Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ I. Обзор литературы 11
Глава 1. Аппарат подвижности архей. 11
1.1. Морфология и принцип функционирования жгутика архей. 11
1.2. Субъединичный состав жгутиков. 16
1.3. Ультраструктура нити жгутиков . 18
1.4. Гены флагеллинов архей. 19
1.4.1. Генная инженерия архей. 19
1.4.2. Семейства жгутик-ассоциированных генов архей. 23
1.5. Сборка жгутика архей. 28
Глава 2. Использование биополимеров для создания наноматериалов. 32
ЧАСТЬ II. Методическая 38
Глава 3. Материалы и методы исследования 38
3.1. Химические реагенты и ферменты. 38
3.2. Буферы и другие растворы, использованные в работе. 39
3.3. Среды. 40
3.4. Штаммы микроорганизмов. 40
3.5. Плазмиды. 40
3.6. Методы 41
3.6.1. Выделение плазмидной ДНК. 41
3.6.2. Выделение хромосомной ДНК H. salinarum. 41
3.6.3. Полимеразная цепная реакция. 42
3.6.4. Рестрикция ДНК. 42
3.6.5. Электрофорез в геле агарозы. 42
3.6.6. Очистка фрагментов ДНК. 43
3.6.7. Дефосфорилирование 5 -концов ДНК 43
3.6.8. Лигирование ДНК. 43
3.6.9. Получение компетентных клеток E.coli. 44
3.6.10. Трансформация компетентных клеток E.coli плазмидной ДНК. 44
3.6.11. Трансформация клеток H.salinarum. 44
3.6.12. Гибридизация по Саузерну. 45
3.6.13. Выделение жгутиков. 46
3.6.14. Электрофорез белков в ДСН-ПААГ. 46
3.6.15. Иммуноблоттинг. 47
3.6.16. Электронная микроскопия. 47
3.6.17. Иммуно-электронная микроскопия. 48
3.6.18. Эксперименты по связыванию ионов металлов и частиц коллоидного золота. 48
3.6.19. Фрагментация жгутиков ультразвуком. 49
3.6.20. Электрохимическое тестирование минерализованных жгутиков в качестве электродов. 49
ЧАСТЬ III. Результаты исследования и их обсуждение 51
Глава 4. Получение и анализ штаммов К salinarum с делетированными флагеллиновыми генами . 51
4.1. Плазмидные конструкции, использованные для получения штаммов Н.
salinarum с делетированными флагеллиновыми генами. 51
4.1.1. Плазмидные конструкции для делеции А- и В-флагеллиновых оперонов . 51
4.1.2. Плазмидные конструкции для делеции по отдельности А1, и А2-флагеллиновых генов. 53
4.1.3. Плазмидные конструкции для внесения отдельных В флагеллиновых генов и их тандемов в бесфлагеллиновый штамм
flgAflgB К salinarum. 55
4.2. Получение штаммов H.salinarum с делетированными флагеллиновыми
генами. 60
4.2.1. Получение штаммов AflgA, AflgB, AflgAAflgB, AflgAlAflgB и
AflgA2 AflgB H. salinarum. 60
4.2.2. Получение штаммов flgA flgBlflgB2, flgA flgB2 flgB З,
flgAflgB3 и AflgAAflgB2 H. salinarum. 68 4.3. Анализ штаммов H.salinarum с делетированными флагеллиновыми
генами. 70
Глава 5. Метод направленной модификации флагеллинов H. salinarum . 75
5.1. Получение генетических конструкций и выбор места модификации. 75
5.1.1. Получение плазмидной конструкции pNXA. 75
5.1.2. Мутагенез плазмиды pNXA. 78
5.1.3. Получение плазмидной конструкции pNXFLAGA1. 78
5.1.4. Получение плазмидной конструкции pNXFLAGA2. 81
5.1.5. Получение плазмидной конструкции pNXGoldA2 83
5.1.6. Получение плазмидной конструкции pNXB. 83
5.1.7. Получение плазмидной конструкции pNXFLAGB2. 83
5.2. Получение и анализ штаммов с модификациями флагеллинов. 84
5.3. Использование жгутиков архей для создания новых наноматериалов. 93
5.3.1. Получение наноматериала на основе FLAGA1-модифицированных жгутиков H. salinarum. 93
5.3.2. Получение наноматериала на основе модифицированных жгутиков H. salinarum и использование его для создания электрода для литий-ионного аккумулятора. 96
5.3.3. Получение наноматериала на основе фрагментированных модифицированных жгутиков H. salinarum и использование его для создания электрода для литий-ионного аккумулятора. 98
Заключение 103
Выводы 106
Список использованной литературы
- Ультраструктура нити жгутиков
- Буферы и другие растворы, использованные в работе.
- Плазмидные конструкции для делеции А- и В-флагеллиновых оперонов
- Получение плазмидной конструкции pNXFLAGA2.
Введение к работе
Актуальность темы исследования. Накопленные к сегодняшнему времени данные указывают на то, что жгутик архей является уникальным аппаратом подвижности, существенно отличным от бактериального. Жгутики архей, как правило, являются мультисубъединичными, то есть состоят из нескольких типов флагеллинов. Также у архей сборка жгутика осуществляется по механизму, принципиально отличающемуся от бактериального, а флагеллины архей имеют сигнальные последовательности и чаще бактериальных подвергаются посттрансляционным модификациям. Нет архейных гомологов и у других белков, участвующих в сборке бактериального жгутика. Однако полного представления о процессе сборки жгутика архей и механизме образования его спиральной структуры на сегодняшний момент нет. Работы по нокауту генов флагеллинов ограниченного числа видов архей позволили прийти к заключению, что именно мультикомпонентный состав жгутика обеспечивает его спиральную форму. Так, у галофильного археона Halobacterium salinarum филамент жгутика состоит из пяти флагеллинов, обозначаемых как А1, А2 , В1, В2 и В3, и путем инактивации генов А-флагеллинов (Tarasov et al., 2000) было показано, что для формирования спирального филамента необходимо наличие обоих А-флагеллинов. Вопрос о роли В-флагеллинов остался открытым.
Изучение надмолекулярной организации жгутиков архей методами делеции и
инактивации генов флагеллинов как правило приводит к существенным изменениям в
структуре жгутиков, поэтому полезным инструментом для подобных исследований
может являться направленная модификация флагеллинов заданными вставками из
аминокислотных последовательностей. Такие последовательности, экспонированные
на поверхности жгутика, позволяли бы идентифицировать и определять расположение
отдельных флагеллинов в жгутике с полным набором белков. Однако к настоящему
времени нет данных о пространственной структуре флагеллинов, позволяющих
выбрать места для вставки подобных последовательностей. Вместе с тем в последние
несколько лет стремительно увеличивается количество публикаций по использованию
в нанотехнологических целях надмолекулярных белковых структур, таких как
жгутики, пили и вирусы бактерий. Жгутики архей могут иметь определенные
преимущества, как перед бактериальными аналогами, так и перед вирусными
частицами для использования в данных целях. Это обусловлено, с одной стороны
экстремальным характером условий обитания большинства архей, с другой стороны
мультикомпонентностью их жгутиков, дающей возможность получения
полифункциональных материалов. Возможность модификации жгутиков архей аминокислотными последовательностями с заданными связывающими свойствами открыла бы путь к созданию нового класса нанобиоматериалов.
Цель и задачи исследования. Представленная работа посвящена изучению надмолекулярной организации жгутиков H. salinarum, а также использованию
полученных знаний для создания на основе жгутиков нового класса наноматериалов. В связи с этим были поставлены следующие экспериментальные задачи: 1) изучить распределение флагеллинов и их роль в надмолекулярной организации жгутика H. salinarum путем делеции генов флагеллинов и последующим наблюдением за морфологией жгутиков у делеционных мутантов; 2) провести направленную модификацию флагеллинов H. salinarum аминокислотными вставками так, чтобы они не нарушили формирования и функции жгутика и были доступны для детекции; 3) с помощью метода модификации флагеллинов H. salinarum изучить их распределение в составе жгутика; 4) с помощью метода модификации флагеллинов H. salinarum получить жгутики с заданными связывающими свойствами и синтезировать наноматериалы на основе таких жгутиков.
Научная новизна и практическая ценность исследования. Полученные путем делеции флагеллиновых генов данные позволили уточнить роль А-флагеллиновых генов, а также показать возможную роль В-флагеллиновых генов. Показано, что двух А-флагеллинов (А1, А2) достаточно для формирования спирального филамента жгутика, при наличии же только одного функционального гена А1- или А2-флагеллина клетки синтезируют протяженные прямые жгутики. Также показано, что при делеции А-флагеллиновых генов из продуктов В-генов строятся короткие изогнутые филаменты, основная роль в формировании которых принадлежит В2-флагеллину.
Впервые успешно осуществлена направленная модификация флагеллинов архей, позволившая при отсутствии данных о пространственной структуре флагеллинов вывести на поверхность функциональных жгутиков заданные последовательности из аминокислотных остатков. Разработанный метод открывает возможности по прямому исследованию состава жгутиков различных архей. Путем модификации А1 -, А2- и В2-флагеллинов H. salinarum дополнительной антигенной детерминантой показано, что в составе жгутика данные флагеллины распределены по всей длине филамента. Сопоставление данных по делеции и модификации генов флагеллинов говорит о том, что В2-флагеллин стабилизирует спиральную структуру филамента, формируемую А-флагеллинами. Кроме того, метод модификации флагеллинов позволяет получать на основе жгутиков архей новые наноматериалы. В данной работе на основе модифицированных жгутиков H. salinarum был получен материал для анода литий-ионного аккумулятора, показывающий улучшенные характеристики.
Апробация работы. Материалы диссертации были представлены на российских и международных конференциях: International symposium «Biological motility» (Пущино, 2004); Международной конференции «Рецепция и внутриклеточная сигнализация» (Пущино, 2005); 10-ой Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология – наука XXI века» (Пущино, 2006); Nanotechnology international forum «Rusnanotech» (Москва, 2009, 2010, 2011); Пущинской научно-практической конференции «Системная биология» (Пущино, 2009); XIX Менделеевском съезде по общей и
прикладной химии (Волгоград, 2011); VII российской конференции "Физические проблемы водородной энергетики" (Санкт-Петербург, 2011); Международной конференции молодых ученых «Экспериментальная и теоретическая биофизика» (Пущино, 2012).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 12 печатных работ, в том числе пять статей в реферируемых журналах из списка ВАК. Кроме того, материалы диссертации легли в основу для двух заявок на изобретения РФ, по которым получены патенты.
Структура диссертации. Диссертация изложена на 118 страницах
Ультраструктура нити жгутиков
Накопленные факты позволяют отнести жгутики архей к уникальной структуре биологической подвижности, отличной от бактериального жгутика (Jarrell et al., 1996b; Thomas et al., 2001; Jarrell and McBride, 2008). Для жгутиков архей даже был предложен отдельный термин «архелла» (archaella) (Albers and Jarell, 2012). Однако полного представления о процессе сборки жгутика архей и механизме образования его спиральной структуры на сегодняшний момент нет, тогда как надмолекулярная организация филамента жгутиков бактерий является хорошо изученной (по крайней мере, для энтеробактерий) и характеризуется тем, что спиральный филамент собирается только из одного флагеллина. Бактериальный флагеллин способен находиться в двух (L- и R-) конформационных состояниях и формировать полимерные нити толщиной в одну молекулу флагеллина протофиламенты. Такие протофиламенты, построенные из флагеллина только в L- или R-конформации, при одинаковом количестве субъединиц имеют небольшое различие в длине. При объединении таких протофиламентов в филамент жгутика в филаменте возникают силы скручивания, придающие ему спиральную форму (Calladine, 1978). Работы по нокауту генов флагеллинов ограниченного числа видов архей позволили прийти к заключению, что именно мультикомпонентный состав жгутика обеспечивает его спиральную форму. У галофильного археона H. salinarum филамент жгутика состоит из пяти флагеллинов, обозначаемых как А1, А2, В1, В2 и В3 (Gerl and Sumper, 1988; Gerl et al, 1989). Им соответствуют 5 генов (flaА1, А2, В1, В2, В3), находящихся в двух локусах flaA и flaB. Путем инактивации генов флагеллинов H. salinarum (Tarasov et al., 2000) было показано, что для формирования спирального филамента необходимо наличие обоих А-флагеллинов. Вопрос о роли В-флагеллинов остался открытым.
Несмотря на перечисленные выше фундаментальные отличия жгутиков архей от бактериальных, и в том, и в другом случае это полимерные структуры спиральной формы и, что особенно удивительно, обладающие способностью совершать полиморфные переходы при изменившихся условиях среды. Очевидно, что принципы формирования надмолекулярных структур в этих двух случаях не могут быть идентичными, и необходимо изучить как это происходит у H. salinarum. На первом этапе необходимо определить каким образом пять типов субъединиц флагеллина H. salinarum распределены в жгутике, что и явилось целью диссертационной работы. Для этого получались и анализировались мутантные штаммы H. salinarum с делециями различных генов флагеллинов для последующего наблюдения за изменениями, произошедшими в надмолекулярной организации филамента жгутика. Полученные данные позволили уточнить роль А-флагеллиновых генов, а также показать возможную роль В-флагеллиновых генов, однако, не позволили составить окончательное представление о формировании надмолекулярной структуры жгутика H. salinarum. Поэтому для помощи в понимании принципов надмолекулярной организации жгутиков H. salinarum мы решили осуществить направленную модификацию флагеллинов, которая позволяла бы идентифицировать и определять расположение отдельных флагеллинов в жгутике с полным набором белков.
Для этого потребовалась разработка метода направленной модификации флагеллинов применительно для H. salinarum. Поскольку данные по пространственной структуре субъединиц жгутиков архей отсутствуют, для определения участков полипептидной цепи, выходящих на поверхность жгутика и пригодных для введения необходимых пептидных вставок, потребовался другой подход. В ходе данной работы такой подход был найден и проверен экспериментально. На примере трех А1-, А2- и В2-флагеллинов H. salinarum показано, что метод модификации может быть использован для направленного выведения заданных антигенных детерминант на поверхность жгутика без утраты его функциональности с возможностью последующей локализации метки на поверхности жгутика. Разработанный метод открывает возможности по прямому исследованию состава жгутиков различных архей.
В последние несколько лет стремительно увеличивается количество публикаций по использованию в нанотехнологических целях надмолекулярных белковых структур, таких как жгутики, пили и вирусы бактерий. Данное направление исследований признается очень перспективным и в настоящее время бурно развивается (Nam et al., 2006; Kumara et al., 2007; Yu et al., 2007; Audette and Hazes, 2007; Атабеков И.Г. 2008; Lee et al., 2009). В основе этих работ лежит идея использования биополимеров в качестве матриц для выведения на поверхность составляющих биополимер субъединиц некой дополнительной петли пептидной природы, обладающей свойством связывания заданного лиганда. Таким образом, достигается упорядоченное размещение заданного лиганда на биополимерной матрице. После проведения необходимых химических реакций могут быть получены наноструктурированные материалы, которые будут обладать заданными (проводящими, полупроводниковыми, магнитными, каталитическими) свойствами. Мы полагаем, что жгутики архей могут иметь определенные преимущества, как перед бактериальными аналогами, так и перед вирусными частицами для использования в данных целях. Это обусловлено, с одной стороны экстремальным характером условий обитания большинства архей, с другой стороны мультикомпонентностью их жгутиков, дающей возможность получения полифункционального материала
Буферы и другие растворы, использованные в работе.
Как уже было отмечено, характерной чертой жгутиков архей является их мультикомпонентность (Bardy et al., 2003; Bardy et al., 2004; Jarrel et al., 2010, 2013). Проведенный анализ клонированных и секвенированных генов флагеллинов как правило показывает, что они организованы в тандемы и их транскрипция происходит с образованием полицистронных мРНК. Интересно, что во всех просеквенированных на настоящий момент геномах не были обнаружены гены, которые были бы гомологичны бактериальным генам белков базального тела или белков, ответственных за сборку этой структуры. Однако во всех них обнаружен кластер fla генов, расположенных и котранскрибируемых либо вместе с генами флагеллинов, либо отдельно (Patenge et al., 2001; Thomas et al., 2001). Тандемы, включающие в себя все эти гены, имеют длину от 7,5 до 14 т.п.н. в зависимости от археона, и представляют собой так называемые семейства жгутик-ассоциированных генов архей (archaeal flagella gene families). Среди видов рода Methanococcus гены этого семейства были клонированы и секвенированы; к ним относятся ген флагеллинa A (обнаружен у М.voltae) и гены флагеллинов В1, В2, В3 (M. maripaludis, М. voltae, M. vannielii (Kalmokoff et al., 1992; Jarrell et al., 1993), а также 8 генов fla, обозначенных как flaС, flaD, flaE, flaF, flaG, flaH, flal и flaJ. У М. jannaschii ниже fla J имеется дополнительно еще один ген, который может также входить в мультигенное семейство. Данное мультигенное семейство в случае Methanococcus располагается в одном опероне с генами флагеллинов. Гены fla могут разделяться короткими межгенными участками (подобно генам флагеллинов), как flaE и flaF располагаться в одной рамке считывания или перекрываться. Экспрессия in vivo этих генов была проверена у М. voltae, и в мембранных фракциях были детектированы белки, соответствующие генам flaС, flaD, flaE, flaH, flal (Thomas et al, 2001).
У Я salinarum семейство жгутик-ассоциированных генов имеет иной принцип организации. Пять генов флагеллинов расположены в двух транскрипционных единицах: геныД І и flgA2 формируют А-оперон длиной 1300 п.н., а гены flg В1, В2, В3 - В-оперон длиной 1900 п.н. (Gerl et al, 1989), расположенный на расстоянии 42 т.п.н. от А-оперона. Кроме того, в геноме Я. salinarum обнаружен ген так называемого «флагеллина Х» - ген, гомологичный генам А- и В-флагеллинов, но с укороченной последовательностью, кодирующей сигнальный пептид (Pfeiffer et al, 2008). Продукт этого гена в составе жгутика Я. salinarum отсутствует (Gerl et al, 1989). Кластер fla генов данного археона локализован отдельно, на расстоянии 400 п.н. выше В-оперона и считывается в противоположном ему направлении (Patenge et al, 2001). Гена гомологичного гену flaC Methanococcus у H.salinarum не обнаружено. В данной области находится ген Ыг15 с мотивом характерным для генов, которые кодируют метил -акцептирующие белки, участвующие в сигнальной трансдукции. Следует отметить, что flal и flaH, как у Я. salinarum, так и у М. voltae содержат последовательности, кодирующие в белках так называемый Walker box А, являющийся нуклеотид-связывающим доменом. К тому же интересным представляется тот факт, что flal, обладая АТФазной активностью, имеет гомологию с нуклеотид-связывающим белком бактерий pilT, который участвует в сборке пилей 4-го типа. Ниже flaJ находится еще один ген - flaK, и в нем также выявлена кодирующая Walker box А последовательность (Patenge et al, 2001), кроме того, он обнаруживает гомологию с геном MinDl, продукт которого ингибирует деление клетки. flaK имеет гомологию с бактериальными генами, включенным в регуляцию сборки жгутика, например, fleN у Pseudomonas aеrоginosa (Dasgupta et al, 2000). Транскрипция генов fla кластера была подтверждена с помощью Нозерн-гибридизации и обратно-транскриптазной ПЦР (Patenge et al, 2001).
Эксперименты по нокауту генов флагеллинов и fla генов в галофильных и метаногенных микроорганизмах позволили определить возможные функции некоторых из них. Был обнаружен факт позитивной зависимости транскрипции генов флагеллинов В-оперона от транскрипции генов флагеллинов А-оперона у H.salinarum (Tarasov et al, 2000). Согласно результатам Нозерн-гибридизации у flgjT и у flgA2 мутантов отсутствует транскрипция в В-опероне. Так как данная зависимость не могла быть обусловлена полярным эффектом в силу удаленности оперонов друг от друга, было сделано предположение, что либо непосредственно А-флагеллины как факторы транскрипции, либо другие белки, синтез которых зависит от экспрессии А-генов флагеллинов, влияют на транскрипцию в В-опероне. Нокаут генов флагеллинов показал, что спиральные формы жгутиков не способны образовываться в случае, когда в клетке оставался только один активный ген А-флагеллина, в этом случае форма жгутиков была прямой. В отличие от способности бактериального флагеллина к IAR-переходу возможность конформационных переходов для флагеллинов архей не была показана, исходя из этого было выдвинуто предположение, что А1- и А2-флагеллины H.salinarum могут являться аналогами L- и R-форм бактериального флагеллина. В соответствии с данной гипотезой А1- и А2-флагеллины образуют протофиламенты различающейся длины подобно L- и R-протофиламентам бактерий.
Плазмидные конструкции для делеции А- и В-флагеллиновых оперонов
Создание мутантных штаммов Н. salinarum, имеющих по одному или два из трех В-флагеллиновых генов возможно путем вставки соответствующих генов специальными плазмидами в хромосому мутантного штамма flgAflgB К salinarum (делетированы все А- и В-флагеллиновые гены). В данной работе для получения плазмид, используемых для внесения отдельных В флагеллиновых генов и их тандемов в область удаленного В-флагеллинового оперона, в первую очередь возникла необходимость получения плазмиды, которая содержала бы в себе полный В-флагеллиновый оперон с его фланкирующими участками. Такая плазмида (pNXB) была получена клонированием последовательности В-оперона с фланкирующими участками общим размером 2850 пар нуклеотидов в составе плазмиды pNX. В-оперон с фланкирующими участками был наработан специфичными праймерами pBL (5 - Клонирование производилось по сайтам эндонуклеаз рестрикции НіпсйІІиХЬаІ (рис. 6). Рис. 6. Плазмида pNXB с условно отмеченными сайтами для MvaI иVan91I эндонуклеаз рестрикции. Благодаря тому, что нуклеотидные последовательности генов В флагеллинов H. salinarum практически совпадают с 5 -конца на протяжении около 2-х сот остатков и около ста остатков с 3 -конца, в последовательностях генов обнаруживаются одинаковые сайты эндонуклеаз рестрикции. Были подобраны 2 эндонуклеазы рестрикции: MvaI – осуществляет рестрикцию В флагеллиновых генов в 5 -концевой области, Van91I - осуществляет рестрикцию В-флагеллиновых генов в 3 -концевой области. Ни один из этих ферментов не осуществляет рестрикцию в последовательности плазмиды pNX (рис. 6). Путем рестрикции pNXB-плазмиды в 5 - либо 3 -гомологичных областях В-флагеллиновых генов рестриктазой MvaI, либо Van91I, соответственно, с последующим лигированием большего фрагмента плазмиды самого на себя были получены новые плазмиды pNXB1 и pNXB3. Эти плазмиды содержат в себе либо В1-, либо В3-флагеллиновый ген, окруженный фланкирующими участками В-оперона. Соответственно, плазмида pNXB1 используется для вставки В1-гена, а pNXB3 – для вставки В3-гена в хромосому бесфлагеллинового штамма H. salinarum.
Плазмиды для вставки двух В-флагеллиновых генов не могут быть получены вырезанием одного из трех В-флагеллиновых генов из плазмиды pNXB. Используемые рестриктазы MvaI и Van91I осуществляют рестрикцию каждого из трех входящих в В-оперон генов, а рестриктаз, которые бы рестрицировали только два из трех В-флагеллиновых генов, но не имели своих сайтов рестрикции в остальной части крупной плазмидной молекулы pNX (размер примерно 12 т.п.н), подобрать не удалось. Для получения плазмид, содержащих не один, а пару из трех В-флагеллиновых генов, окруженных фланкирующими участками В-флагеллинового оперона, был использован следующий подход: в обработанной только одним ферментом (MvaI или Van91I) плазмиде pNXB1 или pNXB3 клонировать смесь фрагментов В-генов, полученных рестрикцией В-оперона этим же ферментом. На основе плазмиды pNXB1 получение плазмид с двумя В-флагеллиновыми генами (pNXB1В2 и pNXB1В3) выглядит следующим образом: 1) плазмида pNXB1 обрабатывается рестриктазой Van91I и также щелочной фосфатазой для предотвращения лигирования плазмиды самой на себя, 2) параллельно осуществляется рестрикция наработанного ПЦР (или вырезанного из плазмиды pNXB) В-оперона этой же рестриктазой. Полученная рестрикционная смесь разгоняется в агарозном геле, откуда вырезаются и очищаются фрагменты величиной порядка 600 п.н. – смесь ДНК с последовательностями В2- и В3-флагеллиновых генов. При этом В1-флагеллиновый ген с левой фланкирующей областью образует фрагмент 1200 п.н., а размер отщепляемого правого фланкирующего участка примерно 450 п.н., 3) проводится лигазная реакция с использованием обработанной рестриктазой Van91I плазмиды pNXB1 и смеси В2-, В3-флагеллиновых генов с липкими концами, полученными от обработки этим же ферментом, 4) после трансформации лигазной смесью клеток E.coli проводится скрининг полученных колоний на наличие в плазмидах интересующей вставки, 5) в полученных со вставкой плазмидах определяется какой ген (flgВ2 или flgВ3) был встроен.
Вставка В2- и В3-флагеллиновых генов в плазмиду pNXB1 проверялась методом ПЦР с использованием указанных ранее праймеров pB_L и pB_R. В1- и В3-флагеллиновые гены должны встраиваться в плазмиду pNXB1 с равной вероятностью. Способ определения, какие из плазмид со вставкой являются pNXB1В2, а какие pNXB1В3, был основан на имеющихся в нуклеотидных последовательностях В-флагеллиновых генов различиях. Данные по всем плазмидам, используемым для получения штаммов H. salinarum с делециями генов флагеллинов, были сведены в таблицу 1.
Получение плазмидной конструкции pNXFLAGA2.
На данном этапе проводился мутагенез (замена нуклеотидов) плазмиды pNXA с целью введения искусственного сайта для эндонуклеазы рестрикции, чтобы место модификации А2-флагеллина находилось между первым и вторым сайтами гликозилирования. Такая замена была осуществлена в плазмиде рNХА с использованием синтетических олигонуклеотидов: 5 САССGТGСGССАGСТАGССGGАGСС-3 и 5 GGСТССGGСТАGСТGGСGСАСGGТG-3 и набора реактивов QuikСhаngе sitе-dirесtеd mutаgеnеsis kit (фирмы Strаtаgеnе). Таким образом был введен сайт для эндонуклеазы рестрикции AsuNHI, приводящий к замене в продукте A2-гeнa 86-го аланина на лейцин. Подобная замена не приводит к утрате функциональности флагеллина, так как место замены лежит у поверхности белка, и нет привнесения заряда, способного дестабилизировать белок. По введенному сайту AsuNHI в дальнейшем можно вводить синтетические олигонуклеотиды, кодирующие выбранную аминокислотную вставку.
В итоге, была получена плазмидная конструкция (обозначена как pNXmutA), предназначенная для получения на ее основе других плазмид, в которых в области А1- и А2-генов будут находиться олигонуклеотидные вставки.
Получение плазмидной конструкции pNXFLAGA1 FLAG-пептид – это последовательность аминокислотных остатков DYKDDDDK, к которой коммерчески производятся специфичные антитела. Данная последовательность была выбрана для модификации ею флагеллинов H. salinarum, поскольку это даст возможность обнаружить данную последовательность с помощью антител на поверхности жгутиков, и тем самым проверить работоспособность метода модификации.
Так, на основе плазмиды pNXmutA была получена плазмидная конструкция со вставкой в А1-ген флагеллина синтетической олигонуклеотидной последовательности, кодирующей FLAG-пептид.
Клонируемая в область А1-флагеллинового гена олигонуклеотидная последовательность, кодирующая FLAG-пептид должна формироваться из двух олигонуклеотидов. Метод введения олигонуклеотидных последовательностей, кодирующих выбранный пептид, можно схематически изобразить следующим образом: первый олигонуклеотид кодирует последовательность вставляемого пептида и также содержит липкий 3 -конец для клонирования по сайту рестрикции BstXI: 5 -NN(NNN)xGCCG-3 . Второй олигонуклеотид комплементарен первому для формирования дуплекса и кроме того содержит липкий конец для клонирования по сайту BstXI: 5 -(NNN)x NNCGGC-3 (где N – стандартное обозначение нуклеотида). Схема способа введения вставки в А1 –ген приведена на рис. 14.
Путем трансформации плазмидой pNXFLAGA1 клеток H. salinarum можно получить мутантный штамм, производящий жгутики со вставкой FLAG-пептида в А1-флагеллин. Рис. 14. Схематическое олигонуклеотидной вставки в модификацию. изображение способа введения А1-ген, кодирующей выбранную 5.1.4. Получение плазмидной конструкции pNXFLAGA2 Получение плазмидной конструкции pNXFLAGA2 аналогично получению плазмиды pNXFLAGA1 на основе плазмиды pNXmutA с отличием в том, что вставка синтетической олигонуклеотидной последовательности, кодирующей FLAG-пептид, осуществляется в А2-ген флагеллина. Подробнее, это выглядело следующим образом: первый олигонуклеотид кодирует последовательность вставляемого пептида и также содержит липкий 5 -конец для клонирования по сайту рестрикции AsuNHI: 5 CTAGNN(NNN)x-3 . Второй олигонуклеотид комплементарен первому для формирования дуплекса и кроме того содержит липкий конец для клонирования по сайту AsuNHI: 5 -CTAG(NNN)xNN-3 . Схема способа введения вставки в А2 –ген приведена на рис 15. Путем трансформации плазмидой pNXFLAGA2 клеток H. salinarum можно получить мутантный штамм, производящий жгутики со вставкой FLAG-пептида в А2-флагеллин.
