в течение 2 ч. Материал обезвоживали в серии восходящих концентраций этанола, смеси абсолютного этанола с ацетоном, ацетоне, затем заключали в эпон-аралдит ("Fluka", Швейцария). Ультратонкие срезы получали на ультрамикротоме REICHERT (Австрия), помещали на палладиевые сеточки без подложки и контрастировали насыщенным раствором уранилацетата («Реахим», Россия) в 50% этаноле в течение 30 минут и цитратом свинца ("Sigma", США) по Рейнольдсу в течение 25 минут (Уикли, 1975, стр. 294). Сеточки с образцами просматривали в электронном микроскопе JEM-100SX (JEOL, Япония) и LEO 906Е (Цейс, Германия).
