Введение к работе
Актуальность проблемы
Изучение структуры вирионов фитовирусов и вирусных белков оболочки, а также возможностей их модификации и структурной перестройки является важной задачей современной молекулярной вирусологии. Структурная модификация частиц вирусов растений может быть не только направлением защиты сельскохозяйственных растений, но также открывает возможности создания новых биотехнологий в медицине и ветеринарии.
Вирусы и вирусоподобные частицы (макромолекулярные структуры белка оболочки вируса, не содержащие геном) широко применяют для разработки новых подходов в создании вакцин и бионеорганических комплексов, а также в адресной доставке целевых веществ и в биоконтрастировании. При этом вирусы растений обладают безусловным преимуществом при получении новых функциональных и биологически активных материалов, в частности кандидатных вакцин, так как они не патогенны для млекопитающих, в том числе для человека. Большинство современных вакцин создаются на основе ослабленных и инактивированных форм инфекционных агентов. Живые вакцины обладают высокой протективной активностью, однако при этом остается возможность их реверсии к патогенной форме. Инактивированные вакцины значительно безопаснее, но для индукции эффективного иммунного ответа требуется несколько актов ревакцинации (Jennings and Bachman, 2008). Субъединичные вакцины, основанные на индивидуальных пептидах и белках инфекционного агента, более безопасны, но существует проблема их низкой иммуногенности. Связывание антигенов патогенов с высокомолекулярным носителем (платформой) может существенно повысить иммунный ответ и обеспечить защиту организма от инфекции (Lico et al., 2008).
Настоящая работа посвящена изучению структуры и свойств сферических частиц, образующихся при термической перестройке вируса табачной мозаики и его белка оболочки, и исследованию возможности их применения в качестве платформы для презентации биологически активных молекул, в частности антигенов инфекционных агентов человека, животных и растений.
Цели и задачи исследования
Целями данной работы являлись отработка условий получения и характеристика сферических частиц (СЧ), формирующихся в процессе термической перестройки вируса табачной мозаики (ВТМ), а также создание и изучение свойств комплексов СЧ с биологическими активными молекулами.
Для достижения поставленных целей решались следующие основные задачи: 1. Исследование условий образования СЧ из вириона и белка оболочки (БО) ВТМ.
-
Изучение свойств СЧ с использованием физико-химических, иммунохимических и иммунологических методов.
-
Проведение сравнительного анализа структурных различий белка в составе нативного вируса и сферических частиц.
-
Изучение адсорбционных свойств СЧ и возможности создания на их основе комплексов с белками различного аминокислотного состава и молекулярной массы, в частности с антигенами патогенов человека, животных и растений.
-
Исследование антигенных и иммуногенных свойств композиций СЧ-целевой белок.
-
Изучение адъювантных свойств СЧ.
Научная новизна и практическая ценность работы
Все результаты, представленные в настоящей диссертационной работе, получены впервые.
Показано, что при нагревании ВТМ до 94С происходит денатурация БО, и формируются сферические частицы контролируемого размера и свободные от вирусной РНК. Обнаружено, что СЧ могут быть получены из различных форм БО ВТМ, не содержащих генетический материал вируса. Продемонстрирована высокая стабильность, иммуногенность и биодеградируемость СЧ. Показано, что СЧ уникальны по своей структуре и не имеют аналогов среди вирусов и других биологических объектов.
С использованием ряда физико-химических методов получены данные о структурных различиях БО ВТМ в составе нативного вируса и белка в составе сферических частиц.
Впервые показано, что СЧ обладают уникальными адсорбционными свойствами. На основе СЧ in vitro созданы антигенно и иммуногенно активные комплексы с антигенными детерминантами патогенов человека, животных и растений, отличающихся по аминокислотному составу и размерам, в том числе с антигенами таких актуальных для медицины инфекционных агентов, как вирус гриппа и вирус краснухи. Продемонстрировано, что связанные с поверхностью СЧ чужеродные белки способны реагировать со специфическими антителами и, следовательно, сохраняют свои антигенные свойства в составе полученных комплексов. Установлено, что СЧ проявляют свойства эффективного адъюванта и активно стимулируют иммунный ответ на антиген, иммобилизованный на их поверхности.
Имуногенные комплексы, полученные на основе СЧ, могут быть использованы для создания кандидатных вакцин нового типа, которые будут полностью биобезопасными, так как они создаются на основе белковых структур фитовируса, а также для получения дешевых диагностических антител.
Апробация работы
Диссертация была апробирована на совместном заседании кафедры вирусологии биологического факультета и отдела биохимии вирусов растений НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского МГУ имени М.В. Ломоносова. Результаты диссертационной работы докладывались и обсуждались на семинарах кафедры вирусологии и на международных конференциях: на ХУІІ и ХХ Международных научных конференциях «Ломоносов» (Москва, 2010, 2013); на III и ІУ Международных форумах по нанотехнологиям (Москва, 2010, 2011); на У и УІ Международных конференциях «Современные достижения бионаноскопии» (Москва, 2011, 2012); на 36-м конгрессе Федерации европейского биохимического общества (FEBS) «Biochemistry for tomorrow's medicine» (Италия, 2011), на 2-й Международной школе «Наноматериалы и нанотехнологии в живых системах. Безопасность и Наномедицина» (Московская область, 2011); на Международной конференции «Фармацевтические и медицинские биотехнологии» (Москва, 2012); На 37-м конгрессе Федерации европейского биохимического общества (FEBS), объединенным с 22-м конгрессом Международного объединения биохимиков и молекулярных биологов (IUBMB), проходящим под общим названием «From Single Molecules to Systems Biology» (Испания, 2012); на УІІ Международном конгрессе «Биотехнология: состояние и перспективы развития» (Москва, 2013).
Личный вклад автора
Основные результаты получены при непосредственном участии автора в планировании и проведении экспериментов. Исследования с помощью метода рамановской спектроскопии проведены совместно с к.б.н. н.с. Е.Ю. Паршиной, кафедра биофизики биологического факультета МГУ имени М.В. Ломоносова. Исследования с помощью спектроскопии кругового дихроизма и флуоресцентной спектроскопии проводились совместно с к.б.н. м.н.с. В.В. Макаровым, к.х.н. с.н.с. А.Л. Ксенофонтовым, д.б.н. профессором Е.Н. Добровым, НИИ физико-химической биологии имени А.Н. Белозерского.
Публикации
По материалам диссертации опубликована 21 печатная работа. Из них статей в реферируемых журналах - 3, патентов РФ - 2, международных патентных заявок (PCT) - 1, материалов международных и российских конференций - 15.
Структура работы
Диссертация состоит из глав «Введение», «Обзор литературы», «Материалы и методы», «Результаты и обсуждение», «Заключение», «Выводы». Работа содержит список
цитируемой литературы ( ссылок), 40 рисунков, 3 таблицы. Общий объем диссертации
страниц.
