Введение к работе
ггуальиость проблемы
Исследование работы генов под действием различных физиологических факторов является ной из самых актуальных проблем современной молекулярной биологии. Появившиеся недавно лходы и технологии позволяют анализировать особенности функционирования множества генов посредственно на транскрипционном уровне. Уже первые исследования в этой области казали, что транскриптом - совокупность всех мРНК (транскриптов), синтезируемых одной еткой или группой клеток в данный момент времени, - активно и согласованно реагирует на югие воздействия, в том числе возникающие при различных патологических процессах. В стоящее время анализ транскриптома является одним из инструментов для изучения ханизмов заболеваний и поиска способов их лечения. Особый интерес представляет следование транскриптома клеток нервной тхани в норме и при таких патологических здействиях как нарушение мозгового кровообращения - церебральная ишемия. Среди аемических заболеваний мозга наибольшую значимость представляет инсульт - следствие ютоянного или временного снижения мозгового кровотока, в большинстве случаев вызванного етюзией мозговых артерий тромбом или эмболом. Профилактика и терапия этого заболевания -ига из самых актуарных проблем современной медицины. В число препаратов, обладающих ;йропротективными свойствами, входит первый отечественный ноотропный препарат семакс, пешно используемый для лечения различных нейродегенеративных заболеваний, в том числе гсульта. Семакс представляет собой синтетический пептид Met-Giu-His-Phe-Pro-GIy-Pro, N-конец іторого содержит фрагмент АКТЦ4-7), С-конец - пептид Рго-Gly-Pro (PGP). Исследование гйствия семакса в системе in vitro на клеточных культурах свидетельствует о его ;йропротективных свойствах. В физиологических экспериментах также показано, что семакс іижает выраженность неврологического дефицита и увеличивает выживаемость животных с лсмическим инсультом (Мясоедов и соавт., 1999). Гипотеза о том, что семакс оказывает влияние ї экспрессию нейротрофинов и их рецепторов, являющихся важнейшими регуляторами ункционирования и выживания нейронов, подтверждена на интактных животных: применение ;макса способствует повышению экспрессии нейротрофина Bdnf и его рецептора TrkB - на эовне белка и мРПК (Dolotov et al., 2006), нейротрофина Ngf- на уровне мРНК (Agapova et al., 307). Действительно, система нейротрофинов и их рецепторов определяет альтернативный выбор между гепегическими программами апоптоза и выживания, а также играет роль в репаративных процессах, и, следовательно, представляет собой потенциальный механизим нейропротекции при ишемии (Kokaia et al., 1995; Lee et al., 1998; Iadecola, 1999; Li et al., 1999; Lipton, 1999; Pitts, Miller, 2000; Lu ct al., 2003). В связи с этим представляется необходимым исследовать влияние семакса на экспрессию нейротрофинов и их рецепторов в условиях церебральной ишемии.
Исследования деградации семакса в плазме крови и мозге у крыс показали, что в живом организме семакс подвергается быстрой ферментативной деградации с образованием смеси пептидных дериватов, в которой уже через 1 час после введения семакса преобладает PGP (Шевченко и соавт., 2006). Кроме того, недавно были выявлены самостоятельные эффекты PGP. Рассмотрение этих сведений ставит актуальный вопрос о вкладе PGP в терапевтические эффекты семакса.
Принимая во внимание ноотропные свойства семакса, представляется интересным исследовать его действие на экспрессию гена Egrl, кодирующего транскрипционный фактор, запускающий различные генные программы в нервной ткани, лежащие в основе обучения, формирования и распознавания долговременной памяти, синаптической пластичности (Wisden et al., 1990; Nikolaev et al., 1992; Okuno, Miyashita, 1996; Tischmeyer, Grimm, 1999; Jones et al., 2001; Bozon et al., 2003). Кроме того, экспрессию гена Egrl также связывают с процессами воспаления, апоптоза и пролиферации, имеющими место при ишемическом повреждении нервной ткани (Lee etal.,2004).
Еще один ген, обнаруженный и охарактеризованный в нашем Отделе, - SMS1 - кодирует фермент сфингомиелинсинтетазу 1. Будучи ключевым компонентом сфингомиелинового цикла, сфингомиелинсинтетаза принимает участие в регулировании баланса между процессами клеточной гибели и выживания посредством регуляции образования про-апоптотического медиатора церамида и синтеза анти-апоггготического медиатора диацилглицерина (ДАТ) (Hannun, 1994; Geilen et al., 1997; Alessenko, 2000). Несмотря на то, что воздействие ишемии и оксидантного стресса на экспрессию компонентов сфингомиелинового цикла достаточно хорошо изучено, исследовать экспрессию сфингомиелинсинтетазы в условиях ишемии до сих пор не представлялось возможным.
Цель и задачи исследования
Целью настоящей работы являлось изучение влияния нейропротективного препарата семакс и его С-концевого фрагмента PGP на экспрессию мРНК генов нейротрофинов и других факторов роста, их рецепторов, а также генов Egrl и SMS1 в различных участках мозга крыс в условиях экспериментальной модели фокальной ишемии мозга крыс. Для этого были поставлены следующие задачи:
Выполнить гистологическое исследование мозга крыс, подвергнутых необратимой окклюзией левой среднемозговой артерии; локализовать очаг ишемического повреждения.
Определить относительное содержание мРНК генов, кодирующих нейротрофины и другие факторы роста, их рецепторы, а также генов Egrl и SMS1 в различных участках мозга животных с церебральной ишемией.
Определить относительное содержание мРНК генов, кодирующих нейротрофины и другие факторы роста, их рецепторы, а также генов Egrl и SMS1 в структурах мозга экспериментальных животных, получавших семакс или PGP.
» Провести сравнительный анализ-действия семаксаи PGPjra экспрессию,исследуемыхтенов в мозге крыс. Научная новизна практическая значимость работы
Результаты исследования воздействия семакса и PGP на экспрессию нейротрофинов, факторов роста и их рецепторов представляют научно-практический интерес. Впервые исследовано воздействие семакса и PGP на экспрессию генов нейротрофинов, факторов роста и их рецепторов, а также генов Egrl и SMS1 в условиях экспериментальнй фокальной ишемии мозга. Впервые показано активирующее действие семакса и PGP на представленность мРНК генов, кодирующих нейротрофины и их рецепторы, в ишемической коре мозга крыс, свидетельствующее о нейропротективных свойствах обоих пептидов. Действие семакса на транскрипцию генов
нейротрофинов и их рецепторов проявляется преимущественно в участке лобной коры, включающем очаг повреждения, тогда как действие PGP не является селективным и наблюдается в мозге здоровых, ложнооперированных и ишемизированных животных. Выявленное активирующее воздействие семакса па транскрипцию генов нейротрофинов и их рецепторов в течение суток после ишемической атаки, обеспечивающих нейропротехцию и выживание нервной ткани, имеет существенное значение при фармакотерапии инсультов.
На фоне применения семакса и PGP в лобно-теменной доле коры мозга крыс, включающей очаг ишемии, впервые обнаружено изменение экспрессии мРНК большого числа генов факторов роста и их рецепторов. Функции генов, изменивших свою экспрессию при введении семакса, свидетельствует о его нейропротективном и ноогропном действии, а также указывают на анксиолитические свойства препарата и его роль в формировании сосудов. Выявленная в работе активация экспрессии многих генов факторов роста и их рецепторов при введении PGP, иллюстрирует нейропротективное действие этого пептида Обнаруженное впервые активирующее воздействие PGP на транскрипцию гена Egrl свидетельствует о ноотропных свойствах этого пептида. Эти свойства PGP открывают новые перспективы в использовании пептида для терапии заболеваний нервной системы.
Новыми являются данные об изменении транскрипции генов нейротрофинов и их рецепторов не только в ищемизировашюй коре, но также в коре коптрататерального полушария и подкорковых структурах обоих полушарий мозга животных, подвергнутых фокальной ишемии. Эти результаты представляют большой интерес с позиций определения вклада данных генов в осуществление процессов, протекающих в головном мозге, в условиях повреждения. Впервые выявлены изменения транскрипции гена SMS1 в мозге животных в условиях экспериментальной ишемии, что имеет большое значение для дальнейшего изучения механизмов регуляции процессов апоптоза клетки в условиях эксперимиггальной ишемии.
Установлено, что эффекты семакса и PGP на транскрипцию генов нейротрофинов и ігх рецепторов совпадают лишь частично, а на экспрессию генов SMSI и Egrl существенно различаются. Сделано предположение, что одним из механизмов нейропротектшшого действия семакса и PGP в мозге в условиях ишемии является их воздействие на экспрессию генов системы факторов роста и их рецепторов, обеспечивающих функционирование клеток нервной ткани и сосудов. Следует подчеркнуть, что результаты изучения воздействия семакса и PGP на экспрессию исследованных генов имеют особую значимость для разработки новых терапевтических подходов. Публикации
По материалам диссертации опубликовано 20 печатных работ, из них 4 статьи и 16 материалов симпозиумов и конференций. Апробация диссертации
Результаты, полученные в данной работе, были представлены на конференциях Американского Общества Генетики Человека (ASHG) 2003-2007 г.г., Европейского Общества Генетики человека (ESHG) 2005-2008 г.г., па Российском симпозиуме «Белки и пептиды» в 2007 и 2009 г., съезде Российского общества биохимиков и молекулярных биологов в 2008 г., изложены на конкурсе работ на стипендию фонда «Будущее молекулярной генетики» (Москва, ИМГ РАН, 2007 г). Основные положения диссертационной работы доложены и обсуждены на заседании
Ученого совета ИМГ РАН 21 сентября 2009 г. и на заседании секции «Молекулярная биология» Ученого совета ФГУП «ГосНИИ генетики и селекции промышленных микроорганизмов» 7 октября 2009 г. Структура и объем диссертации
Диссертация включает введение; обзор литературы, материалы и методы исследования, результаты исследования и их обсуждение; выводы; библиографический указатель. Список литературы состоит из 264-х источников, среди которых 29 источников отечественной и 235 источников зарубежной литературы. Материалы диссертации изложены на 129-ти страницах машинописного текста, содержат 7 таблиц и 19 рисунков.
