Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ОВ3ОР ЛИТЕРАТУРЫ
I.I. Нуклеиново-белковые взаимодействия в составе палочковидных вирусов растений 7
1.1.1. Структура палочковидных вирусов группы ВТМ 8
1.1.2. Оптические характеристики внутри- вирусной РНК ВТМ 18
I.I.S. Механизмы самосборки вируса табачной мозаики 27
I.I.4. Действие формальдегида на палочковидные вирусы и возможность образования "формальдегидных" РЖ-белковых сшивок 49
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 56
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ
3.1. Спектры КД ряда вирусов группы ВТМ и ихвнутривирусных РЖ
3.1.1. Характеристика препаратов используемых вирусов 77
3.1.2. Спектры КД цельных вирусов 81
3.1.3. Спектры КД вирусных белков 83
3.1.4. Спектры КД внутривирусных РЖ 88
3.2. Сшивание РЖ ВТМ с бежом в "SOS "-РНП частицах 92
3.2.1. Характеристика "30S "-РНП частиц
а) зависимость эффективности образования РНП от условий сборки... 94
б) спектры поглощения и круговогообзора дихроизма "30 s "-РНП 98
в) Равновесное центрифугирование препаратов"30 s "-РНЇЇ в градиенте плавучей плотности
солеи тяжелых металлов ( Cs2so4 и CsCi ) 102
г) Действие РНК-азы на фрагменты РНК в
составе "30 s "-РНП 104
д) Влияние рН на стабильность "30s "-РНП 105
е) Электронная микроскопия препаратов "30s"-PHn 106
ж) Антигенные характеристики "30 s "-РНП 108
3.2.2. Сшивание РНК ВТМ с белком в составе "30 s"-РНЇЇ под действием формальдегида
а) Кинетика сшивания РНК с белком в составе"30S"-PffiI под действием формальдегида...
б) Центрифугирование обработанных формальдегидом "30 s"-РНП в градиенте плотности
в) Электрофорез формалинизировэнного "30 sn-РНП в полиакриламидном геле 117
г) Гель-фильтрация формалинизированного"30s"-PHn 120
ГЛАВА 4. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ
4.1. Оптическая активность РЖ в частицах палочковидных вирусов 123
4.2. Характеристика "30 s "-частиц 128
4.3. Возможность сшивания РНК с белком в составе "30 s''-частиц 133
ВЫВОДЫ 137
ЛИТЕРАТУРА 139
- Нуклеиново-белковые взаимодействия в составе палочковидных вирусов растений
- МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ
- Спектры КД ряда вирусов группы ВТМ и ихвнутривирусных РЖ
- Оптическая активность РЖ в частицах палочковидных вирусов
Введение к работе
Исследование структуры нуклеиновых кислот и природы нуклеи-ново-белковых взаимодействий в составе нуклеопротеидов преобре-тают в последние годы все более широкий размах и становятся одной из важнейших областей современной молекулярной биологии. Одним из наиболее удобных объектов для такого рода исследований являются спиральные РНК - содержащие вирусы растений. Результаты, полученные в процессе изучения оптических свойств РНК в частицах этих вирусов, позволили высказать предположение, что специфические РНК-белковые взашлодействия играют важную роль в определении структуры РНК in situ,npH4eM, в такого рода взаимодействиях, по всей вероятности, должны участвовать основания внутривирусной РНК. Конкретная природа РНК-белковых взаимодействий в частицах вирусов этой группы остается, однако, до сих пор невыясненной.
Кроме того, остается неизвестным и характер индуцируемых РНК изменений в структуре белковых субъединиц в ходе сборки вируса (особенно на стадии инициации). В этой связи весьма полезными могли бы оказаться результаты экспериментов по сшиванию оснований внутривирусной РЖ с белком, которые могли бы помочь в выяснении природы функциональных групп, участвующих в РНК-белковых взаимодействиях. Однако высокая "плотность" упаковки белковой оболочки ВТМ до настоящего времени препятствовала успешному сшиванию оснований внутривирусной РЖ ВТМ с белком / 15 /. В 1975 году в лаборатории И.Г.Атабекова были получены и исследованы короткие "SO s''-рибонуклеопротеидные частицы ("SOs''-РНП), представляющие собой продукт "одевания" белком ВТМ коротких (50-80 нуклеотидов) 3S -фрагментов РЖ / 187 /. В данной работе подобные короткие "30S"-PIffi и были использованы для сшивания РЖ - 5 -ВТМ с белком оболочки с помощью формальдегида.
Основная цель первой части работы состояла в определении возможных причин, лежащих в основе аномально высокой оптической активности внутривирусной РНК ВТМ и проверке гипотезы об участии остатков триптофана во взаимодействии с основаниями РНК in situ путем сравнения оптической активности РНК в частицах разных вирусов группы ВТМ, отличающихся по содержанию и локализации остатков триптофана в белке оболочки. В задачу исследований также входило получение сшивки между РНК и белком оболочки ВТМ под действием формальдегида в составе ВТМ-подобного " 30S "-РНП.
В данной работе впервые определены спектры кругового дихроизма для целого ряда вирусов группы ВТМ (штаммы Uj, и2, НЕ , вирус мозаики долихоса и вирус огурцов 4) и их белков оболочки в разных агрегационных состояниях. Полученные спектры были использованы для расчета разностных спектров КД внутривирусных РНК исследуемых вирусов. В результате было показано, что все эти вирусы существенно отличаются по характеру оптической активности внутриврфусных РНК и, эти различия скорее всего определяются конкретной природой РНК-белковых взаимодействий в частицах каждого из изучаемых вирусов. Оказалось однако, что вопреки высказывавшимся рядом авторов предположениям, остатки триптофана вирусного белка оболочки не играют существенной роли в определении оптической активности внутривирусной РНК.
В работе исследовали также ряд свойств коротких " 30S "-РНП, содержащих фрагменты РНК ВТМ длиной 25-40 нуклеотидов. С помощью ряда методов показано, что связывание коротких фрагментов РНК с дисками белка ВТМ носит специфический характер и, что короткие фрагменты РБК способны индуцировать специфические дислокационные перестройки в субъединицах белка ВТМ. Показана возможность сши- вания РЖ с бежом в составе таких коротких " 30s "-РНП прочными связями,скорее всего ковалентной природы.
Нуклеиново-белковые взаимодействия в составе палочковидных вирусов растений
Проблема нуклеиново-белковых взаимодействий является одной из фундаментальных проблем в современной молекулярной биологии. Данный обзор посвящен рассмотрению природы нуклеиново-белковых взаимодействий в составе вирусов растений, обладающих жесткой палочковидной структурой. Частицы всех известных в настоящее время вирусов этой группы построены на основе ротационно-трансля-ционного типа симметрии и содержат одноцепочную РНК. К палочковидным вирусам относятся вирус стеблевой пятнистости табака, вирус штриховатой мозаики ячменя и ряд других вирусов растений. Но практически все имеющиеся на сегодня данные о структуре вирионов и характере РНК-белковых взаимодействий получены на типовом представителе этой группы-вирусе табачной мозаики (ВТМ) и близкородственных ему штаммах - и2, НЕ, вирусе коровьего гороха (Сс), вирусе огурцов 4 (В04) и других.
Вирусы группы ВТМ являются наиболее изученными представителями палочковидных вирусов благодаря легкости накопления их в растениях, а также возможности получения в значительном количестве в высокоочищенном состоянии, ВТМ, в частности, был первым идентифицированным вирусом; первым вирусом, полученным в очищенном состоянии / 172 /; на примере РБК ВТМ впервые был доказан факт инфекщюнности вирусных РНК / 90 /. Кроме того, ВТМ был первым вирусом, реконструированным in vitro из составляющих его компонентов - белка и РБК / 76 /, а также первым вирусом, для которого в начале 60-х годов была полностью определена первичнаяструктура бежа оболочки / 25,185 /.
Материалы и методы
Для накопления вируса табачной мозаики штаммов Uj, Ug и НЕ. использовали растения Nicotiana tabacum var. Samsun для накопления вируса огурцов - растения CucumLs sativus и для накопления вируса мозаика долихоса - растения Phaseoius vulgaris Препаративное выделение вирусов проводили по общей методике с некоторыми модификациями для отдельных вирусов / 12,174 /. Предварительно замороженные при -20С листья гомогенизировали в равном исходному весу растений объеме 0,1 М фосфатного буфера рН 7,5 (для экстракции НЕ использовали 0,01 М боратный буфер рН 9,1, который при смешивании с растительным соком подкислялся до рН 7,5; для экстракции ВО-4 - 0,01 М фосфатный буфер рН 7,2). Клеточный сок отфильтровывали через плотную ткань и осветляли низкоскоростным центрифугированием (10 минут,5000 об/мин). Для удаления клеточных пигментов и других балластных веществ супернатант эмульгировали с хлороформом (1/8 объема) в течение 20 минут и подвергали низкоскоростному центрифугированию (10 минут,5000 об/глин). Водную фазу отбирали и вирус осаждали сульфатом аммония. Для этого к экстракту добавляли сухой сульфат аммония до 25% насыщения и раствор оставляли на ночь на холоду. Для концентрирования В04 использовали осаждение в изоэлектрической точке рН 4,5 / 6 /. Вирус, осажденный центрифугированием (20 минут, 6000 об/мин), суспендировали в 0,01 М фосфатном буфере рН 7,5 и осветляли (20 минут, 6000 об/мин).
Следующим этапом очистки являлось дифференциальное центрифугирование (1,5 часа при SO тыс.об/мин на центрифугеV ас-40, последующее ресуспендирование в буфере и 20-минутное центрифугирование при 16 тыс,об/мин). Для очистки и концентрирования препаратов вирусов и j, Щ В04 и ВМД проводили три цикла дифференциального центрифугирования. В случае же и 2» препараты которого оказывались более загрязненными растительными пигментами, дифференциальное центрифугирование повторяли 4-5 раз и, кроме того, вирус пропускали через колонку с 3% гранулированным агаром и концентрировали ультрацентрифугированием.
Спектры КД ряда вирусов группы ВТМ и ихвнутривирусных РЖ
Спектры КД в ультрафиолетовой области за последние 10 лет стали одной из важнейших характеристик белков и нуклеиновых кислот. И хотя для нуклеиновых кислот количественная теория спектров КД до сих пор отсутствует, использование этого метода в целом ряде случаев позволило получить важную информацию о структуре ДНК и РНК в растворе и в составе нуклеопротеидов различной природы.
Как уже говорилось в "Обзоре литературы" даже первые измерения спектров КД ВТМ / 145 / показали, что оптическая активность внутривирусной РНК должна резко отличаться от оптической активности свободной РНК в растворе. С целью выяснения возможных причин этого различия мы измерили спектры КД ряда близкородственных ВТМ палочковидных вирусов. Все эти вирусы не отличаются от "дикого" ВТМ ( Uj ) по морфологии, но (в большей или меньшей степени) отличаются от него по последовательности аминокислот в белке оболочки. Поэтому сравнение спектров КД этих вирусов и их внутривирусных РНК могло пролить свет на природу факторов, определяющих специфический характер оптической активности внутривирусных РНК, и осуществить проверку некоторых ранее высказывавшихся на этот счет предположений.
Оптическая активность РЖ в частицах палочковидных вирусов
Как уже говорилось в разделе "Обзор литературы", результаты изучения структуры РНК в составе ВТМ с помощью методов ДОВ и КД показали, что РНК ВТМ їй. situ обладает аномально высокой оптической активностью в области 250-350 нм по сравнению со свободной РНК этого вируса. Согласно предположению, впервые высказанному Симмонсом и Блаутом / 169 / (а затем и рядом других авторов), необычайно высокая амплитуда пиков ДОВ ВТМ объясняется жесткой] ориентацией оснований, возникающей, вероятно, за счет взаимодействий с белком. Другое объяснение причин данного явления было дано Бушем и Шерагой / 37 /. По мнению этих авторов, а также Ченга / 56 / в основе высокой оптической активности РНК in situ лежит наличие у внутривирусно й РНК ВТМ жестко фиксированной, так называемой "низкотемпературной" стопки оснований. Кроме того, Ченг предположил, что в вирусе возникает "смешанная" стопка, состоящая из оснований РНК и остатков триптофана вирусного белка оболочки.
С целью изучения происхождения аномально высокой оптической активности внутривирусной РНК ВТМ и возможной роли остатков триптофана в этом явлении мы исследовали спектры КД нескольких штаммов ВТМ ( Uj, и2, HR, ВМД и В04), отличающихся друг от друга среди прочего и по содержанию и локализации триптофана в белке оболочки, а также спектры КД белков этих вирусов, находящихся в различных агреганионных состояниях (А-белок и ВПБА).
Оказалось, что спектры КД всех исследованных вирусов сходны по форме, но отличаются по интенсивности положительной полосы в районе 272 нм, причем эти отличия на первый взгляд коррелируют с-числом остатков триптофана в белке (см.рис.5). Так, "дикий" штамм ВТМ, содержащий по три остатка триптофана на белковую субъединицу, обладает наибольшей по величине макс. 8» о»е.); штампе и и НИ, содержащие по два остатка триптофана,характеризуются несколько меньшей величиной Лмакс (15,1 о.е. и 16,7 о.е.) и, наконец, ВМД и В04, содержащие по одному остатку триптофана, обладают наименьшей величиной ЛЄ макс# (10,8 о.е. и 9,9 о.е.). Однако при измерении спектров КД белков (А-белка и БПБА) исследованных вирусов было обнаружено, что они сильно отличаются друг от друга как по форме, так и по интенсивности полос. Несмотря на то, что вклад белка в спектры КД цельных вирусов в зоне 250-350 нм не слишком значителен, все же им нельзя пренебрегать при сравнении этих спектров.
