Содержание к диссертации
Стр.
Обозначения и сокращения 4
Введение 6
Обзор литературы 12
Краткая характеристика вируса натуральной оспы и вируса вакцины 12
Современное состояние вакцшюпрофилактики против натуральной ос- 16
Иммунная реакция на вакцинацию против оспы 25
Гепатит В - опасное вирусное заболевание 31
Вакцинопрофилактика гепатита В 32
Живые рекомбинантиые вакцины против гепатита В 36
Заключение 42
Материалы и методы 45
Результаты собственных исследований 52
Клинические испытания бивакципы оспы и гепатита В эмбриональной 52 живой рекомбипантной
Паспортизация и аттестация экспериментально-производственных серий 52
бивакципы
Выбор добровольцев для проведения клинических исследований бивак- 54 цины
-
Подбор претендентов в добровольцы 54
-
Формирование групп добровольцев 55 Изучение реактогенности, безопасности и специфической иммуногенно- 56 сти оральной бивакципы при однократной вакцинации волонтеров
-
Иммунизация бивакцииой дозой 6,9 lg ООЕ в условиях отдаленной ре- 56 вакцинации (группа 1)
-
Иммунизация бивакцииой дозой 7,6 Ig ООЕ в условиях отдаленной ре- 62 вакцинации (группа 2)
-
Иммунизация бивакцииой дозой 6,9 lg ООЕ в условиях первичной вак- 68 цинации (группа 3)
-
Иммунизация бивакцииой дозой 7,6 lg ООЕ в условиях первичной вак- 74 цинации (группа 4)
-
Исследование возможности усиления иммунного ответа к HBsAg при 80 однократной вакцинации бивакцииой
-
Обобщенные результаты изучения реактогенности, безопасности и спе- 82 цифической иммуногенпости оральной бивакципы на добровольцах групп 1 -4 при однократной вакцинации
Изучение реактогенности, безопасности и специфической иммуногенно- 85 сти оральной бивакципы при двукратной вакцинации волонтеров, ранее вакцинированных против оспы
-
Реактогенность, безопасность и специфическая иммуногенность ораль- 85 ной бивакципы при иммунизации добровольцев, иммунизированных дозой бивакципы 6,9 lg ООЕ и через 7 дней дозой 7,6 lg ООЕ (группа 5)
-
Реактогенность, безопасность и специфическая иммуногенность ораль- 87 пой бивакципы при иммунизации добровольцев, иммунизированных дозой бивакципы 6,9 lg ООЕ и через 14 дней дозой 7,6 Ig ООЕ (группа 6)
-
Реактогенность, безопасность и специфическая иммуногенность ораль- 89 пой бивакципы при иммунизации добровольцев, иммунизированных дозой бивакципы 6,9 lg ООЕ и через 30 дней дозой 7,6 lg ООЕ (группа 7)
4 Реактогенность, безопасность и специфическая иммуногенность ораль- 90
пой бивакцины при иммунизации добровольцев, иммунизированных до
зой бивакцины 6,9 lg ООЕ и через 3-6 месяцев дозой 7,6 lg ООЕ
(группа 8)
-
Реактогенность, безопасность и специфическая иммуногенность ораль- 90 ной бивакцины при иммунизации добровольцев, иммунизированных дозой бивакцины 7,6 lg ООЕ и через 2-6 месяцев дозой 7,6 lg ООЕ
-
Результаты исследований по возможности усиления иммунного ответа к 92 HBsAg при различных вариантах двукратной вакцинации бивакциной и вакциной «Комбиотех
-
Обобщенные результаты изучения реакто ген пости, безопасности и спе- 95 пифической иммуногенности оральной бивакцины при двукратной вакцинации добровольцев ранее привитых против оспы
Обсуждение 99
Выводы НО
Список использованной литературы 111
Приложение 1 126
ОБОЗНАЧЕНИЯ И СОКРАЩЕНИЯ
А/Г
а,к.
гв гиск
ПІЦ ВБ
Диаст.
Комитет МИБП
ЛОР-врач
ММЕ/мл
ООЕ п,н.
Программа клинических испытаний
п/я
Сист.
СО РАМН
СССР
с/я
уд. в мин.
отношение альбуминовой фракции крови к глобулиновой
антиген
артериальное давление
аминокислота
алапииаминотрансфераза
аспартатами потрап сфераза
бляшкообразующая единица
вирус гепатита В
вирус вакцины
Всемирная организация здравоохранения
вирусологический центр
гепатит В
Государственный институт стандартизации и контроля
Государственный научный центр вирусологии и биотехнологии
диастолическое
дезоксирибонуклеїновая кислота
единица
интерферон
иммуиофермептпый анализ
комитет медицинских иммунобиологических препаратов
срач по специальности «ухо-горло-нос»
министерство Здравоохранения
милл и международные единицы в мл
министерство Обороны
научно-исследовательский институт
натуральная оспа
научно-производственное объединение
нормативная документация
оспинообразующая единица
пар нуклсотидов
Программа ограниченных клинических испытаний реактогешю-сти, безопасности и иммунологической активности бивакцииы оспы и гепатита В эмбриональной живой рекомбинантной, таблетки "Ревакс-ВТ"
полимеразная цепная реакция
палочкоядериые
развивающийся куриный эмбрион
Российская Федерация
систолическое
Сибирское отделение Российской академии медицинских наук
скорость оседания эритроцитов
свободные от патогенной микрофлоры
С-реактивпый белок
Союз Советских Социалистических Республик -сегментоядерные
триллион
тимидинкиназа
Томский научный центр
удар в минуту
Введение к работе
Актуальность исследования. Прошло уже более четверти века с тех пор, как была успешно завершена программа глобальной ликвидации оспы путем иммунизации большей части населения Земли против данного заболевания. В результате сегодня в мире сложилась опасная ситуация, связанная с тем, что более половины населения Земли не имеет иммунитета против оспы. И с каждым годом количество иммунных людей будет уменьшаться. Подтверждением высокой степени незащищенности населения от ортопоксвирусов является самая масштабная за последние годы вспышка оспы обезьян среди людей, зарегистрированная в 1996-97 гг. в Демократической республике Конго [Hutin et al., 2001; Learned ct al., 2005] и 71 случай заболевания в 6 штатах США в 2003 г. [Likos et al., 2005]. В различных странах Европы было зарегистрировано увеличение числа случаев заболеваний людей в результате заражения вирусом оспы коров [Lewis-Jones et al., 2004; Frey and Belshe, 2004].
Более того, существует угроза появления оспоподобного заболевания, о чем свидетельствуют многочисленные вспышки заболевания люден оспой обезьян (Заир, США), оспой буйволов (Индия) и оспой коров (Германия, Украина) [Ладный, 1985; Маренникова и Щелкунов, 1998; Lewis-Jones et al,, 2004], После событий сентября 2001 года ВНО рассматривается зарубежными экспертами в качестве одного из наиболее вероятных объектов применения в биотеррористических акциях [Онищенко и др., 2003; Мауг, 2003]. Реальность нависшей над миром угрозы биотерроризма несомненна и наглядно подтверждена применением спор сибирской язвы против населения США в октябре 2001 г. для террора и шантажа. В сложившихся условиях ортопоксвирусы (натуральная оспа и оспа животных) являются наиболее опасным биологическим агентом [Henderson et al,, 1999а; OToole, 1999; Онищенко и др., 2003; Мауг, 2003].
В этих условиях существующие накожные оспенные вакцины имеют столько ограничений для применения, что практически не могут широко использоваться в иммунопрофилактике, например, они смертельно опасны для людей с синдромом иммунодефицитпого состояния и людей, страдающих кожными дерматитами [Lane and Goldstein, 2003]. При проведении добровольной иммунизации гражданского населения в 2002-2003 гг. в 43 штатах США зарегистрировано большое количество осложнений с частотой 1:713, включая два летальных случая [Mahoney et al., 2003].
Реактогенность и количество поствакцинальных осложнений живых вирусных вакцин (главный недостаток противооспенных вакцин) зависят от остаточной вирулентности используемых вирусных штаммов [Маренникова и Щелкунов, 1998; Медуиицын, 2004]. В связи с этим разрабатываемые новые кандидатпые вакцины можно разделить на 2 группы. Пер- вая - вакцины, для приготовления которых используются такие проверенные штаммы как NYCBOFI, реактогеніюсть таких вакцин (АСАМ 1000 и АСАМ2000) не сильно отличается от реакто геп пости вакцины Dryvax [Artenstein, 2005]. И вакцины, для приготовления которых используются высоко аттенуированпыс штаммы, такие как MVA и др. [Slifka, 2005]. Вакцины на основе штамма MVA являются максимально безопасными, но при этом протективные свойства таких вакцин вызывают сомнения [Enserink, 2002]. Наиболее разумным выходом из этой ситуации является использование двукратной вакцинации - первая вакцинация производится вакциной, приготовленной па основе штамма MVA, и далее следует или повторная вакцинация такой же вакциной, или вакцинация обычной вакциной, такой как Dryvax [Belyakov, 2003].
Другим способом увеличения безопасности противооспенных вакцин может быть применение мукозалыюй иммунизации при вакцинации против оспы. При этом формирующийся иммунитет, как по серологическим показателям, так и по продолжительности не уступает иммунитету, создаваемому после внутрикожной прививки [Воробьев и др., 2002]. Физиоло-гичность введения препарата, отсутствие травматизации кожи, безопасность как для вакцинируемых, так и для окружащих, высокая производительность при проведении массовой вакцинации - основные достоинства этого метода иммунизации [Воробьев и др., 1996а; Воробьев и др., 2002].
Глобальная ликвидация оспы в 1980 году удивительным образом совпала с началом исследований по получению рскомбинаптных штаммов ВВ [Moss, 1996а]. Особенностью ре-комбинантпых штаммов ВВ является способность индуцировать in vivo выраженный иммунный ответ, особенно Т клеточный [Ramirez et al., 2000b; Gherardi and Esteban, 2005; Zavala et al., 2005]. Существенно усилить иммунный ответ на белок, кодируемый встроенным в геном ВВ чужеродным геном, позволяет использование прайм-бустерной стратегии иммунизации [Ramshaw and Ramsay, 2000; Gherardi and Esteban, 2005], Причем показано, что во многих случаях оптимальной является мукозальная иммунизация рекомбинантиым ВВ на стадии бустер-вакцинации [Ramshaw and Ramsay, 2000; Gherardi and Esteban, 2005]. При этом было обнаружено, что мукозальная иммунизация рекомбинантиым ВВ позволяет преодолевать иммунитет, созданный предварительной парентеральной иммунизацией В В [Belyakov et al., 1999]. Этот эффект выражается в том, что у предварительно иммунизированных скарифика-ционпым способом ВВ мышей, иммунный ответ на чужеродный белок, экспрессируемый в составе рекомбипантного ВВ, существенно выше при последующей мукозалыюй иммунизации рекомбинантиым ВВ, чем парентеральной [Belyakov et al., 1999],
Возможность применения пероралыюй иммунизации для вакцинации против НО и опыт эффективного использования мукозалыюй иммунизации для индукции иммунного от- вета на чужеродные белки, экспрессируемые в составе генома рекомбинантпых ВВ, дают основания говорить о возможности разработки мукозалыюй (пероральной) рекомбинантной вакцины па основе ВВ.
Ранее в РФ двумя группами исследователей была получены рекомбинантные живые вакцина против НО и ГВ для накожного применения на основе рекомбинантпых штаммов ВВ в ген тимидинкипазы которых был встроен фрагмент ДНК вируса ГВ, кодирующий сип-тез белков HBsAg [Черное, 3990] и HBsAg и preS2-S [Муратов, 1993]. В проведенных клинических исследованиях на ограниченной группе волонтеров с использованием скарификаци-оешой иммунизации были показаны безопасность, хорошая иммуногенность к ВВ, по выраженного иммунного ответа на HBsAg получить не удалось [Черное, 1990; Муратов, 1993]. Одной из возможных причин отсутствия иммунного ответа па HBsAg мог быть иммунитет к ВВ, так как в исследовании принимали участие волонтеры, ранее вакцинированные против оспы [Бектемнров, 2002]. Использование же мукозалыюй иммунизации, как уже отмечалось, позволяет преодолевать системный иммунитет к ВВ, созданный при предшествующей иммунизации.
Все это делает актуальной разработку пероральной вакцины, которая была бы безвредной, эффективной, технологичной и позволяла бы в короткие сроки вакцинировать большие контингенты людей и не только против НО, по и ГВ. Такая вакцина может быть использована в Вооруженных Силах, милиции, службах безопасности, где люди находятся в условиях скученности и экстремальных ситуациях (ранения, контакты с чужой кровью, экстренные переливания крови и др.).
Цель и задачи исследовании. Целью нашего исследования было проведение клинических испытаний бивакципы оспы и ГВ эмбриональной, живой рекомбинантной, таблетки «Ре-вакс-ВТ» на ограниченной группе добровольцев.
Для достижения данной цели были поставлены следующие задачи:
Оценить качество приготовленных серий бивакципы в соответствии с требованиями, заложенными в ФСП.
Провести отбор волонтеров для проведения клинических испытаний в соответствии с требованиями, заложенными в Программе клинических испытаний.
Изучить безопасность, реактогенпость и иммуногенность бивакципы при однократной оральной вакцинации,
Изучить безопасность, реактогенпость н иммуногенность бивакципы при двукратной оральной вакцинации.
Оцепить возможность выделения вируса в окружающую среду у привитых бивакци-ной волонтеров.
Научная новизна работы. Впервые показано, что бивакципа в дозе 6,9 Ig ООЕ ареак-тогенна при однократной вакцинации добровольцев, ранее вакцинированных против оспы.
Отмечена значительная реактогенность бивакцины при ее однократном оральном применении в дозах 6,9 lg ООЕ и 7,6 lg ООЕ па добровольцах, ранее невакципированных против натуральной оспы (в 25 и 50% случаев соответственно), а также в дозе 7,6 lg ООЕ на добровольцах, ранее вакцинированных против натуральной оспы (у 40% добровольцев).
Установлено, что выраженный гуморальный иммунный ответ к ВВ может быть получен у волонтеров, однократно привитых в условиях первичной и отдаленной вакцинации только дозой бивакцины 7,6 lg ООЕ (83% и 90% соответственно).
Показано, что гуморальный иммунитет к ВВ, создаваемый оральной бивакциной при однократной иммунизации, является менее напряженным и продолжительным, чем при ска-рификационпой иммунизации.
Показано, что двукратное введение бивакцины дозах 6,9 lg ООЕ и 7,6 lg ООЕ с различными интервалами между ними (1,2 недели; 1, 3-6 месяцев) добровольцам в условиях отдаленной вакцинации в максимальном варианте дает лишь в легкой степени выраженности местные и общие реакции.
Показано, что у добровольцев, иммунизированных двукратно бивакциной дозами 6,9 lg ООЕ и 7,6 lg ООЕ с интервалом между введениями 1 - 2 недели) в условиях отдаленной ревакцинации, в 90-100% случаев формируется защитный уровень антител к вирусу вакцины. Увеличение интервала между введениями до 1 или 3-6 месяцев снижает сероконвереию до 55% и 50% соответственно.
Показано, что гуморальный иммунитет к ВВ, создаваемый при двукратной иммунизации оральной бивакциной дозами 6,9 lg ООЕ и 7,6 lg ООЕ с интервалом между введениями 1 - 2 недели является более напряженным и продолжительным, чем таковой, создаваемый при однократной иммунизации оральной бивакциной.
Показано, что однократная и двукратная оральная иммунизация бивакциной дозами 6,9 lg ООЕ и/или 7,6 lg ООЕ добровольцев в условиях первичной и отдаленной вакцинации не приводит к формированию значимого уровня гуморального иммунного ответа на маркер ВГВ (иммунная прослойка среди привитых волонтеров была существенно менее 70%).
Показано, что при однократной и двукратной оральной иммунизации бивакциной дозами 6,9 lg ООЕ и/или 7,6 lg ООЕ добровольцев в условиях первичной и отдаленной вакцинации (даже когда наблюдались местная и общая реакции у добровольцев) не удается зарегистрировать паличне рекомби панти ого ВВ в исследуемых пробах крови, слюны, мочи, взятых от привитых добровольцев.
Оснонпыс положения, выносимые на защиту
Использование двукратной оральной иммунизации сначала дозой бивакцины 6,9 lg ООЕ и далее дозой 7,6 lg ООЕ с интервалом в 1 или 2 недели позволяет свести к минимуму проявления реактогеппости.
Формирование иммунной прослойки к оспе (>70%) в течение не менее 6 месяцев у добровольцев, двукратно орально иммунизированных бивакциной сначала дозой бивакцины 6,9 lg ООЕ и далее дозой 7,6 lg ООЕ с интервалом в 1 или 2 недели, в условиях отдаленной вакцинации против этой инфекции.
Иммунизация вакциной против гепатита В с последующей двукратной оральной иммунизацией бивакциной позволяет получить выраженный иммунный ответ к HBsAg у 50% привитых волонтеров, тогда как иммунизация вакциной против гепатита В после двукратной оральной иммунизацией бивакциной позволяет получить иммунную прослойку к HBsAg у 30% привитых.
Оральная однократная и двукратная иммунизация добровольцев бивакциной дозами 6,9 lg ООЕ и/или 7,6 lg ООЕ, соответственно в условиях первичной и отдаленной вакцинаций, в том числе при наличии местных и общих реакций у волонтёров, является безопасной для окружающих, так как исключает выделение рекомбинаитного вируса в окружающую среду.
Практическая значимость работы. После проведения Государственных клинических испытаний на расширенной группе добровольцев бивакцииа может быть использована в качестве противооспешюй вакцины для лиц, вакцинированных против НО. Возможно применение в качестве бивакцины для лиц, ранее вакцинированных против НО и ГВ. Для лиц ранее невакцинированных против НО или вакцинированных, но у которых срок от предыдущей вакцинации превышает 20-25 лет, возможно, использовать бивакцину в качестве противооспешюй вакцины, но в этом случае необходимо применение двукратной иммунизации.
Результаты, полученные в исследованиях (зависимость проявлений реактогеппости и формирования гуморального иммунного ответа от иммунизирующей дозы, выбор оптимальной схемы двукратной иммунизации), могут оказать существенную помощь при проведении работ по изучению и разработке новых противооспепных вакцин и рекомбинантных вакцин, созданных на основе ВВ.
Апробации работы. Результаты работы были доложены на конференциях: Biological Medical Defense Conference 2004, Munich, Germany, October 20-21 2004, P. 98, 2-я Международная конференция «Наука - Бизнес - Образование Биотехнология - биомедицина - Окружающая среда», тезисы докладов - 10 - 13 мая 2005 г., Пущгшо, С. 91 - 92, ХШ International Congress of Virology, San Francisco, California, USA, July 23 - 28, 2005. - 181-V-416, P. 164, VI
Межгосударственной научно-практической конференции государств-участников СНГ, 13-14 сентября 2005 г., Волгоград, С. 286-287; Biological Medical Defense Conference 2005, Munich, Germany, October 26-27 2005, P. 315.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 9 печатных работ, включая положительное решение на выдачу патента РФ, а также подана 1 заявка на патент.
Личный вклад соискателя: участие в организации проведения клинических испытаний бивакципы против оспы и гепатита В, экспериментальные исследования по паспортизации приготовленных серий бивакципы, изучение гуморального иммунного ответа к вирусу вакцины у вакцинированных добровольцев, вирусологические исследования проб крови, слюны и мочи от вакцинированных волонтеров и обработка полученных результатов.
