Содержание к диссертации
Введение
1. Литературный обзор
1.1 Нейральные индукторы и антинейрогенные факторы 6
1.2 Регионализация нервной трубки 11
1.3 Транскрипционные факторы, принимающие участие в ранней дорсо-вентральной регионализации нервной пластинки 14
1.4 Антериорно-постериорная регионализация нервной пластинки 19
1.5 Факторы, которые могут играть роль постеризующего сигнала в формировании ранней АП разметке нервной пластинки 20
1.6 Роль вертикальной и планарной индукции в разметке нервной пластинки 23
1.7 Пространственная модель АП разметки нервной пластинки 26
1.8 Роль гомеобоксного гена Xanf 1 в раннем развитии переднего мозга у позвоночных 29
1.9 Прицельный поиск транскрипционных регуляторов эмбриогенеза при помощи дрожжевой-одногибридной системы 33
2. Результаты и их обсуждения Подходы и модели, использованные в работе 39
2.1 Поиск транскрипционных регуляторов гомеобоксного гена Xanfl 40
2.1.1 Скрининг экспрессионной кДНК библиотеки поздней гаструлы шпорцевой лягушки с помощью дрожжевой одно-гибридной системы 40
2.1.2 Краткая характеристика идентифицированных транскрипционных факторов и анализ расположения их зон экспрессии по отношению к зоне экспрессии Xanf-1 46
2.2 Изучение роли транскрипционных факторов FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 в локализации экспрессии Xanf-І в головной нейроэктодерме 50
2.2.1 Проверка способности белковых факторов FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 связываться с регуляторным элементом промотора гена Xanf-1 in vitro 52
2.2.2 Анализ влияния экзогенных факторов FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 наэкспрессию гена Xanf-1 в эмбрионах шпорцевой лягушки 55
2.2.3 Проверка ингибирующего действия эндогенных факторов FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 на ген Xanf-1 60
2.2.4 Проверка гипотезы о непосредственном воздействии транскрипционных репрессоров FoxA4a/Pintall avis и Xvent2 на экспрессию гена Xanf-1 64
2.2.5 Подавление экспрессии гена Xanf-І в туловищной зоне нервной пластинки хорошо согласуется с активационно-трансформационной моделью нейральной индукции 67
Выводы 70
- Регионализация нервной трубки
- Пространственная модель АП разметки нервной пластинки
- Изучение роли транскрипционных факторов FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 в локализации экспрессии Xanf-І в головной нейроэктодерме
- Проверка гипотезы о непосредственном воздействии транскрипционных репрессоров FoxA4a/Pintall avis и Xvent2 на экспрессию гена Xanf-1
Введение к работе
Выяснение молекулярно-генетических механизмов раннего развития головного мозга - одна из фундаментальных задач функциональной геномики. Знание этих механизмов так же важно для понимания природы многих наследственных заболеваний у человека.
Среди всех отделов головного мозга в наименьшей степени изучены механизмы развития т.н. переднего мозга. Вместе с тем, выяснение именно этих механизмов крайне важно ввиду того, что передний мозг отвечает за высшие формы нервной деятельности, в том числе, за мышление у человека. Кроме того, передний мозг является одним из основных анатомических признаков, отличающих позвоночных животных от всех других организмов. Поэтому изучение механизмов его развития важно для понимания особенностей эволюции типа позвоночных животных в целом.
Эффективным подходом к решению указанной задачи может быть поиск и изучение функций регуляторных белков, определяющих пространственно-временное "расписание" дифференцировки клеток в зачатке переднего мозга.
Ранее, в группе молекулярных основ эмбриогенеза ИБХ РАН, был идентифицирован новый класс гомеодоменных транскрипционных факторов, Anf, ответственных за наиболее раннюю стадию развития зачатка переднего мозга (Zaraisky et al, 1992; Zaraisky et al., 1995; Kazanskaya et al., 1997). Ha модели эмбрионов шпорцевой лягушки было показано, что представитель данного класса транскрипционных факторов, Xanf-І, играет ключевую роль в развитии зачатка переднего мозга, а искусственно вызванная активация Xanf-1 вне зоны его нормальной экспрессии - в передней части нервной пластинки -приводит к серьезным аномалиям переднего мозга (Dattani et al., 1998; Ermakova et al., 1999).
5 В связи с этим, актуальной задачей является поиск и изучение функций специфических транскрипционных факторов, обеспечивающих строгую пространственную локализацию экспрессии Xanf-І в границах будущего зачатка переднего мозга.
Поскольку решение данной задачи сопряжено со значительными трудностями, обусловленными, прежде всего, малыми размерами раннего зачатка переднего мозга и, как следствие, весьма низкой копииностью искомых транскрипционных факторов, актуальной технической задачей является разработка методики, позволяющей проводить систематический поиск таких факторов с помощью экспрессионных кДНК библиотек эмбриональных клеток.
Решение этих двух задач представляется важным не только для выяснения механизмов, контролирующих экспрессию одного из ключевых регуляторов дифференцировки переднего мозга, гена Xanf-І, но и с точки зрения разработки универсальных подходов к изучению механизмов регуляции экспрессии генов в индивидуальном развитии.
Регионализация нервной трубки
Параллельно с нейральной индукцией происходит регионализация нейрального зачатка. Схематическая карта ранней регионализации нервной пластинки эмбриона шпорцевой лягушки представлена на рисунке 1. Представленная схема была получена с использованием метода in situ гибридизации на целых зародышах с зондами к транскриптам генов - маркеров нервной системы (N-CAM, ubulin, Chordin). N-CAM является пан-нейральным геном-маркером : экспрессируется по всей поверхности нервной пластинки за исключением области базальной пластинки (Diresen and Jamrich, 1992). Широко используется нейрон-специфичный ubulin (Richter et al., 1988), который является геном-маркером для нейронов, дифференцирующихся в процессе образования нервной пластинки (Chitnis et al., 1995). От центра к краю нервной пластинки расположены следующие зоны: зона базальной пластинки - Floor plate (FP), зона медиальных нейронов (мотонейронов MN) и интермедиальных нейронов (TMN). Основная поверхность нервной пластинки окаймлена нервным гребнем (Neural crest, заштрихованная часть рисунка). В области головы нервную пластинку ограничивает зона антериорного нервного валика (ANR) и зона краниальных плакод (черная линия). Три разновидности нейронов формируются на стадии нервной пластинки: мотонейроны образуются сразу за базальной пластинкой, интернейроны — в интермедиальной зоне, а большие Rohon-Beard (RBN) нейроны происходят из нервного гребня и расположены в эктодерме за границей нервной пластинки. На стадии ранней нейрулы (правая диаграмма) фактор вентральной эктодермы ВМР-4 связывается факторами дорсальной мезодермы Chordin, Noggin, Follistatin (XFS). Ткани дорсальной мезодермы происходят из области Шпемановского организатора и обозначены на диаграмме различными цветами: желтым цветом - сомиты, голубым - хорда. Эти факторы могут, в зависимости от концентрации, регионализировать эктодерму с образованием базальной пластинки (черный), нервной пластинки (розовый) и нервного гребня (оранжевый). При высокой концентрации ВМР-4 образуется эпидермис (вентральная эктодерма). На стадии поздней нейрулы (левая диаграмма) базальная пластинка и клетки презумптивной хорды продуцируют секретируемый белок Sonic Hedgehog (Shh) (Riddle et al., 1993; Echelard et al.,1993; Krauss et al., 1993; Roelink et al., 1994), гомолог продукта гена сегментарной полярности у Drosophila. Сигнал, передаваемый фактором Shh, может ингибировать активность факторов из семейства BMP, экспрессирующихся в дорсальной части нервной трубки и прилегающей эктодерме.
Интересно, что гомолог Shh, продукт гена Hedgehog, играет основную роль в образовании антериорно-постериорной (АП) полярности сегментов тела плодовой мушки Drosophila (Nusslein-Volhard and Wieschaus, 1980). У позвоночных продукт гена Shh принимает участие в образовании дорсо-вентральной (ДВ) полярности нервной трубки и сомитов (Fan et al.,1995), АП полярности зачатков конечностей (Riddle et al., 1993) и право-левосторонней полярности внутренних органов (Levin et al., 1995). Таким образом, функцией гена Hedgehog и его гомологов у позвоночных является формирование полярности в различных тканях. У амфибий экспрессия гена Shh детектируется в области базальной пластинки и презумптивной хорды начиная со стадии гаструлы и усиливается на стадии нейрулы. Сам по себе, фактор Shh не может индуцировать образование нервной ткани, но может менять ее дорсо-вентральную полярность (Ekker et al., 1995). Показано, что сигнал-антагонист для продукта гена Shh происходит из клеток дорсальной части нервной трубки и покрывающего ее эпидермиса. Наиболее вероятно, это связано с экспрессией BMP-родственных факторов . ВМР-4, ВМР-7, dorsalin-І для курицы (Basler et al., 1993); ВМР-2 для мыши и radar для рыб (Rissi et al., 1995). В деталях вопрос об универсальной системе ранней ДВ регионализации нервной пластинки и мезодермы остается открытым. 1.3 Транскрипционные факторы, принимающие участие в ранней дорсо-вентральной регионализации нервной пластинки. Подавление BMP-сигнала факторами нейральной индукции приводит к активации генов, необходимых для дальнейшего развития нервной пластинки из клеток дорсальной эктодермы. На самой ранней стадии развития по всей поверхпости нервной пластинки экспрессируются пан-нейральные гены. Для зародышей Xenopus хорошо описаны два транскрипционных фактора: Х1рои2 (гомолог продукта гена мыши Вгп-4) и Sox-факторы (HMG-факторы). Эти гены экспрессируются самыми первыми в клетках проспективной нейроэктодермы. Ген Х1рои2 может быть индуцирован фактором Noggin, а микроинъекции XLpou2 мРНК вызывают нейральную дифференцировісу в клетках эмбриональной зктодермьі. ШаеіаІ., 1995). Экспрессирующиеся на ранних стадиях в нервной пластинке Sox-гены (Sox-D, Sox-1, Sox-2 и Sox-З), кодируют факторы, содержащие HMG-домен (high mobility group) и способные связываться со специфическими последовательностями ДНК (Grosschedl et al., 1994). Ген SoxD экспрессируется в клетках проспективной эктодермы со стадии поздней бластулы и зона его экспрессии распространяется на всю область дорсальной эктодермы до середины гаструляции (Mizuseki et al., 1998). Такая ранняя экспрессия гена SoxD делает возможным его участие в реализации изначально заложенной предрасположенности развития эктодермы по нейральному типу (согласно модели «по умолчанию» Hemmati-Brivanlou, Melton, 1997). Эктопическая экспрессия гена SoxD в клетках эмбриональной эктодермы активизирует гены нейральной и нейрональной дифференцировки. В частности, было показано, что его оверэкспрессия в клетках эмбриональной эктодермы вызывает активацию экспрессии гена Xanfl (Mizuseki et al., 1998). Ген Sox2 также имеет пан-нейральную экспрессию, но отличается от гена SoxD тем, что не способен сам по себе вызывать нейрализующий эффект. Этот ген, по-видимому, может играть роль в изменении компетенции эктодермы таким образом, что она приобретает способность отвечать на воздействие нейрализующих факторов (включая факторы семейства FGF, Mizuseki et al., 1998). Z/оподобные гены являются гомологами Drosophila odd paired топов и включают недавно описанные в литературе гены Zic-rl, Zic3, Zicl, Zic2 и opl (Kuo et al., 1998; Mizuseki etal., 1998; Nakata et al., 1997; 1998; Brewster et al., 1998; Grinblat et al., 1998). Как и фактор SoxD, факторы Zic-rl и Zic3 могут инициировать нейральную и нейрональную дифференцировку при эктопической экспрессии, но, в отличие от SoxD, их экспрессия не распространена по всей нервной пластинке, а ограничена ее дорсальной частью. Подобно гену Sox2, ген opl не имеет нейрализующего эффекта, но сенсибилизирует клетки эмбриональной эктодермы к воздействию нейрального индуктора Noggin.
Многие из Zifc-генов, активируемые нейральными индукторами, индуцируют маркеры нервного гребня при эктопической экспрессии, что согласуется с их поздней экспрессией в дорсальной части нервной трубки в зародышах Xenopus. Гены ZicS, Zic-rl и SoxD могут инициировать экспрессию пронейрального гена neurogenin в трех билатерально симметричных продольных доменах туловищной области нейроэктодермы. В связи с этим, возникает вопрос - каким образом экспрессия гена neurogenin, индуцированная пан-нейральными генами, может ограничиваться тремя билатеральными продольными зонами в нервной пластинке? Одним из регуляторов такой регионализации экспрессии neurogenin является другой фактор семейства Zic- Zic2 (Brewster et al., 1998). Фактор Zic2 содержит ингибиторный домен и экспрессируется зонами, комплементарными продольным полосам, где образуются первые нейроны. Возможно, ингибируя функцию других широко экспрессирующихся факторов Zic, он ограничивает способность индуцировать экспрессию гена neurogenin и создает условия для возникновения продольных зон экспрессии последнего в нервной пластинке. Серию ингибирующих взаимодействий, ограничивающую нейрогенез и образующую три пронейрональные зоны в нейроэкто дерме можно представить следующим образом: 1 - фактор Zic2 ограничивает экспрессию гена neurogenin, что приводит к образованию трех продольных участков в нервной пластинке: медиального, интермедиального, латерального. 2 - продукт гена neurogenin вызывает экспрессию ингибиругощего мембранного лиганда DeltaA, который активирует рецептор Notch в соседних клетках. При активации рецептора Notch понижается действие neurogenin в близлежащих клетках.
Пространственная модель АП разметки нервной пластинки
Планарные сигналы играют наиболее существенную роль при разметке различных зон в уже сформированной нервной пластинке. На рисунке 4 приведена схема модели разметки нервной пластинки с указанием зоны активности специфических сигналов и транскрипционных факторов, принимающих участие в передаче этих сигналов. В результате разметки происходит образование перекрывающихся зон с различной компетенцией к общим для всей поверхности нервной пластинки и локальным сигналам. К общим сигналам можно отнести сигналы из центра и с краев нервной пластинки. Сигнал из центра нервной пластинки, происходящий из области прехордальной пластинки и клеток презумптивной хорды (на рисунке: pep- prechordal plate, nc- notochord), осуществляет разметку в медиально- латеральном направлении. Этот сигнал индуцирует образование базальной пластинки (Ьр) и передается при помощи секретируемого белка Shh (hedgehog). Активность гена Shh простирается по всей длине нервной пластинки (обозначена на рисунке черными стрелками) и проявляется в экспрессии генаМх2./ в области развития гипоталамуса и гена Nkx2.2 в вентральной области нервной системы. Следует отметить, что ген Shh (Hedgehog) так же может принимать участие в образовании специфических структур внутри конечного мозга. Эктопическая экспрессия гена Shh приводила к индукции вентральных генов-маркеров конечного мозга: пкх2,1, gsh2, dlx2 в клетках-эксплантантах дорсальной части конечного мозга мыши (Gaiano et al., 1999; Corbin et al., 2000). Изучение мутаций у мышей по этим генам дает возможность сделать заключение о роли гомеобоксных генов в качестве медиаторов в формировании границ и образовании отделов переднего мозга (Torresson et al.,2000). За счет сигнала из эктодермы, лежащей за пределами нервной пластинки осуществляется ее дорсо-вентральная разметка. Эктодермальные факторы семейства BMP (их активность обозначена на рисунке серыми стрелками) могут индуцировать экспрессию гена Msxl, ограничивают поверхность нервной пластинки от эпидермальной эктодермы и производят разметку ее латеральных структур, в том числе нервного гребня (на рисунке: ар-alar plate, rp-roof plate).
Важным источником локальных планарных сигналов, регулирующих раннее развитие головной неироэктодермы, является узкая полоска клеток, окаймляющая передний край нервной пластинки. На стадии средней нейрулы эта структура имеет вид небольшой складки или гребешка, приподнимающегося над поверхностью эмбриона и, поэтому, носит название anterior neural ridge - ANR. Сигналы, исходящие из ANR, регулируют экспрессию генов в антерио-латеральной части нервной пластинки (Couly and Le Douarin, 1988; Eagleson et al., 1995). В частности, клетки ANR экспрессируют фактор FGF8, в свою очередь, активирующий экспрессию ключевого транскрипционного регулятора конечного мозга - Bf 1. Так, фактор FGF8 может замещать функцию ANR, регулирующую экспрессию гена Bfl. А в экспериментах in vitro на эксплантантах из антериорной части нервного гребня мыши показана способность белка FGF8 вызывать экспрессию Bfl (Shumamura and Rubenstein, 1997). С использованием клеток из эмбрионов рыб показано, что сам по себе фактор FGF8 не может вызывать индукцию конечного мозга, а только содействует активности клеток антериорной нейроэктодермы (Shanmugaligam et el, 2000). На эмбрионах мыши показано, что только клетки антериорной части нервной пластинки могут экспрессировать фактор Bfl в ответ на сигнал FGF8, тогда как клетки нервной пластинки на уровне будущего среднего мозга экспрессируют фактор Еп2 (engreald) в ответ на тот же сигнал (Grossleyet al., 1996; Shimamura and Rubenstein, 1997). Кроме FGF8 клетки ANR могут секретировать и другие сигнальные молекулы, о чем, в частности, свидетельствует тот факт, что ранняя фаза экспрессии Bf-1 в передней части нервной пластинки в ответ на индукцию клетками ANR происходит еще до начала экспрессии FGF8 в этих клетках. Основной ролью ANR в развитии может быть разделение антериорной нервной пластинки на область глаз, области конечного и промежуточного мозга (диэнцефалона). Мутация гена тЫ (masterblind) у эмбрионов рыбы zebrafish нарушает эту регионализацию, вызывая распространение промежуточного мозга на область глаз и конечного мозга (Heisenberg et al., 1996; Masai etal., 1997). В последнее время были идентифицированы новые гомеобокс-содержащие гены такие, как Xanf-1 у шпорцевой лягушки (Ermakova et al., 1999) и его гомолог из мыши Hesxl (Dattani et al., 1998), а так же гены six3 (Kobayashi et al., 1998) и pax 6 (Choii et al., 1999). Эти гены играют важную роль в формировании разметки переднего мозга на конечный и промежуточный. Следующая глава данного обзора целиком посвящена гену Xanf-1, впервые клонированном в 1991 году в группе молекулярных основ эмбриогенеза ИБХ РАН. 1.8 Роль гомеобокспого гена Xanfl в раннем развитии переднего мозга у позвоночных. В ходе работы по поиску регуляторных генов, специфически экспрессирующихся в раннем зачатке головного мозга, был идентифицирован гомеобоксный ген, получивший название Xanf (от Xenopus anterior neural fold — передний нервный валик эмбриона ксенопуса - специфическая область экспрессии данного гена) (Zaraisky et al, 1992; Zaraisky et al., 1995). Технической особенностью данной работы по поиску генов-регуляторов было то, что в ней впервые с помощью вычитающей гибридизации кДНК был осуществлен эффективный поиск дифференциально-экспрессирующихся генов в микропопуляциях клеток: сравниваемые образцы тканей эмбриона (головной нейроэктодермы и эпидермиса) были выделены микрохирургически и содержали каждый не более нескольких сотен клеток. Впоследствии были клонированы пять прямых гомологов Xanf. у человека, курицы, тритона, рыбы данио (zebraflsh) и осетра (Kazanskaya et al., 1997; Казанская и др., 1998). Зарубежными исследователями был идентифицирован гомолог Xanf у мыши - Hesxl/Rpx (Thomas et al., 1995; Hermesz et al., 1996).
Как оказалось, кодируемые этими генами гомеодоменные белки - специфические факторы транскрипции - образуют отдельный класс гомеодоменных белков, отличающихся от других классов по структуре гомеодомена - специфичного для этого типа белков альфа-спирального консервативного участка, обеспечивающего связь с определенными регуляторными последовательностями в ДНК. Данный класс генов был назван Anf. от Anterior neural fold - область зачатка нервной системы, в которой экспрессируется данный ген (Kazanskaya et al., 1997). Многие экспериментальные данные указывают на то, что Лн/является одним из ключевых звеньев молекулярного механизма, обеспечивающего развитие переднего мозга у позвоночных, а возникновение Anf могло быть одним из событий, приведших к возникновению данного отдела мозга: - Anf- наиболее ранний из всех известных экспрессионных маркеров зачатка переднего мозга (Zaraisky et al, 1992; Zaraisky et al., 1995; Kazanskaya et al., 1997). Было показано, что у всех исследованных модельных организмов экспрессия Anf начинается на стадии гаструляции; причем уже на этой стадии его экспрессия локализуется в той области нейроэктодермы, которая в последствии становится зачатком переднего мозга. В отличие от Anf, все другие известные регуляторы развития переднего мозга начинают экспрессироваться на более поздних стадиях эмбриогенеза. Особенностью и/является так же то, что он экспрессируется в очень коротком временном интервале: с середины гаструляции и до окончания нейруляции.
Изучение роли транскрипционных факторов FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 в локализации экспрессии Xanf-І в головной нейроэктодерме
Выделение в составе нервной пластинки области, экспрессирующей Xanf-7, - наиболее раннее событие в детерминации будущего зачатка переднего мозга. Как показал делеционный анализ промотора Xanf-l, механизм локализации экспрессии данного гена в передней части нервной пластинки основан на подавлении его экспрессии в задней части пластинки. В связи с этим, большой интерес представляет поиск транскрипционных факторов, обеспечивающих такое подавление. Среди найденных десяти транскрипционных факторов, способных связываться с элементом промотора Xanf-l, необходимым для локализации его экспрессии, только два фактора, FoxA4a/Pintallavis и Xvent2, могут претендовать на роль искомых ингибиторов, поскольку зоны их экспрессии в нервной пластинки расположены позади области экспрессии Xanf-l и полностью комплементарны этой области. (Рис.7). На основании этого, данные два фактора были выбраны для дальнейшего изучения их влияния на экспрессию Xanf-l в нервной пластинке. Для подтверждения способности транскрипционных факторов FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 связываться с идентифицированными регуляторными элементах промотора гена Xanf-l нами был использован метод торможения ДНК-белковых комплексов в полиакриламидном геле (Electrophoretic Mobility Shift Assay, EMS A). Для экспрессии регуляторных белков использовали микроинъекции мРНК, кодирующие факторы FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 в ооциты шпорцевой лягушки и полученный грубый экстракт из ооцитов использовали при анализе изменения подвижности радиоактивно-меченых олигонуклеотидных последовательностей. Специфичность связывания проверялась по уменьшению EMS-сигнала при разбавлении в 10 раз экстракта из ооцитов, микроинъецированных мРНК, кодирующих FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 контрольным экстрактом из ооцитов, инъецированных мРНК, кодирующей флуоресцентный белок EGFP, а так же полное отсутствие EMS- сигнала при использовании только контрольных экстрактов ооцитов (Рис. 8). Для проведения EMSA-анализа использовались двухцепочечные олигомерные последовательности, содержащие дистальный (14 н.п.) и проксимальный (22 н.п.) цис-регуляторные элементы промотора гена Xanf-l: 5 tctgtcccaTGCTAATTACACAC (14н.п. элемент), 5 tctgcatgtcgaCAAACAAATAAACAATTAACTCga (22 н.п. элемент). Следует отметить, что описанные в литературе 2 консенсусные последовательности, необходимые для связывания фактора Xvent2, СТААТТА и СААТТАА, содержатся соответственно в 14 н.п. и 22 н.п. элементах. Консенсусная последовательность, необходимая, по литературным данным, для связывания FoxA4a/Pintallavis (G/A)TAAA(T/C)A содержится только в 22 н.п. элементе САААСАААТАААСААТТААСТС (Рис. 8D).
Комплементарная цепь 14-н.п. элемента TGCTAATTACACAC содержит последовательность GTAATTA, которая имеет всего одну замену в консенсусной последовательности (G/A)TAAA(T/C)A. Этим можно объяснить сильное (приблизительно 10- кратное) уменьшение EMS-сигнала от 14-н.п. элемента по сравнению с 22-н.п. элементом. Для изучения специфичности связывания FoxA4a/Pintallavis с 14-н.п. элементом мы сделали такие точечные мутации в исследуемой последовательности, которые, в случае специфичного взаимодействия, могут привести к полному нарушению связывания. В результате замены последовательности СТАААТТА на CTACGTC , EMS-сигнал полностью исчезает (Рис. 8С). Изменение потенциального сайта связывания в последовательности дистального элемента СТАААТТА на консенсусную для FoxA4a/Pintallavis последовательность GTATTTA приводит к сильному возрастанию EMS-сигнала по сравнению с исходным 14-н.п. цис-регуляторным элементом (Рис. 8С). Таким образом, нами была показана возможность связывания транскрипционного фактора FoxA4a/Pintallavis с последовательностью, имеющую одну нуклеотидную замену по сравнению с консенсусной в регуляции транскрипции гена Xanf-1. Анализ влияния экзогенных факторов FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 на экспрессию гена Xanf-І в эмбрионах шпорцевой лягушки. Для изучения роли найденных факторов в регуляции экспрессии гена Xanf-1 in vivo были проведены микроинъекции синтетической мРНК, кодирующей эти факторы, вместе с внутриклеточной меткой, флуоресцеин-лизин-декстраном (FLD) в один или два бластомера на анимальном полюсе зародыша. Известно, что микроинъекции в дорсальные-анимальные бластомеры на стадии 32-клеточного зародыша приводит к распределению введенной метки только в, эктодермальном клеточном слое, но не в подлежащей дорсальной мезодерме. Такая локализация инъецированной мРНК дает возможность исключить косвенное влияние изучаемых факторов на нейроэктодерму через изменение индукционных влияний от подлежащего мезодермального слоя клеток. На стадии ранней нейрулы мы отбирали только те эмбрионы, которые содержали FLD-метку в области нервной пластинки.для дальнейшего анализа изменений экспрессии гена Xanf-І методом in situ гибридизации на целых зародышах. Для детальной оценки изменений в зоне экспрессии гена Xanf-І бал применен метод in situ гибридизации на целых зародышах с использовантем смеси двух dig-меченых мРНК зондов: первый зонд к мРНК гена Xanf-І, и второй, к мРНК экспрессионного маркера границы среднего/заднего мозга -гена Engrailed2. Во всех отобранных эмбрионах (37 эмбрионов для FoxA4a/Pintallavis и 39 для Xventl в 4 независимых экспериментах) мы наблюдали подавление экспрессии гена Xanf-І в тех клетках нервной пластинки, которые содержали эктопическую FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 мРНК, что подтверждало способность этих белков ингибировать экспрессию Xanf-І (Рис.Ю А,А ,В,В )- Для анализа распределения микроинъецированных клеток по клеточным слоям были приготовлены гистологические срезы (четыре зародыша для каждой мРНК). Как и предполагалось, FLD-меченные клетки видны преимущественно в эктодермальном слое клеток в области, где детектируется подавление экспрессии гена Xanf-І. Только несколько одиночных меченых клеток можно увидеть в подлежащих эндомезодермальных слоях (Рис.ЮВІ). В то же время, в областях с нормальной экспрессией гена Xanf-І у тех же самых зародышей не наблюдается FLD-меченых клеток, следовательно, эти области не содержат эктопической FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 мРНК (Рис. 10 В2,ЗВ2 ). Эти данные свидетельствуют о том, что подавление экпрессии гена Xanf-1 экзогенными FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 является результатом прямого влияния этих факторов в клетках нейроэктодермы.
Для дальнейшего подтверждения предположения о том, что FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 подавляют экспрессию Xanf-1 действуя как транскрипционные репрессоры, мы синтезировали мРНК, кодирующие гибридные версии ДНК-связывающих доменов этих факторов, с репрессорным доменом транскрипционного фактора Engreald (EnR) дрозофилы (Рис.9 А,В). Полученные мРНК, кодирующие подобные ультимативные репрессорные версии FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 {EnR-FoxA4a/Pintallavis и EnR-Xventl), были микроинъецированны в дорсальные-анимальные бластомеры 32-клеточных эмбрионов. В результате, подавление экспрессии Xanf-І наблюдалось во всех клетках, содержащих FLD-метку (34 эмбриона было отобрано для EnR- FoxA4a/Pintallavis и 37 для EnR- Xvent2 в трех независимых экспериментах) (Рис. ЮС, С). Гистологические срезы этих эмбрионов (по 4 эмбриона для каждого типа инъецированной мРНК) подтвердили автономность действия использованных гибридных конструкций в клетках нейроэктодермы. Учитывая полученные данные о том, что добавление сильного репрессивного EnR-домена в мРНК конструкции, кодирующие факторы FoxA4a/Pintallavis и Xvent2, не дало изменений во влиянии на экспрессию гена Xanf-1, по сравнению с интактными FoxA4a/Pintallavis и Xvent2, можно сделать вывод о репрессивной роли этих факторов в нормальном развитии. Для проверки этого вывода независимым методом были проведены микроинъекции мРНК, кодирующие доминантно-негативные версии факторов FoxA4a/Pintallavis и Xvent2. В своей работе мы использовали два типа доминантно-негативных конструкций. В первом случае, оба исследуемых транскрипционных фактора были экспрессированы в виде гибридных белков с сильным активационным доменом белка VP16 из вируса герпеса (Рис.9 А ,В ). Как известно из литературы, последний домен способен изменять репрессорную функцию транскрипционных факторов на активаторную. Второй способ доминантно-негативного изменения функции был использован в случае фактора Xvent2 и заключался в получении мРНК, кодирующей данный фактор, содержащий точечную мутацию L/P в гомеодоменной области белка в позиции 40 (Xvent-P40, Рис. 9 С). По литературным данным, такая мутация способна блокировать активность нормального фактора Xvent2 за счет образования нефункционального гетеродимера нормального и мутантного факторов, что приводит к потере способности связыватся с ДНК.
Проверка гипотезы о непосредственном воздействии транскрипционных репрессоров FoxA4a/Pintall avis и Xvent2 на экспрессию гена Xanf-1
Для проверки гипотезы о том, что ген Xanf-1, является прямой мишенью для репрессоров FoxA4a/Pintallavis и Xventl в эмбриональных клетках были проведены эксперименты с использованием мРНК, кодирующими их дексаметазон-индуцируемые доминантно-активаторные гибридные версии. Зародыши на стадии 4-8 бластомеров были микроинъецированы мРНК, кодирующими доминантно-активаторные версии обоих факторов со связывающим доменом глюкокортикоидного рецептора (Binding Domain of Glucocrticoid Receptor, BDGR; РисЛЗ A,B). Особенностью таких конструкций является инактивация гибридного белка в клетке за счет связывания BDGR-домена с комплексом белков теплового шока в цитоплазме. Добавление в инкубационную среду синтетического глюкокортикоида, дексаметазона (DEX), приводит к разрушению этого комплекса, в результате чего гибридные доминантно-активаторные факторы получают возможность связываться с регуляторными элементами промоторов генов-мишеней. На стадии поздней гаструлы зародыши, микроинъецированные мРНК VP16-FoxA4a/Pintallavis-BDGR и VP16-Xvent2-BDGR, были помещены на 1 час в среду, содержащую 10мг/мл циклогексимида (СНХ), для полного подавления синтеза белка. После этого, транслированные ранее в клетках микроинъецированных эмбрионов гибридные белки VP16-FoxA4a/Pintallavis-BDGR и VP16-Xvent2-BDGR, были активированы добавлением в среду дексаметазона (DEX) в концентрации 2мкМ. В этих условиях (подавление общего белкового синтеза) могла происходить активация транскрипции только непосредственных генетических мишеней факторов VP16-FoxA4a/Pintallavis-BDGR и VP16-Xvent2-BDGR, но не тех генов, которые при разрешенном синтезе белка могли бы быть активированы промежуточными факторами-посредниками. В результате этих экспериментов, в случае применения как первой, так и второй конструкции, мы наблюдали увеличение зоны экспрессии Xanf-1: 42 и 21 зародыша имели расширенную область экспрессии гена Xanf-І в двух независимых экспериментах для VP16-FoxA4a/Pintallavis-BDGR и VP16-Xvent2-BDGR, соответственно (Рис. 14 А, А , В, В ). Эти данные подтверждают гипотезу о прямом взаимодействии факторов FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 с промотором Xanf-1. Известная модель нейральной индукции, предложенная Ньюкопом, предполагает, что на первом этапе вся нейроэктодерма, под индукционным влиянием «раннего» организатора Шпемана, приобретает потенции к развитию в переднеголовные структуры, а на втором этапе, под воздействием «позднего» организатора, эти потенции трансформируются в туловищные. Важным постулатом этой модели является то, что переднеголовные потенции сохраняются в туловищной зоне нервной пластинки и на втором этапе индукции, просто они оказываются маскированными трансформирующим сигналом.
Таким образом, переднеголовные потенции, индуцированные на первом этапе в нейроэктодерме, могут быть реализованы только в передней части нервной пластинки. В полном соответствии с этой моделью, экспрессия гена Xanf-1, которая была активирована факторами SoxD, Otx2 и, возможно, другими активаторами в процессе нормального развития, впоследствии оказывается подавленной в постериорной области нервной пластинки в результате связывания репрессоров FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 с цис-регуляторным элементом промотора гена Xanf-І (РисЛ 5), Блокирование действия этих репрессоров приводит к восстановлению экспрессии Xanf-1 в задне-головной области, что соответствует предсказанию модели Ньюкупа о возможности реактивации переднеголовных потенций в подходящих условиях. Следует отметить, что найденные цис-регуляторные элементы промотора гена Xanf-І оказываются высоко консервативными у всех известных генов семейства An/ в том числе, у An/ генов таких далеко дивергировавших организмов, как шпорцевая лягушка, курица и человек (Рис. 8D). Из этого можно сделать вывод о высокой консервативности механизма подавления экспрессии данных генов гомологами транскрипционных факторов FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 у всех позвоночных. Интересно, что все другие типы животных, включая ближайших родственников позвоночных - низших хордовых, не имеют анатомических структур, гомологичных переднему мозгу позвоночных. Более того, данные по изучению геномов показывают, что гены семейства An/ также могут быть специфической эволюционной "находкой" позвоночных животных. Эти данные, а также тот факт, что экспрессия Anf генов является необходимым условием развития переднего мозга, позволяют сделать предположение о том, что возникновение Anf-тип. гомеобоксного гена и механизма, обеспечивающего передне-головную локализацию его экспрессии путем подавления при помощи факторов FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 (или их гомологов) в задних областях, может быть решающей стадией в эволюции переднего мозга у позвоночных. 1. Впервые была разработана методика, позволяющая проводить систематический поиск транскрипционных факторов, связывающихся с цис- регуляторными элементами генов-регуляторов эмбрионального развития, с помощью дрожжевой одногибридной системы и коммерческих кДНК библиотек, сконструированных на основе LEXA-экспрессионного вектора и используемых для двухгибридной дрожжевой системы. 2. С использованием одногибридной дрожжевой системы идентифицированы 10 транскрипционных факторов DIx2, Dlx5, Hoxb9, Msxl, Nkx5.1, FoxA4a/Pintallavis, Xventl, Xvent2, Xanfl, Xanf2, способных связываться с цис-регуляторным элементом промотора гена Xanf-1, расположенным между позициями «-203» и «467» от сайта начала транскрипции. 3. Доказано прямое ингибиторное влияние факторов FoxA4a/Pintallavis и Xvent2 на экспрессию гена Xanf-1 в зачатке головного мозга у шпорцевой лягушки. 4. Показано, что гомеодоменный транскрипционный фактор Xvent-2 и fork-head фактор FoxA4a/Pintallavis обеспечивают ингибирование экспрессии гена Xanf-І и определяют постериорную границу его экспрессионного домена в туловищной зоне нервной пластинки. 5. Полученные данные об ингибировании Xanf-1 в туловищной зоне нервной пластинки, за пределами его нормального экспрессионного домена, полностью соответствуют активационно-трансформационной модели нейральной индукции, предложенной Ньюкупом.
