Содержание к диссертации
Введение
1. Общие принципы инициации транскрипции 9
1.1. Организация промотора Ю
1.2. Нуклеосомная организация промотора 14
1.3. Сборка преинициаторного комплекса 17
2. Общий фактор транскрипции TFIID 18
2.1. ТВР 21
2.2. Структура TFIID 24
2.3. Ферментативные активности субъединиц TFIID 26
3. Ремоделирование хроматина 27
3.1. Классификация ремоделирующих комплексов 28
3.2. SWI/SNF семейство 30
3.3. Доменная структура субъединиц ВАР и РВАР комплексов 31
3.3.1. Домены, опосредующие белковые взаимодействия 32
3.3.2. ДНК-связывающие домены 34
3.3.3. Актин как компонент SWI/SNF комплексов 35
3.4. Функции ВАР и РВАР комплексов 37
3.5. Механизм действия SWI/SNF комплексов 39
4. Упорядоченное рекрутирование: ген-специфичный механизм активации транскрипции 42
Экспериментальная часть 47
1. Объекты и задачи исследования 47
2. Материалы и методы 49
2.1. Материалы. 49
2.1.1. Штаммы и вектора Е. Coli . 49
2.1.2. Клеточные линии. 49
2.1.3. Работа с дрозофилами 49
2.1.4. Бактериальные среды 50
2.1.5. Ферменты и реактивы 5 0
2.1.6. Антитела 50
2.1.7. Праймеры 50
2.2. Работа с клетками 51
2.2.1. Трансформация S2 клеток 51
2.2.2. РНК интерференция 52
2.3. Работа с ДНК 52
2.3.1. Приготовление компетентных клеток 52
2.3.2. Трансформация бактерий 53
2.3.3. Щелочное выделение плазмидной ДНК 53
2.3.4. Обработка ДНК рестриктазами 54
2.3.5. Лигирование 54
2.3.6. Вьщеление геномной ДНК из мух 54
2.3.7. Гель-электрофорез ДНК. 55
2.3.8. ПЦР (PCR) 55
2.3.9. Секвенирование ДНК 55
2.4. Работа с РНК 55
2.4.1. Получение двухцепочечной РНК 55
2.5. Работа с белками 5 7
2.5.1. Экспрессия и очистка рекомбинантных белков 57
2.5.2. Получение антител и их очистка 57
2.5.3. Белковый гель-электрофорез 57
2.5.4. Вестерн-блот анализ 57
2.5.5. Соосаждение беклов антителами (иммунопреципитация) 58
2.5.6. Дот-блот анализ 58
2.5.7. Получение белковых экстрактов из S2 клеток 59
2.5.8. Выделение эмбрионального ядерного экстракта 59
2.5.9. Хроматографическая очистка комплекса 59
2.5.10. Гель-фильтрация 59
2.5.11. Фингер-принтный анализ с использованием MALDI-TOF масс-спектроскопии 60
2.6. Иммуноокрашивание политенных хромосом 60
2.7. Хроматиниммунопреципитация (СЫР) 61
2.8. Использованное программное обеспечение. 62 3. Результаты 64
3.1. Очистка SAYP-содержащего комплекса из ядерного экстракта эмбрионов 63
3.2. Анализ компонентов комплекса: 66
3.2.1. Результаты фингер-принтного анализа с использованием MALDI-TOF масс-спектроскопии 66
3.2.2. Коиммунопреципитация компонентов комплекса 68
3.2.3. Истощение 69
3.3. Иммуноокрашивание политенных хромосом 70
3.4. Распределение компонентов комплекса на промоторе и кодирующей области SAYP-зависимых генов 71
3.5. Влияние «нокдаунов» компонентов комплекса на связывание общего комплекса с промоторами SAYP-зависимых генов: 72
3.5.1. Влияние «нокдауна» SAYP на распределение компонентов TFIID и РВАР на промоторах SAYP-зависимых генов 72
3.5.2. Влияние «нокдауна» ВАР 170 на распределение SAYP и компонентов комплексов TFIID и РВАР на промоторах SAYP-зависимых генов
3.5.3. Влияние «нокдауна» TAF4 на распределение SAYP и компонентов 74
TFIID и РВАР на промоторах SAYP-зависимых генов
4. Обсуждение результатов 76
Выводы 78
Благодарности
Список литературы
- Нуклеосомная организация промотора
- Структура TFIID
- Домены, опосредующие белковые взаимодействия
- Штаммы и вектора Е. Coli
Введение к работе
Живые организмы — сложно организованные системы, способные хранить и передавать потомкам свою генетическую информацию. Принципы и механизмы реализации наследственной информации интересуют исследователей с момента открытия основного постулата молекулярной биологии (ДНК<>РНК=>белок). Генетическая информация о структуре отдельных белков и нуклеиновых кислот у всех организмов заключена в молекулах ДНК или РНК в виде последовательностей нуклеотидов, называемых генами. Координированная работа (экспрессия) большого числа генов возможна лишь благодаря наличию тонких регуляторных механизмов, определяющих место, время и уровень экспрессии конкретного гена или группы генов.
Экспрессия генов в эукариотической клетке представляет собой сложный
многостадийный процесс, включающий. в себя: транскрипцию генов (переписывание
генетической информации с ДНК на специальные матричные РНК (мРНК)), процессинг
и сплайсинг мРНК (модификации мРНК и удаление избыточных частей
последовательностей мРНК), экспорт упакованных мРНК из ядра в цитоплазму,
трансляцию (построение на основе мРНК белковой последовательности) и
посттрансляционные модификации белков. Важнейшим этапом является транскрипция,
осуществляемая главным ферментом ДНК-зависимой РНК-полимеразой и
многочисленными регуляторными белками - факторами транскрипции. Факторы
транскрипции взаимодействуют с регуляторными нуклеотидными
последовательностями генов, друг с другом, с молекулами РНК-полимеразы и необходимы для правильного узнавания транскрипционным комплексом регуляторных последовательностей в составе генов, а их координированная работа приводит к повышению или понижению уровня или активации транскрипции соответствующих генов при ответе клеток на внешние или внутренние регуляторные сигналы.
В эукариотической клетке ДНК всегда связана с белками и организована в хроматин, который находится в различных состояниях, отличающихся степенью компактизации и транскрипционной активностью. Степень компактизации хроматина определяет доступность регуляторных элементов действию транскрипционных факторов, а соответственно, и транскрипционную активность. Существуют разнообразные коактиваторы транскрипции, которые в ответ на действие активаторов способны изменять строение хроматина и структурировать ДНК-матрицу для инициации транскрипции и функционирования транскрипционного комплекса. Одними из коактиваторов транскрипции являются хроматин-ремоделирующие комплексы.
Нуклеосомная организация промотора
Вся ДНК в ядре эукариотической клетки связана с белками и образует высокоструктурированный нуклео-белковый комплекс - хроматин. Единицей хроматина является нуклеосома, представляющая собой фрагмент ДНК длиной 147 п.н., обвивающая белковый комплекс на 1,65 оборота, состоящий из восьми белков -гистонов. Гомодимеры гистонов НЗ и Н4 составляют коровую часть белков нуклеосомы, а гомодимеры - Н2А и Н2В расположены ближе к поверхности нуклеосомы. ДНК нековалентно связана с гистонами в 14 точках (Luger, et al, 1997). Структура хроматина и организация нуклеосом способствуют сокращению расстояния между отдельными регуляторными последовательностями промотора и их упорядочиванию при взаимодействии с позитивными и негативными регуляторными транскрипционными кофакторами. Однако вместе с тем подобная нуклеосомная организация промотора препятствует связыванию регуляторных транскрипционных факторов с соответствующими последовательностями ДНК промоторов. Более того, изменение активности генов зачастую сопровождается изменением нуклеосомной организации промоторов, например, повышением чувствительности к ДНК-нуклеазам (Montecino, et al, 2007).
Нуклеосомы расположены неравномерно и не имеют постоянного положения на промоторах. Плотность нуклеосом на промоторах обратно пропорциональна транскрипционной активности соответствующих генов (Lee, et al., 2004). Например, на промоторах молчащих, но потенциально способных активироваться генах, имеются участки до 200 п.н., свободных от нуклеосом (Yuan, et al, 2005). Эти участки известны как сайты, гиперчувствительные к ДНК-нуклеазам и сайты, связанные с транскрипционными факторами. Нуклеосомы, фланкирующие подобные свободные участки, имеют некоторые особенности: обычно они деацетилированы и часто в их состав входит вариант гистона H2A.Z (Raisner, et al, 2005) (гомолог Шгідрожжей). Существуют и другие варианты гистонов, отличающиеся от канонических своими «хвостами» (МасгоША), коровой частью (H2ABbd) или даже некоторыми ключевыми аминокислотными остатками (НЗ.З). Варианты гистонов экспрессируются вне S фазы клеточного цикла и включаются в хроматин пострепликативно. Например, вариант гистона H2A.Z замещает нормальный гистон Н2А в нуклеосоме либо посредством АТФ-зависимой реакции обмена гистона, либо с помощью гистонового шаперона Napl после репликации (Park, et al, 2005). Также было показано, что в геноме дрозофилы активация транскрипции может приводить к замещению и удалению варианта НЗ.З из нуклеосом (Schwartz, et al, 2005). Какую же роль играют варианты гистонов при регуляции транскрипции? Структура варианта гистона H2A.Z такова, что он легче уходит из хроматина, чем сам гистон Н2А. Димер H2A.Z-H2B менее стабилен, чем димер Н2А-Н2В, и соответственно, нуклеосомы, содержащие H2A.Z, менее стабильны, и быстрее смещаются при ремоделировании промоторов (Placek, et al, 2005). Кроме того, нуклеосомы, содержащие H2A.Z, способствуют связыванию ТВР с ТАТА-элементом промотора (Li., et al, 2007). Варианты гистонов способны участвовать в активации и регуляции транскрипции за счет того, что они могут специфично узнаваться соответствующими факторами. Но вместе с этим гистоновые белки и их варианты достаточно консервативны и имеют одинаковые сайты, по которым происходят модификации, поэтому варианты гистонов зачастую не влияют на связывание с хроматином регуляторных транскрипционных факторов (Li., et al, 2007).
На сегодняшний момент не выявлено конкретных специфических последовательностей ДНК, которые образовывали бы стабильные нуклеосомы, но последовательности обогащенные дублетами АА, или триплетами AAA, или триплетами CTG повторяющимися каждые 10-11 п.н. более склонны связываться с гистонами. Так же как и существуют некоторые параметры последовательностей, которые чаще встречаются в несвязанном с гистонами варианте. Это короткие последовательности аденинов (Аіб) или длинные повторы триплетов CCG , или TGGA, или [(G/C)3NN]„ мотивы (Montecino., et al., 2008). Специфические последовательности, с которыми связываются транскрипционные факторы, могут быть как в составе свободной, так и связанной с нуклеосомами ДНК. Однако, согласно существующим математическим моделям специфические сайты связывания чаще всего либо не связаны с нуклеосомами, либо находятся в составе менее стабильных нуклеосом (Richmond, 2006).
Ранее предполагали, что нуклеосомы и транскрипционные факторы конкурируют за связывание с ДНК в процессе репликации. Как было показано в более поздних исследованиях, этот механизм может осуществляться для некоторых промоторов (Barton and Crowe, 2001). Однако для большинства промоторов существует альтернативный механизм, в процессе которого замещение нуклеосом транскрипционными факторами индуцируется с помощью дополнительных активаторов. Как, например, было показано для промотора гена РН05. Активатор Pho4 связывался с соответствующим сайтом на промоторе РН05, затем туда же привлекался гистон-ацетилтрансферазный комплекс NuA4, в результате работы которого нуклеосомы ацетилировались, что в свою очередь способствовало замещению их транскрипционными факторами (Nourani, et al., 2004).
Структура TFIID
В клетках дрожжей RSC комплекс более распространен, чем ySWI/SNF комплекс и играет более общую роль в контроле хроматина. В клетках человека, наоборот, BAF более распространен, чем PBAF. В клетках дрозофилы примерно одинаковое количество обоих комплексов (ВАР и РВАР) связывают сайты на политенных хромосомах (Mohrmaim, at al., 2004). Это говорит о том, что комплексы ВАР и BAF подсемейства более широко используются в клетках высших эукариот, чем SWI/SNF у дрожжей. Иммунолокализация субъединиц OSA и Polybromo, как маркеров соответствующих комплексов ВАР и РВАР, на политенных хромосомах дрозофилы стадии личинки выявило разное, но частично перекрывающееся распределение комплексов. То есть некоторые локусы соответствовали только OSA, некоторые только Polybromo, иногда локусы перекрывались. Таким образом, некоторые гены могут контролироваться исключительно ВАР или РВАР комплексами, а для регуляции других генов необходимы оба BRM комплекса (Mohrmarm, et al., 2005).
BRM комплекс дрозофилы вероятно участвует в транскрипции большинства генов, так как был найден в почти всех транскрипционно активных сайтах хроматина политенных хромосом (Armstrong, et al., 2002). В противоположность этому транскрипционный репрессор Polycomb (Рс) обнаружен в сайтах неактивного гипоацетилированного хроматина, в которых не было BRM. Эти исследования отражают общую роль ремоделирующих комплексов SWI/SNF в транскрипции генов и тесную связь между модуляцией хроматина АТФ-зависимыми ремоделирующими комплексами и ферментами, катализирующими ковалентные модификации белков (Narlikar, et al., 2002).
Субъединицы Brahma, Moira, OSA первоначально были обнаружены в результате скрининга доминантных супрессоров Рс мутаций и затем классифицированы как белки группы триторакс (trxG). Белки-активаторы группы trxG вместе с их антагонистами — белками-репрессорами группы Polycomb (PcG) поддерживают правильную экспрессию многих регуляторов развития (Simon and Tarnkun, 2002). Исследования показывают, что ВАР и РВАР комплексы функционируют не как единые компоненты, а отдельные субъединицы, входящие в их состав выполняют специальные функции. В противоположность белкам PcG, которые репрессируют ограниченный пул генов, BRM необходимы для экспрессии генов в целом. Репрессия генов белками PcG частично может происходить за счет блокирования ремоделирующей способности BRM комплексов (King, et al., 2002).
Для того чтобы выяснить значение субъединиц в SWI/SNF комплексах, был проведен эксперимент по нок-дауну каждой из субъединиц. В результате которого было показано, что Brahma и Moira являются важными структурными компонентами для сборки комплексов ВАР и РВАВ, однако их главная структурная часть в основном не функциональна в клетке. Для нормальной работы комплексов необходимы субъединицы OS А, ВАР 170, Polybromo. Похоже, что оба комплекса ВАР и РВАР работают в клетке как холоферменты с общей коровой частью, выполняющей структурную и ферментативную функции, а специфические субъединицы OS А, ВАР 170, Polybromo определяют функциональную специфичность комплексов. ВАР и РВАР комплексы выполняют схожие, независимые или антагонистические функции в транскрипционном контроле и направляют большей частью разные биологические процессы.
Было показано, что ремоделирующий комплекс SWI/SNF способен активировать гены, например, ген string/cdc2, необходимый для прохождения клеткой стадии митоза -субъединица OSA направляет комплекс ВАР к промотору этого гена (Moshkin, et al., 2007). И вместе с этим комплекс SWI/SNF может принимать участие в умолкании и репрессии генов. Субъединицы Brgl, hBrm, Bafl55, входящие в состав SWI/SNF комплекса человека, способны взаимодействовать с mSin3a - компонентом другого комплекса Sin3, который участвует в репрессии транскрипции многих факторов, необходимых для регуляции клеточного цикла (Sif, et al, 2001; Sif, 2004; Giacinti and Giordano, 2006). Возможно, SWI/SNF комплекс изменяет структуру хроматина таким образом, что специфические факторы не способны связьшаться с ремоделированными нуклеосомами.
Было показано, что хроматин-ремоделирующие комплексы семейства SWI/SNF (SWI/SNF и RSC) функционируют, перенося гистоновый октамер с одного участка ДНК на другой (Owen-Hughes, et al., 1996; Lorch, et al., 1999). Очищенные АТФ-азы hBRM и BRG1 комплекса hSWI/SNF обладают такой же активностью. Перенос гистонового октамера из донорной нуклеосомы может осуществляться на цис- и на транс-.акцептор ДНК. (Phelan, et al., 2000). Возможно, комплексы SWI/SNF осуществляют этот перенос с помощью разных механизмов.
Для SWI/SNF комплекса дрожжей было показано, что перемещение нуклеосомы в цис-положение может происходить по механизму «скольжение» (sliding) (Whitehouse, et al., 1999). Этот механизм подразумевает, что количество входных шагов ДНК, на которые переместилась нуклеосома, эквивалентно количеству выходных шагов, произведенных в одном направлении. То есть ДНК, которая до ремоделирования взаимодействовала с гистоновым октамером, после «скольжения» стала «свободной». При «скольжении» происходит нарушение взаимодействий ДНК с гистонами. Возможно, ремоделирующий комплекс способствует разрыву сразу одновременно всех контактов ДНК с гистонами.
Домены, опосредующие белковые взаимодействия
Колонию, выросшую на чашке, сеяли в 5мл среды 2YT и растили 16-24 часа при 37С. 3 мл культуры (последовательно по 1,5 мл) помещали в 1,7 мл пробирку, центрифугировали (13000 об/мин, 30 мин), удаляли супернатант. Ресуспендировали осадок в 200 мкл раствора (50 гпМ глюкозы; 25 тМ Трис-НС1, рН8.0; 10 тМ ЭДТА). Добавляли 400 мкл раствора (0,2 N NaOH; 1% SDS), мягко смешивали, инкубировали во льду 5 мин. Добавляли 200 мкл холодного ЮМ CH3COONH4, мягко смешивали, инкубировали во льду 15 мин, центрифугировали (13000 об/мин, 10 мин). Супернатант переносили в пробирку с 500 мкл изопропанола, смешивали и выдерживали, помешивая, при комнатной температуре до образования осадка. Центрифугировали (4000 об/мин, 5 мин). Растворяли осадок в 200 мкл 2М CH3COONH4, центрифугировали (13000 об/мин, 5мин). Супернатант переносили в пробирку с 200 мкл изопропанола, смешивали и выдерживали, помешивая, при комнатной температуре до образования осадка, центрифугировали (13000 об/мин, 10 мин). Осадок промывали 70% этанолом, подсушивали 10 мин при комнатной температуре и растворяли в 50 мкл воды. 2.3.4.0бработка ферментами рестрикции
Реакции проводили в соответствующих буферах с добавлением 5 ед. фермента на 1 мкг ДНК и инкубировали при температуре 37С от 30 мин до 2 ч.
Реакцию проводили в лигазном буфере с АТФ (Fermentas) с добавлением 1-5 ед. ДНК-лигазы фага Т4 (Fermentas). На реакцию брали 1-7 мкг/мл ДНК. Соотношение молярных количеств вектора и вставки выбирали в соответствии с конкретньм экспериментом. Реакцию вели 2-4 ч при комнатной температуре или 24 ч при +4С.
Готовили раствор А (0,1 М Трис-HCl, рН 9.0; 0.1 М ЭДТА; 1% ДЭПК). Непосредственно перед выделением ДНК готовили рабочий раствор (9/10 V раствора А + 1/10 V 10% SDS). Замаривали эфиром 60 — 120 мух, помещали их в пластиковую 1,5 мл пробирку, добавляли 500 мкл рабочего раствора и гомогенизировали мух при помощи пестика. Инкубировали гомогенат 1 ч при 65С, добавляли 72 мкл СНзСООК, перемешивали, инкубировали во льду 30 мин и осаждали остатки мух центрифугированием (14000 об/мин, 5 мин). Супернатант переносили в новую пробирку, добавляли равный объем хлороформа, тщательно перемешивали и центрифугировали (14000 об/мин, 5-10 мин). Верхнюю фазу переносили в новую пробирку. Осаждали ДНК равным объёмом изопропанола, промывали 75% этанолом и растворяли в воде. 2.3.7.Гель-электрофорез ДНК
Для разделения фрагментов ДНК использовался 1% агарозный гель и 5% полиакриламидный гель. Электрофорез проводили в буферах IxTAE (2М Трис-НС1; 0,05М ЭДТА) и ІхТВЕ (89 mM Трис-HCl; 89mM Н2В04; 2тМ ЭДТА), соответственно.
Для PCR использовали 10х PCR-буфер следующего состава: 0.1 М Tris-HCl, рН 8,6, 0,5 М КС1,25 мМ MgCl2,1 % Triton Х-100. Реакцию проводили в 1х PCR-буфере с добавлением dNTPs до 0,1 мМ, праймеров до 0,2 мкМ, полимеразы Taq/Pfu (10:1) до 0.05 ед/мкл, 50нг ДНК. 2.3.9.Секвенирование ДНК Секвенирование проводили на автоматическом секвенаторе фирмы Applied Biosystems 373А.
Двухцепочечные РНК синтезировали с геномной ДНК при помощи Ambion MEGA script Т7 kit. Для синтеза использовали следующие праймеры: дцРНК для РНК интерференции TAF1 - TAF1 dsRNA_for и ТАЕ1 dsRNA_rev, дцРНК для РНК интерференции TAF4 - TAF4 dsRNA_for и TAF4 dsRNArev, , дцРНК для РНК интерференции ВАР 170 - ВАР 170 dsRNA_for и ВАР 170 dsRNA_rev, для контроля использовали дцРНК, соответствующая фрагменту вектора pBSK - pBluescript П (pSK, negative control) dsRNA_for и pBluescript II (pSK, negative control) dsRNA_rev. 2.5. Работа с белками
Для экспрессии рекомбинантных белков соответствующими конструкциями трансформировали клетки Zi. coli BL21. Выросшими колониями инокулировали среду 2YT (ампицилин 50 мг/мл) и растили клетки до оптической плотности СЮбоо=0.6 с покачиванием при температуре 30С. Затем индуцировали экспрессию белка добавлением в среду IPTG до концентрации 0.1-1 мМ. Экспрессию проводили в течение ночи. Клетки осаждали центрифугированием, осадок хранили при -20С.
Из клеточных лизатов при помощи Ni-NTA агарозы выделяли рекомбинатные белки с гистидиновым тагом. Сначала клеточный осадок, полученный из 500 мл среды, ресуспендировали в 25 мл LB (50 мМ NaP; рН8.0, 300 мМ NaCl, 10 мМ имидазол). Затем добавляли лизоцим до 0.4 мг/мл, инкубировали 30 мин. во льду, обрабатывали ультразвуком, центрифугировали 30 мин. на 12000 об/мин, супернатант наносили на колонку с 1 мл Ni-NTA агарозы, инкубировали 1 ч при 4С. Отмывали смолу от несвязавшихся белков 10 мл WB (50 мМ NaPj рН 8.0, 300 мМ NaCl, 20 мМ имидазол). Элюировали связавшиеся с Ni-NTA агарозой белки в подходящем объеме ЕВ (50 мМ NaPj рН8.0, 300 мМ NaCl, 250 мМ имидазол). Фракции, содержащие белок диализовали против PBS (1.7 мМ КН2Р04, 5.2 мМ Na2HP04 150 мМ NaCl) + 20 % глицерин. В случае нерастворимого белка р2 осадок после лизиса клеток промывали, растворяли в буфере UB (8М мочевина, 100 мМ NaH2P04, ЮмМ Tris, рН 8.0, ЮмМ имидазол), далее очищали по той же процедуре с использованием буфера UB с добавлением имидазола.
Штаммы и вектора Е. Coli
Для исследования функций SAYP и других компонентов общего комплекса in vivo в хроматине также были проведены эксперименты по хроматиниммунопреципитации (СЫР) с последующим анализом количественной ПЦР. В процессе эксперимента была изучена способность компонентов комплекса привлекаться на промоторы SAYP-зависимых генов. SAYP-зависимые гены (CGJJ395, CG11400, and globinl) - гены экспрессия которых понижается в 7-10 раз после «нокаута» SAYP с помощью РНК-интерференции в S2 клетках (данные были любезно предоставлены P. Verrijzer). В результате СЫР с помощью специфических антител к SAYP, субъединицам TFIID (TAF1 и ТВР) и субъединицам РВАР (ВАР 170, РВ и MOR) выявили, что все компоненты общего комплекса стабильно связываются с промоторной областью гена (ПР) и в значительно меньшей степени с кодирующей областью (КО) (рис. 11). верхняя панель - схема SAYP-зависимого гена CG11395 показаны участки гена на промоторной области (ПО) и кодирующей области (КО), использовавшиеся для количественной ПЦР. Нижняя панель - SAYP, TFIID и РВАР связываются предпочтительнее с промоторной областью гена. Уровень SAYP, субъединиц TFIID (ТВР и TAF1) и субъединиц РВАР (ВАР 170, РВ, MOR) комплексов на промоторе (синие столбики) и кодирующей области (серые столбики) гена CG11395 измерялся с помощью СЫР. Все результаты СЫР даны в виде обогащения относительно рДНК.
С помощью РНК-интерференции был проведен отдельно «нокдаун» каждого из компонентов общего суперкомплекса в S2 клетках и также методом СЫР с последующим анализом количественной ПЦР изучена способность SAYP и комплексов TFIID и РВАР привлекаться на промоторы CG11395, CGJ1400 и globinl генов.
В результате «нокдауна» SAYP происходит значительное падение уровня компонентов комплексов TFIID (TAFl и ТВР) и РВАР (ВАР 170, РВ и MOR) на промоторах всех трех генов (рис. 12). «Нокдаун» SAYP не влияет на общий уровень ТВР и TAF s в S2ioieTKax - количество субъединиц комплекса остается прежним, что видно из результатов Вестерн-блот анализа (рис. 13а). Однако в результате нокаута SAYP уменьшался общий уровень субъединиц РВ и ВАР 170 комплекса РВАР в клетках (рис. 13а), что несомненно влияло на привлечение РВАР к промоторным областям в хроматине. Таким образом, можно утверждать, что TFIID комплекс не может связываться с промоторными участками SAYP-зависимых генов в отсутствие SAYP и комплекса РВАР.
В качестве отрицательного контроля рассматривали связывание компонентов комплекса с промотором гена Hsp70, который не является SAYP-зависимым геном, и SAYP в нормальных S2 клетках не обнаруживается на его промоторах, что и было подтверждено с помощью СЫР (рис. 14). «Нокдаун» SAYP не влиял на уровень TFIID на промоторе Hsp70. Уровень компонентов РВАР немного падает, так как падает общее содержание РВАР в клетке (рис. 14) после интерференции SAYP (рис. 13,а).
При «нокдауне» субъединицы ВАР 170 комплекса РВАР происходит значительное падение уровня SAYP и субъединиц комплекса TFIID на промоторах SAYP-зависимых генов (рис. 12). В то же время общий уровень субъединиц комплексов РВАР и TFIID в S2 клетках уменьшался, но общий уровень SAYP оставался прежним (рис. 13а). Из этого можно сделать вывод, что свободный SAYP не привлекается на промоторы в отсутствие комплексов РВАР и TFIID. РНК-интерференция TAF4 также оказывала сильный отрицательный эффект на связывание РВАР и SAYP с промоторами SAYP-зависимых генов (рис.12). Как и ожидалось, «нокдаун» TAF4 приводил к разрушению комплекса TFIID (Wright et al, 2006), не влияя на общий уровень SAYP и РВАР (рис. 13а). При этом SAYP оставался в клетке в связанном с РВАР состоянии (рис. 136), однако этот комплекс (РВАР & SAYP) без TFIID не способен стабильно ассоциировать с промоторами SAYP-зависимых генов. Этот результат наиболее важен, так как согласно модели последовательного привлечения транскрипционных факторов на промотор, ремоделирующий комплекс должен первым ассоциировать с промотором независимо от других.
