Содержание к диссертации
Стр.
Список условных сокращений 5
Введение 6
Литературный обзор 9
I. Генетическая инженерия растений: достижения практического применения и значение для фундаментальных исследований 9
1.1 Проблема биобезопасности трансгенных растений 23
1.2 Основные методы трансформации растений 28
1.2.1 Способы генетической трансформации растений с использованием Agrobacterium tumefaciens 35
1.3 Стратегия и методология создания трансгенных растений 37
1.4 Назначение и практическое применение репортерных генов 39
1.4.1. Репортерный ген GUS 41
И. Регуляторная зона гена 42
II. 1 Промоторы трансгенов 46
ІІ.2 Экспрессия чужеродных генов в трансгенных растениях 48
ІІ.З Специфическое метилирование промотора как регуляция активности гена 51
ІІ.4 Регуляция активности генов сахарами 54
III. Главный запасной белок клубней картофеля - пататин 57
III. 1 Основные функции белка пататина 59
Ш.2 Мультикопийное семейство генов, кодирующих пататины 60
Ш.З Особенности экспрессии основных классов генов пататина 61
Ш.4 Структурные особенности промотора гена пататина класса I 63
Материалы и методы исследований 66 1. Реактивы 66
2. Объекты исследований 66
2.1 Модельная система на основе трансгенного картофеля 66
2.2 Модельная система на основе трансгенного арабидопсиса 68
2.3 Размножение и поддержание коллекции трансформантов картофеля 68
3. Выделение и анализ ДНК 69
3.1 Выделение растительной ДНК 69
3.1.1 Дополнительная очистка растительной ДНК 70
3.2 Проверка качества выделенной ДНК 70
3.3 Определение концентрации ДНК в образцах 71
3.4 Проведение полимеразной цепной реакции 71
3.5 Метод идентификации на олигонуклеотидном биочипе 72
3.6 Получение плазмидной ДНК 74
3.6.1 Получение компетентных клеток 74
3.6.2 Трансформация Е. coli 75
3.6.3 Микровыделение плазмидной ДНК 75
3.6.4 Макровыделение плазмидной ДНК 76
4. Анализ метилирования цитозина ВЗЗ-промотора у картофеля 77
4.1 Проведение полимеразных цепных реакций 77
4.2 Подбор и использование рестриктаз 78
4.3 Подбор количества контрольной ДНК для рестрикционного анализа 79
4.4 Рестрикционный анализ пататинового промотора в составе растительной ДНК 79
4.4.1 Анализ степени метилирования сайтов GCGG методом R-ПЦР 79
4.4.2 Анализ степени метилирования сайтов GCGG методом Southern-блоттинга 80
5. Определение активности гена GUS 82
5.1 Гистохимическое окрашивание органов картофеля и проростков арабидопсиса с помощью X-Gluc 82 5.2 Флюориметрический метод 83
6. Определение количества белка методом Bradford 85
7. Световая микроскопия 85
8. Определение органной специфичности работы промотора 85
9. Исследование влияния различных условий выращивания на функционирование пататинового промотора 86
10. Изучение влияния экзогенных Сахаров на активность промотора ВЗЗ 87
11. Анализ действия фитогормонов 87
12. Статистическая обработка данных 88
Результаты 89
I. Анализ работы пататинового промотора на модели трансгенного картофеля 89
1. Доказательство трансгенности растений 89
2. Анализ специфичности функционирования промотора ВЗЗ 91
2.1 Органная специфичность 91
2.2 Тканевая специфичность 97
2.3 Зависимость от возраста 102
2.3.1 Влияние возраста листьев 102
2.3.2 Влияние возраста растений 106
3. Анализ влияния условий выращивания трансформантов картофеля на активность пататинового промотора 109
3.1 Влияние световых условий выращивания 109
3.2 Влияние сахарозы 113
3.2.1 Выращивание трансформантов на свету ИЗ
3.2.2 Выращивание в темновых условиях 117
4. Анализ влияния экзогенных Сахаров на активность пататинового промотора в изолированных листьях 122
4.1 Влияние сахарозы 122 4.2 Сравнение влияния сахарозы, глюкозы и фруктозы 123
П. Анализ возможных молекулярных механизмов органной специфичности ВЗЗ-промотора. Роль метилирования промоторной ДНК 127
1 Анализ степени метилирования ВЗЗ-промотора методом ПЦР 129
1.1 Подбор и анализ рестриктаз 131
1.2 Подбор условий ПЦР на контрольной ДНК и рестрицированной ДНК 134
1.3 Сравнительный анализ доступности ДНК из разных органов картофеля 136
1.4 Рестрикция ВЗЗ-промотора метилчувствительной рестриктазой Acil 138
2 Анализ степени метилирования сайтов GCGG методом Southern-блотинга 140
III. Анализ работы пататинового промотора на модели трансгенного арабидопсиса 143
1. Определение органной специфичности работы промотора ВЗЗ 143
2. Влияние света и темноты на активность пататинового промотора 145
3. Изучение влияния экзогенных Сахаров на активность пататинового промотора 146
3.1 Анализ действия сахарозы 146
3.2 Гистохимический анализ действия сахарозы на активность пататинового промотора 150
3.3 Анализ влияния глюкозы и фруктозы 154
3.4 Кинетика ответной реакции на сахара 155
4. Исследование возможного влияния фитогормонов на активность пататинового промотора 156
Обсуждение 159
Выводы 171
Список цитируемой литературы 173
Введение к работе
Картофель входит в число важнейших продовольственных культур. За последние годы картофель стал одной из тех культур, на которых интенсивно применяются методы генной инженерии. Это связано с разработкой достаточно надежных методов его трансформации, с высокой регенерационной способностью картофеля, а также с тем, что практически любую биоинженерную форму картофеля можно сохранить и размножить вегетативно. Экономически важной частью картофеля является запасающий орган - клубень, содержащий большое количество питательных веществ: крахмала и белка. В связи с этим очень важным являются исследования, направленные на изучение различных аспектов процесса клубнеобразования и накопления ценных ингредиентов в клубнях. Одним из подходов является использование трансгенных форм, полученных методами генетической инженерии.
Генетическая инженерия растений базируется на знании важнейших принципов функционирования гена, открытых благодаря фундаментальным биологическим дисциплинам. В свою очередь, генетическая инженерия растений способствует обогащению фундаментальных биологических наук новыми знаниями о структурно-функциональных механизмах работы генов в растительной клетке. Одним из современных подходов исследования функциональных особенностей промоторов является анализ их активности в условиях гетерологичной экспрессии. Обычно для этих целей промотор объединяют с кодирующей последовательностью какого-либо репортерного белка, заметно не влияющего на метаболизм клетки и развитие растения. При гетерологичной экспрессии, особенно у филогенетически отдаленных видов, проявляются как высококонсервативные универсальные системы регуляции генной активности, так и механизмы регуляции, свойственные отдельной группе растений или данному виду. Изучение структурно-функциональных особенностей промоторов генов является важной задачей современной биологии и имеет большое практическое значение, а именно, создание трансгенных растений с определенными хозяйственно-ценными признаками. Так, изучение и использование тканеспецифичных промоторов позволяет проводить целенаправленное улучшение именно хозяйственно-ценных частей растений. Для картофеля - это клубнеспецифичные промоторы гена пататина класса I и промотор GBSS.
В связи с этим, актуальным вопросом является изучение особенностей функционирования промотора гена пататина класса I картофеля. Данный промотор в настоящее время широко используется в различных биотехнологических работах, для решения самых разнообразных задач.
Так, пататиновый промотор был использован (Ефименко и др., 1996) для обеспечения тканеспецифичной экспрессии бактериального гена гомосеринкиназы (HSK) в трансгенных растениях картофеля. Гомосеринкиназа является ключевым ферментом в биосинтезе трех незаменимых аминокислот - треонина, метионина и изолейцина. То есть существует реальная возможность создания трансгенных растений картофеля с улучшенным составом белков. Экспрессия под контролем пататинового промотора гена циклодекстрин-гликозилтрансферазы (CGT) - фермента, расщепляющего крахмал до декстринов - позволяет получать трансформанты с повышенной пищевой ценностью клубней, из-за повышенной растворимости крахмала (Oakes et al., 1991).
Пататиновый промотор широко используется в работах, имеющих научное значение, для изучения различных аспектов роста и развития растений. Данный промотор применяется для изучения биохимических и молекулярных аспектов клубнеобразования; гормональной и углеводной регуляции клубнеобразования; для выяснения функций и механизмов действия сахарозы в процессе развития и жизнедеятельности высших растений. Таким образом, пататиновый промотор используют в генноинженерных работах как для создания трансгенных растений картофеля с улучшенными качествами, так и в работах, целью которых является изучение различных процессов, происходящих в течении их роста и клубнеобразования, а также в работах, направленных на изучение различных аспектов регуляции генной экспрессии. Поэтому оценки степени активности данного промотора в разных органах и тканях и при различных условиях выращивания растений представляют большой теоретический и практический интерес.
Целью данного исследования являлось изучение особенностей функционирования промотора гена пататина класса I картофеля в условиях гомологичной и гетерологичнои экспрессии, анализ влияния различных факторов на промоторную активность и выяснение возможных молекулярных механизмов органной специфичности его функционирования.
В соответствии с целью были поставлены следующие задачи:
провести сравнительное исследование органоспецифичности пататинового промотора при гомо- и гетерологичнои экспрессии;
- исследовать влияние различных факторов, включая временные и световые условия выращивания растений, а также уровень сахарозы в культуральной среде, на активность пататинового промотора;
- охарактеризовать реакцию пататинового промотора в ранний период действия углеводов и фитогормонов;
- выяснить, может ли участвовать метилирование ДНК в механизмах органоспецифичности пататинового промотора.
