Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 10
1.1. Симбиоз и его роль в эволюции 10
1.2. Растительно-микробные взаимодействия 12
1.2.1 .Трофические симбиозы 12
1.2.2.Защитные симбиозы 16
1.3. Бобово-ризобиальный симбиоз
1.3.1. Значение бобово-ризобиального симбиоза 17
1.3.2. Сигнальное взаимодействие между симбионтами 19
1.3.3. Симбиотические гены растений 19
1.3.4. Симбиотические гены бактерий
1.3.4.1. Организация и экспрессия ш/-генов 26
1.3.4.2. Горизонтальный перенос симбиотических генов бактерий 32
1.3.5. Авторегуляция 35
Глава 2. Материалы и методы исследования 38
2.1. Объекты исследования, бактериальные штаммы и векторы 38
2.2. Методы исследований
2.2.1. Выделение чистых культур клубеньковых бактерий 39
2.2.2. Хранение штаммов ризобий 40
2.2.3. Выделение и очистка ДНК ризобий 40
2.2.4. Выделение и очистка плазмидной ДНК 41
2.2.5. Полимеразная цепная реакция 43
2.2.6,Олигонуклеотидные праймеры, использованные при проведении ПНР
2.2.7. Расщепление ДНК рестрикционными эндонуклеазами 46
2.2.8. Аналитический гель-электрофорез ДНК з
2.2.9. Препаративный гель-электрофорез ДНК 48
2.2.10. Элюция ДНК из агарозного геля 48
2.2.11. Обработка ДНК щелочной фосфатазой и полинуклеотидкиназой фага Т4 50
2.2.12. Подготовка химически компетентных клеток Е. coli и Enterobacter ц 51
2.2.13. Трансформация компетентных клеток Е. coli и Enterobacter sp. плазмидной ДНК 51
2.2.14. Секвенирование ДНК на автоматическом секвенаторе 52
2.2.15.Компьютерный анализ нуклеотидных последовательностей 53
2.2.16. Подготовка электрокомпетентных клеток клубеньковых бактерий 53
2.2.17. Электропорация компетентных клеток ризобий 53
2.2.18. Выделение и очистка РНК рекомбинантных клубеньковых бактерий 54
2.2.19. Синтез кДНК 55
2.2.20. Определение нитрогеназной активности бактерий
2.3. Реактивы и материалы 56
2.4. Составы использованных стандартных водных растворов 57
Глава 3. Результаты и обсуждение 58
3.1. Филогенетический анализ симбиотических генов 58
3.2. Маркеры для поиска клубеньковых бактерий на основе симбиотических генов 67
3.3. Получение штамма ризобий с конститутивной экспрессией генов нитрогеназного комплекса 72
Заключение 81
Выводы 82
Список литературы
- Бобово-ризобиальный симбиоз
- Горизонтальный перенос симбиотических генов бактерий
- Выделение и очистка плазмидной ДНК
- Маркеры для поиска клубеньковых бактерий на основе симбиотических генов
Бобово-ризобиальный симбиоз
Трофические симбиозы являются наиболее распространенными, так как многие питательные вещества недоступны для ассимиляции растениями (Vance, 2001).Так, например, азот является основным химическим элементом в построении жизненно важных макромолекул. Основная его часть содержится в атмосфере в химически инертной молекулярной форме (N2), а также в почве в составе органических веществ (гумус, хитин). Растения не способны к его усвоению, так как у них нет специализированных ферментных систем, как для фиксации молекулярного азота, так и для деструкции почвенной органики (Проворов, Долгих, 2006). Поэтому кооперация с микроорганизмами, которые обладают либо нитрогеназой (фермент фиксации N2) (ризобии, актиномицеты, цианобактерии, эндофитные и ризосферные бактерии), либо ферментами для извлечения азота из органических компонентов почвы (микоризные грибы),- это естественный выход в решении проблемы азотного дефицита (Лутова и др., 2000). Наиболее изученные трофические взаимодействия - микоризы и азотфиксирующие симбиозы.
Микоризный симбиоз. Микориза - симбиотическая ассоциация грибного партнера (микобионта) с корнями высших растений. Данный вид симбиоза является наиболее распространенной и экологически значимой формой растительно-микробных взаимодействий, так как около 90% всех наземных растений образуют микоризу (Юрков, 2009). При взаимодействии симбионтов происходит обмен питательными веществами: микобионт снабжает растение-хозяина фосфором и азотом, а также рядом микроэлементов, таких как медь, цинк и кобальт, получая взамен часть ассимилята, который продуцируется растениями с помощью фотосинтеза. Микоризообразующие грибы являются не только поставщиками питательных веществ почвы, но и их перераспределителями между растениями. Также микоризация обеспечивает защиту корней от патогенных бактерий и повышает устойчивость растений к обезвоживанию, что наиболее важно в условиях недостаточной влажности (засушливые области и районы засоленности почв) (Парахин, Петрова, 2012). Микоризу, в зависимости от анатомии микобионта, делят на эктомикоризу и эндомикоризу (Тихонович, Проворов, 2007). При эктомикоризе большая часть мицелия остается вне растения, а гифы гриба проникают сквозь ризодерму корня и распространяются по межклетникам. Эктомикориза, которая формируется грибами типа Basidiomycota (реже Ascomycota) с древесными и кустарниковыми растениями, преимущественно выполняет функцию азотного питания растений (Проворов, Долгих, 2006). В случае эндомикоризы большая часть микобионта находится внутри корня, проникая внутрь растительных клеток. Наиболее изученной формой является арбускулярная микориза (AM), образуемая большинством наземных растений с грибами типа Glomeromycota (SchuBler, 2002). Благодаря формированию AM улучшается ассимиляция корнями труднорастворимых фосфатов и других необходимых элементов почвы (Наумкина и др., 2005), усиливается сопротивление растений к засухе, болезням и корневым патогенам (Dehne, 1982; Caron, 1989; Newsham et al., 1995). Также было показано улучшение симбиотической и фотосинтетической деятельности растений, инфицированных арбускулярными грибами (Paradi et al., 2003; Завалин и др., 2009). Растение-хозяин AM может быть облигатно (многолетние формы и растения со слабо развитой корневой системой) или факультативно зависящим от его грибного партнера, в то время как для самого гриба симбиоз является облигатной стадией (Космачевская, 2009). Данная симбиотическая ассоциация, по мнению многих ученых, является наиболее древней и именно ей отводится главная роль в освоении растениями суши ( 400-450 млн. лет назад) (Pirozynski, Malloch, 1975).
Лзотфиксирующие симбиозы образуют представители всех типов наземных растений с грамотрицательными бактериями (ризобиями), цианобактериями или актиномицетами. Общий принцип работы всех азотфиксирующих симбиозов заключается в сопряжении процессов фиксации N2 и СОг, первый из которых осуществляется преимущественно микросимбионтами, а второй - хозяином (Проворов, Долгих, 2006).
Одним из самых изученных является симбиоз бобовых растений с клубеньковыми бактериями (ризобиями). Здесь фиксация азота ризобиями происходит в специализированных органах - корневых (иногда стеблевых) клубеньках, куда в свою очередь растение-хозяин поставляет продукты фотосинтеза: соединения углерода и другие элементы питания, а также энергию для ассимиляции азота (Тихонович, Проворов, 2009). Бобово-ризобиальные взаимодействия варьируют по специфичности (Denarie et al., 1992). Так для бобовых умеренного климата характерно высокоспецифичное взаимодействие с определенными группами а-протеобактерий (Rhizobium и Sinorhizobium), когда тропические бобовые инокулируются не только а-протеобактериями (Rhizobium, Sinorhizobium, Azorhizobium и Bradyrhizobium), но также и представителями Р-протеобактерий (Chen et al., 2003).
Важную экологическую роль также играет симбиоз различных растений с азотфиксирующими цианобактериями (Nostoc, Anabaena) - синцианоз. В отличие от ризобий цианобактерии сами способны к фотосинтезу, что позволяет им фиксировать азот даже вне растения-хозяина. Главная проблема, с которой при этом они сталкиваются - чувствительность ключевого фермента азотфиксации (нитрогеназы) к кислороду, выделяемому в процессе фотосинтеза. Поэтому у азотфиксирующих цианобактерии выработалось разделение функций между клетками, одни из которых, покрытые толстой оболочкой (гетероцисты), не фотосинтезируют, а только фиксируют азот, в то время как другие занимаются исключительно фотосинтезом (Meeks, Elhai, 2002). При симбиозе процесс азотфиксации оказывается под жестким контролем растения-хозяина и, как правило, связан с локализацией цианобактерии в специальных органах. Так, у водного папоротника Azolla они располагаются в полости листа, у цветкового Gunnera - в железках в основании листовых черешков, у голосеменных порядка Cycadales - в межклеточных пространствах коралловидних корней (Fogg et а!., 1973).
Горизонтальный перенос симбиотических генов бактерий
Для выделения высокомолекулярной бактериальной ДНК ризобий использовали метод Грэхэма (Graham, 1978) с некоторыми модификациями. Культуры бактерий выращивали в колбах Эрленмейера объемом 250 мл в 100 мл питательного бульона TY (0,1%-ный дрожжевой экстракт, 1%-ный бакто-триптон, 0,1%-ный СаС12) при постоянном встряхивании для обеспечения достаточной аэрации при 28С в течение ночи. Клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 4000g, 4С, суспендировали в 10 мл буфера следующего состава: 100 мМ трис-HCl, рН 8,5, 20 мМ этилендиаминтетрауксусная кислота (ЭДТА), 15%-ная сахароза и 5 мг/мл лизоцима. После инкубации в течение 15 мин при 0С, добавляли 10 мл лизирующего раствора (2%-ный додецилсульфат натрия) и 10 мг/мл протеиназы К) и инкубировали в течении 2 ч при 55С. К полученному раствору добавляли равный объем смеси 80%-ного свежеперегнанного фенола (доведенного до рН8,0 с помощью трис-HCl, рН8,0), хлороформа и изоамилового спирта, взятых в соотношении 25:24:1, и проводили депротеинизацию и очистку ДНК как описано выше для ДНК растений.
Для рутинных ПНР анализов использовали также быстрый метод выделения ДНК из бактерий лизированием клеток в 1% TritonXlOO и 1% суспензии ChelexlOO (Баймиев и др., 2011). Для этого в 1.5 мл пробирки со 100 мкл 1% TritonXlOO и 1% суспензии ChelexlOO помещали небольшое количество бактериальной массы и после суспензирования инкубировали при температуре 95С 10 мин. Клеточный дебрис осаждали центрифугированием при 12000g в течение 3 мин. Надосадочную жидкость брали в качестве матрицы для ПНР.
Плазмидную ДНК выделяли методом мягкого лизиса (Clewel, Helinski, 1969) с некоторыми модификациями, заключавшимися в сильном уменьшении концентрации сахарозы в суспендирующем буфере и осаждении плазмидной ДНК из осветленного лизата полиэтиленгликолем. Колонией Е. coli, несущей какую-либо плазмиду, засевали 100 мл среды Лурия-Бертани (LB), содержащей 100 мкг/мл ампициллина или другие необходимые антибиотики и выращивали при 37С без встряхивания в течение ночи. Для штамма Е. co/z XL 1-Blue, несущего на эписоме транспозон ТпЮ, определяющего устойчивость к тетрациклину кроме прочих антибиотиков добавляли 12.5 мкг/мл этого антибиотика. Часть полученной ночной культуры переносили, обеспечив ее 100-кратное разбавление, в колбу со свежеприготовленной средой LB, содержащей требуемые антибиотики. Наращивание продолжали до достижения оптической плотности, соответствующей концентрации 2-3x10 клеток/мл (обычно 14-16 час). Бактериальные клетки осаждали центрифугированием при 3000 об/мин в течение 10 мин в центрифуге Eppendorf 5804R (Германия). Осадок суспендировали в 8 мл 10%-ной сахарозы. После добавления 2 мл свежеприготовленного раствора лизоцима (10мг/мл в 250 мМ трис-НС1, рН7.8) выдерживали 10 мин при 0С и добавляли 2 мл 0.5 М ЭДТА и продолжали инкубацию еще в течение 5 мин при прежних условиях. Лизис проводили с помощью смеси детергентов бридж 58 - дезоксихолат натрия (конечные концентрации 1% и 0.4%, соответственно). Осторожно перемешивали в течение 5 мин, пока раствор не становился вязким и прозрачным. Полученный лизат осветляли в ультрацентрифуге Spinco L2-65B (Beckman-Coulter, США) в бакет-роторе SW-41 в течение 30 мин при 39000 об/мин. Осторожно сливали супернатант, не допуская перетекания вместе с ним иногда образующегося вязкого придонного слоя, содержащего хромосомную ДНК, и добавляли к нему 1/5 объема 5 М NaCl и 1А объема 50%-го полиэтиленгликоля 6000. При 0С в холодильнике в течение нескольких часов формировался осадок плазмидной ДНК, содержащий загрязняющее количество РНК, белка, полисахаров.
Сформировавшийся осадок собирали в центрифуге Eppendorf 5804R при 3000 об/мин в течение 10 мин. После растворения осадка в 1хТЕ перед этапом депротеинизации проводили удаление остаточного полиэтиленгликоля встряхиванием с хлороформом и расслаиванием в центрифуге Eppendorf 5804R при 2500 об/мин в течение 5 мин. Депротеинизацию проводили встряхиванием с равным объемом смеси хлороформа и 80%-ого свежеперегнанного фенола (рН 8.0), взятых в соотношении 1:1 в течение 10 мин. Затем проводили центрифугирование в центрифуге Eppendorf 5804R при 2500 об/мин в течение 20 мин. Верхний водно-солевой слой, содержащий ДНК, отбирали и подвергали повторной депротеинизации. Эту процедуру повторяли до тех пор, пока не исчезала интерфаза, состоящая из денатурированного белка. Затем супернатант встряхивали с равным объемом хлороформа и после центрифугирования осаждали ДНК двумя объемами этилового спирта. Осадок ДНК промывали 70%-ным этанолом для удаления следов фенола и хлороформа и растворяли в соответствующем объеме 1 х ТЕ.
При анализе рекомбинантных клонов для определения размера вставки применяли быстрый метод щелочного лизиса бактериальных колоний (Birnboim, Doly, 1979). Для этого бактериальной петлей переносили колонии в микроцентрифужные пробирки и тщательно суспендировали в 100 мкл раствора I, содержащего 50мМтрис-НС1 (рН7.8) и 20 мМ ЭДТА. Затем добавляли 200 мкл раствора II, содержащего 1%-ный раствор SDS натрия и 0.2MNaOH. После осторожного перемешивания через 5 мин добавляли 150 мкл 5 М ацетата калия (рН 5.0). Тщательно перемешав, выдерживали при 0С в течение 10 мин и центрифугировали при 12000 об/мин в течение 5 мин в микроцентрифуге Mini-Spinplus (Eppendorf, Германия). Осторожно отбирали осветленную жидкость, не захватывая осадок и липидный слой, и осаждали ДНК двумя объемами этанола при -70С. После растворения сформировавшегося и собранного в микроцентрифуге в минимальном объеме 1 х ТЕ препараты ДНК были готовы или для их непосредственного анализа агарозным гель-электрофорезом или для расщепления соответствующими рестрикционными эндонуклеазами.
Выделение и очистка плазмидной ДНК
С точки зрения регуляции азотфиксации ризобии представляют собой уникальные микроорганизмы. В отличие от свободноживущих азотфиксаторов регуляция азотфиксации клубеньковых бактерий осуществляется не только внешними факторами (в основном, кислородом), но и преимущественно растением-хозяином. Существует несколько особенностей данной регуляции (Камински и др., 2002). Первая из них заключается в том, что большинство быстрорастущих ризобии, являющихся основными симбионтами бобовых умеренного климата, не фиксируют азот вне растений. Синтез нитрогеназы ex planta отмечен у медленнорастущих ризобии (Bradyrhizobium), однако диазотрофного роста у них не наблюдают, так как более 90% аммония, образуемого при работе нитрогеназы в свободноживущих клетках ризобии, выделяется во внешнюю среду (Fisher, 1994). Вторая особенность симбиотической фиксации азота состоит в том, что нитрогеназа ризобии функционирует в условиях избытка азотных соединений. Третья особенность заключается в том, что удельная активность ш/-генов у ризобии намного выше, чем у свободноживущих азотфиксаторов.
Ввиду того, что в нашей лаборатории разработан действующий метод специфичного прикрепления бактерий рода Rhizobium к корням небобовых растений за счет трансгенного белка лектина бобовых растений, появляется возможность создания искусственных ассоциативных азотфиксирующих симбиозов Rhizobium с небобовыми растениями. Фундаментальной проблемой в данном случае выступает сама возможность искусственной индукции генов нитрогеназного комплекса у штаммов Rhizobium и оценка азотфиксирующей эффективности у подобных бактерий.
В этой связи нами было решено получить рекомбинантные штаммы клубеньковых бактерий с конститутивной экспрессией генов нитрогеназного комплекса. Конструирование штаммов Rhizobium с азотфиксирующей активностью ex planta даст реальную возможность получать новые азотфиксирующие ассоциативные симбиозы с небобовыми растениями, что, несомненно, скажется на их урожайности.
Так как все гены, участвующие в процессе азотфиксации у ризобий активируются геном пі/А, то получение штаммов с измененной регуляцией данного гена может привести и к изменению транскрипционного статуса генов самой нитрогеназы.
С этой целью нами была получена плазмидная конструкция, несущая ген пі/А ризобий под регуляцией конститутивного промотора.
В качестве основы для конструкции был использован вектор pTurboGFP-В (Evrogen), содержащий ген флуоресцентного белка TurboGFP. С помощью подобранных нами олигонуклеотидных праймеров (BamHInifAF и BamHInifAR) (табл. 2), дающих ампликон, имеющий на концах сайты рестрикции ВатШ, был амплифицирован из тотальной ДНК R.leguminosarum 1078 ген пі/А. Для амплификации была использована Pfu-полимераза, которая обладает 3 -5 -редактирующей активностью и обеспечивает высокую точность включения нуклеотидов в синтезируемый продукт.
В дальнейшем ампликон ni/A R. leguminosarum, а также плазмида pTurboGFP-B были обработаны эндонуклеазой рестрикции ВатШ, что привело к образованию липких концов амплификата и линеризации плазмиды, что облегчило дальнейшее клонирование ПЦР-продукта в вектор под управление сильного конститутивного промотора фага Т5. Попадание клонируемого фрагмента в рамку считывания данного промотора было осуществлено за счет дизайна праймера (рис. 9).
Известно, что плазмида pTurboGFP-B содержит ColEl регион, позволяющий ей реплицироваться преимущественно в E.coli и очень редко в клетках других бактерий. Поэтому для того, чтобы созданная нами плазмидная конструкция могла реплицироваться в клетках клубеньковых бактерий, в нее был добавлен репликон плазмиды широкого круга хозяев, а именно плазмиды pBBRl, выделенной из Bordetella bronchi septica штамма S87 (Antoine, Locht, 1992; Elzer et al., 1995). Уникальность данного репликона заключается в том, что он не принадлежит ни к одной из известных групп несовместимости, т.е. вектор с таким репликоном не должен конфликтовать ни с одной из известных плазмид (Antoine, Locht, 1992; Lefebre, Valvano, 2002). Данное свойство является необходимым условием для получения рекомбинантных штаммов ризобий, целевой ген которого экспрессируется с плазмиды, поскольку наличие конфликта непременно приведет к стабильной элиминации или вносимой векторной конструкции или хозяйских плазмид, что в свою очередь может привести к изменению фенотипа микроорганизма. Это особенно важно при исследовании клубеньковых бактерий, у которых значительную часть генома составляют именно плазмиды. Кроме того, гены, определяющие симбиотические свойства у Rhizobium sp. и Sinorhizobium sp., имеют плазмидную локализацию, и их потеря приведет к утрате данных свойств. Более того плазмиды с репликоном pBBRori были неоднократно проверены при использовании их в создании конструкций для мечения различных штаммов ризобий флуоресцентными белками.
Фрагмент ДНК, соответствующий pBBRori, был встроен в нашу конструкцию по сайту рестрикции Mscl (рис. 9).
Таким образом, была получена плазмидная конструкция pTurboGFP-BnifApBBRIori, содержащая в своем составе ген пі/А под управлением сильного конститутивного промотора фага Т5. Данная конструкция при трансформации ее в ризобиальную клетку может экспрессировать белок NifA, который в свою очередь должен активировать гены нитрогеназного комплекса данных бактерий в свободноживущем состоянии.
Маркеры для поиска клубеньковых бактерий на основе симбиотических генов
Для проверки функциональной активности конструкции pTurboGFP-BnifApBBRIori данная плазмида далее с помощью электропорации была трансформирована в штамм R. leguminosarum 1078.
Для того, чтобы предварительно удостовериться в экспрессионной активности гена пі/А в полученной конструкции, рекомбинантный штамм R. leguminosarum 1078 был подвергнут ОТ-ПЦР анализу (полимеразная цепная реакция с обратной транскрипцией). В ходе данного эксперимента была показана наработка мРНК гена пі/А, что говорит о наличии транскрипционной активности этого гена в рекомбинантном штамме (рис. 10).
ОТ-ПЦР анализ транскрипционной активности гена пі/А в клетках рекомбинантных бактерий. М - 100 п.н. маркер; 1 - ПЦР-продукт гена пі/А тотального препарата нуклеиновых кислот рекомбинантных бактерий; 2 - ОТ-ПЦР-продукт гена пі/А рекомбинантных бактерий; 3 - ПЦР тотального препарата нуклеиновых кислот рекомбинантных бактерий после обработки ДНКазой. С целью выявления индукции нитрогеназного комплекса у полученного рекомбинантного штамма R. leguminosarum 1078, культивируемого на питательной среде YM, «ацетиленовым» методом была определена его нитрогеназная активность. Было обнаружено, что благодаря конститутивной экспрессии гена пі/А у данного штамма появилась способность фиксировать атмосферный азот в свободноживущем состоянии. Данный факт говорит о том, что искусственная регуляция включения нитрогеназного комплекса у клубеньковых бактерий вполне возможна. На свободноживущих азотфиксаторах (Enterobacter, Klebsiella) подобные работы были проведены еще в начале 80-х годов. В работе Buchanan-Wollaston с соавт. было показано, что при конститутивной экспрессии ni/A Klebsiella pneumoniae происходит значительное увеличение транскрипционной активности ni/ генов и накопление их белковых продуктов в клетке даже в присутствии кислорода и соединений азота (Buchanan-Wollaston et al., 1981). Также другими авторами было выявлено, что азотфиксирующая активность бактерий повышается, если в их геном ввести конститутивно экспрессирующийся ген ni/A (Buchanan-Wollaston et al., 1981; Kennedy, Robson, 1983; Zhu et al, 1983; Uozumi et al, 1986; Li et al, 1994). Нами в данной работе показано, что с помощью искусственной регуляции экспрессии гена ni/A возможно также изменить статус азотфиксации и у штаммов ризобий.
Хотя нитрогеназная активность у полученного рекомбинантного штамма (3,1 мкг /мл/ч) оказалась близка к таковой у свободноживущего диазотрофа (Paenibacillus chimensis) (по нашим измерениям 3,5 мкг /мл/ч) (рис. 11), главным результатом в данном опыте является подтверждение возможности искусственной регуляции нитрогеназного комплекса клубеньковых бактерий, что открывает большие перспективы для создания различных ростостимулирующих микробиологических препаратов на основе ризобий.
Однако необходимо при этом понимать, что процесс фиксации атмосферного азота требует затрат большого количества энергии, и бактерии в естественных условиях с искусственно измененным азотфиксирующим статусом будут, скорее всего, неконкурентоспособны. Данный факт также был отмечен в работе An с соавт., в которой сообщалось, что хотя при обработке рекомбинантным штаммом Enterobacter gergoviae, содержащим конститутивно экспрессирующийся пі/А ген, и происходит увеличение роста кукурузы, является очевидным то, что такие бактерии в естественных условиях не будут выдерживать конкуренции со стороны других микроорганизмов ввиду высокой энергозатратности процесса азотфиксации (Anetal.,2007).
В связи с этим нами был проведен эксперимент по исследованию возможности разделения двух событий (конститутивной экспрессии гена пі/А и процесса азотфиксации) на разных штаммах микроорганизмов. Для конститутивной экспрессии пі/А был выбран штамм Enterobacter sp. Е35, который является ассоциативным симбионтом для многих видов растений и не содержит симбиотические гены. В дальнейшем в него была трансформирована созданная нами генно-инженерная конструкция pTurboGFP-BnifApBBRIori. Полученный рекомбинантный штамм культивировали совместно с диким штаммом R. leguminosarum и в последующем для этой смеси также была определена нитрогеназная активность.
Интересным оказался тот факт, что при совместном культивировании рекомбинантного штамма Enterobacter sp. Е35 с R. leguminosarum дикого типа, у последнего также наблюдается нитрогеназная активность, хотя и чуть меньшая (2,6 мкг /мл/ч), чем у рекомбинантной R. leguminosarum (3,1 мкг N2/NUI/4) (рис. 12).
В данном случае механизм индукции нитрогеназного комплекса является предметом для дальнейших исследований. Но тот факт, что запуск нитрогеназного комплекса клубеньковых бактерий может осуществляться за счет наличия генно-инженерной конструкции, содержащего ген пі/А под управлением конститутивного промотора в других бактериях, делает возможным создание бинарных препаратов биоудобрений, где каждый составляющий штамм данного препарата по отдельности не будет терять своих конкурентоспособных свойств. Данный механизм индукции также дает возможность получать различные комбинации микроорганизмов, а также мобилизировать нитрогеназную активность аборигенных штаммов ризобий.
Таким образом, нами была продемонстрирована принципиальная возможность искусственной активации нитрогеназного комплекса R. leguminosarum ex planta за счет изменения регуляции гена пі/А, продукт которого играет ключевую роль в запуске процесса азотфиксации при симбиотическом взаимодействии ризобий с растением-хозяином.
