Введение к работе
Актуальность проблемы. Клубеньковые бактерии (ризобии) - обширная, генетически разнородная группа почвенных грамотрицательных микроорганизмов, способных вступать во внутриклеточный симбиоз с бобовыми растениями и обеспечивать фиксацию атмосферного азота.
Интерес к этим бактериям со стороны исследователей связан, с одной стороны, сельскохозяйственной значимостью симбиотической азотфиксации и необходимостью разработки генетических методов селекции и конструирования хозяйственно-ценных штаммов ризобий, инокуляция которыми позволяет получать высокие урожаи бобовых культур без использования дорогостоящих и экологически небезопасных азотных удобрений (Симаров, 1990), а с другой - использованием ризобий как модельного объекта для изучения биологии взаимодействия микроорганизмов с высшими растениями, генетического контроля и эволюции симбиотических систем (Онищук, 1995).
Одной из актуальных задач современной биотехнологии является исследование генетических ресурсов клубеньковых бактерий, особенно естественных природных популяций, где наиболее эффективным подходом для этих исследований является анализ их генетического разнообразия, результатом которого может быть понимание процессов возникновения новых генотипов за счет мутаций, рекомбинаций, горизонтального переноса генов. В настоящее время для характеристики ризобий широко используются различные молекулярно-генетические методы. Преимущество этих методов состоит в том, что они позволяют получать стабильные характеристики, независящие от физиологического статуса микроорганизма.
Значение таких исследований велико, поскольку они могут позволить выявить наиболее удачные комбинации геномов ризобий, которые могут быть использованы в качестве основы для направленного генетического конструирования штаммов, перспективных для практики.
Рациональное использование свойств аборигенных популяций ризобий, в перспективе, несомненно, является важным элементом биологизации земледелия и создания адаптивно-интенсивной стратегии растениеводства не только бобовых культур, но за счет использования ассоциативного симбиоза и других сельскохозяйственно значимых растений.
Создание искусственных азотфиксирующих ассоциаций культурных растений с эндофитными микроорганизмами, которые выделены из природных симбиозов, является относительно новым направлением в биоинженерии симбиотических систем. Клубеньковые бактерии могут также выступать и в качестве ассоциативных микросимбионтов для многих экономически ценных небобовых культур, таких как рис, кукуруза, пшеница, рапс, подсолнечник и т. д. Эти бактерии способны колонизировать корневую систему и повышать урожайность растений, выделяя ростостимулирующие вещества и защищая от фитопатогенов. Как показали исследования последних лет, ризобии принимают активное участие в усвоении растениями труднорастворимых соединений фосфора и даже, проникая в надземную часть растения, могут усиливать процесс фотосинтеза (Chi et al, 2005; Черемных и др., 2007; Perrine-Walker et al., 2007) . Поэтому получение искусственных симбиотических ассоциаций этих бактерий с различными видами растений является одним из наиболее перспективных направлений на пути создания экологически ориентированного сельского хозяйства. Вместе с тем, следует отметить, что эти процессы неконтр о лиру емы, и в естественных условиях ризосферные бактерии с полезными признаками, к сожалению, не выдерживают конкуренции и вытесняются более агрессивными бактериями, зачастую обладающими фитопатогенными свойствами. Задача исследователей состоит в том, чтобы придать растениям способность контролировать микрофлору своей ризосферы.
Цель работы заключалась в исследовании генетического разнообразия и филогении клубеньковых бактерий дикорастущих видов бобовых растений Южного Урала и разработке подходов для использования биологического потенциала данных бактерий при культивировании небобовых хозяйственно-ценных растений.
Задачи исследования:
Собрать коллекцию штаммов клубеньковых бактерий дикорастущих видов бобовых растений Южного Урала, проанализировать их генетическое разнообразие и определить филогенетическое положение.
С целью выявления возможности влияния горизонтального переноса генов на видовое разнообразие микросимбионтов исследованных растений провести филогенетический анализ симбиотических и 16S рибосомных генов.
Создать плазмидные конструкции для мечения клубеньковых бактерий флуоресцентными белками и получить маркированные штаммы для их детекции in vivo и in vitro.
Провести анализ полиморфизма генов лектинов представителей рода Lathyrus, вступающих в симбиоз с клубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarum bv. viciae.
Оценить специфичность взаимодействия лектинов из семян гороха посевного и козлятника восточного с клубеньковыми бактериями Rhizobium leguminosarum bv. viciae и Rhizobium galegae.
Исследовать возможность адгезии клеток ризобийRhizobium leguminosarum bv. viciae на контрольных и трансгенных по гену лектина psl бородатых корнях растений рапса и табака.
На модельных растениях трансгенного табака и композитных растений томата и рапса изучить возможность специфичной колонизации их ризосферы целевым видом клубеньковых бактерий в условиях конкуренции с почвенной микрофлорой.
Научная новизна. Изолировано более 1200 штаммов ризобий из клубеньков 36-ти видов дикорастущих бобовых растений, относящихся к 12-ти родам. Исследовано их генетическое разнообразие и на основе сравнительного анализа последовательностей генов 16S рРНК определено их филогенетическое положение.
Выявлено, что для штаммов ризобий, выделенных из клубеньков дикорастущих видов растений трибы Vicieae, которые по последовательности генов 16S рРНК за небольшим исключением относятся к виду Rhizobium leguminosarum, характерна высокая степень гетерогенности, обусловленная различиями в их плазмидном составе, вызванная, предположительно, высокой трансмиссивностью мобильной части их генома. С помощью кластерного анализа RAPD-фингерпринтов данных штаммов обнаружено, что внутри популяции клубеньковых бактерий существует разделение на субпопуляции, рекомбинационные процессы между которыми имеют определенные ограничения.
Несмотря на то, что почти все исследованные штаммы, вступающие в симбиоз с растениями трибы Vicieae, относились к Rhizobium leguminosarum, у некоторых видов растений рода Lathyrus в клубеньках были обнаружены
бактерии, не являющиеся типичными симбионтами для этих растений. Так, в клубеньках у L. vernus и L. sylvestris идентифицированы ризобии, близкие к R. tropici, у L. palustris - бактерии, близкие к Agrobacterium sp., а у L. gmelinii - к Phyllobacterium sp. Выявлено, что симбиотические гены данных артефактных бактерий имеют филогенетическое родство с аналогичными генами, ранее описанными у бактерий Rhizobium leguminosarum bv. viciae, что, скорее всего, и является причиной изменения их специфичности.
Показано, что основными симбионтами дикорастущих видов бобовых растений подтрибы Astragalinae трибы Galegeae в условиях Южного Урала являются бактерии рода Mesorhizobium, хотя некоторые виды растений данной подтрибы в зависимости от почвенно-климатических условий способны вступать в симбиоз и с представителями других родов ризобий, таких как Rhizobium, Bradyrhizobium, Ensifer. Для растений трибы Genisteae характерно преобладание в клубеньках бактерий рода Bradyrhizobium, для растений трибы Hedysareae - Mesorhizobium. Все полученные из клубеньков растений Coronilla varia (триба Loteae) штаммы бактерий по последовательности генов 16S рРНК оказались близки к бактериям Rhizobium leguminosarum.
У штамма ризобии, изолированного из клубенька Н. razoumowianum, близкого по последовательности гена 16S рРНК к Bradyrhizobium, обнаружен ген nifH, имеющий заметно большую гомологию с аналогичными генами, описанными у Mesorhizobium, что может служить аргументом в пользу горизонтального переноса генов.
Создана серия векторов экспрессии, содержащих гены флуоресцентных белков TurboGFP и TurboRFP под контролем конститутивного промотора фага Т5, предназначенных для прижизненного окрашивания клубеньковых бактерий. Векторы на основе репликона широкого круга хозяев pBBRI предназначены для мечения штаммов с экспрессией маркерного гена с трансформируемой плазмиды, а векторы на основе плазмиды pRL765gfp созданы для маркирования штаммов путем введения генов флуоресцентных белков в состав хромосомы бактерий.
Показано, что для переноса конструкций в клетки клубеньковых бактерий наиболее предпочтителен метод трансформации, поскольку при наличии mob-участка в векторах, необходимых для конъюгативного переноса, возможна случайная мобилизация плазмиды и ее переход из клеток маркированных штаммов в другие почвенные бактерии.
У растений L. vermis, L. palustris и L. gmelinii обнаружено несколько изоформ лектинов, что может быть причиной выявленной в работе пластичности при выборе микросимбионтов данными видами растений.
Показана специфичность агглютинации лектинами из семян гороха посевного (Pisum sativum) (PSL) ризобий R. leguminosarum bv. viciae, и лектинами из семян козлятника восточного (Galega orientalis) (GOL) - R. galegae.
Продемонстрировано, что используя гены лектинов бобовых растений в качестве трансгенов, можно создавать искусственные ассоциации клубеньковых бактерий с несимбиотрофными растениями. На трансгенных по гену лектина PSL гороха растениях табака показана избирательность колонизации их ризосферы бактериями R. leguminosarum bv. viciae в условиях конкуренции с естественной микрофлорой почвы.
Практическая значимость работы. Собрана и генетически охарактеризована коллекция штаммов клубеньковых бактерий, вступающих в симбиоз с дикорастущими бобовыми растениями Южного Урала. Сведения о генетическом разнообразии и филогении клубеньковых бактерий, полученные в ходе исследований, могут быть использованы как для селекции высокоэффективных и приспособленных к почвенно-климатическим условиям Южного Урала штаммов клубеньковых бактерий, так и для создания штаммов ризобий с полезными для сельского хозяйства признаками. В связи с тесным взаимодействием бобовых растений со своими микросимбионтами, зачастую определяющих их экологическую нишу и нередко ареал распространения, новые знания о молекулярно-генетических особенностях и биоразнообразии клубеньковых бактерий таких краснокнижных видов бобовых как L. litvinovii, A. cornutus, A. helmii, Н. grandiflorum, Н. razoumowianum, О. hippolyti сделают возможным успешное интродуцирование этих растений из неблагоприятных мест в другие районы, и тем самым обеспечат их сохранение.
Серия векторов экспрессии, содержащих гены флуоресцентных белков TurboGFP и TurboRFP под контролем конститутивного промотора фага Т5, созданных для прижизненного окрашивания клубеньковых бактерий, может быть использована для научных экспериментов в области изучения бобово-ризобиальных симбиозов.
Разработанный экспериментальный подход к конструированию «искусственной ризосферы» несимбиотрофных растений, избирательно колонизируемой клубеньковыми бактериями (выполняющими полезные для
растений трофические, ростостимулирующие и/или защитные функции), путем введения в их геном в качестве трансгена гена лектина бобового растения, с которым данные ризобии вступают в симбиоз, может быть использован для создания стабильных и эффективных ассоциаций хозяйственно-полезных растений с ростостимулирующими азотфиксирующими микроорганизмами, которые могут найти самое широкое коммерческое применение в сельскохозяйственном производстве. Основные положения, выносимые на защиту
Клубеньковые бактерии дикорастущих видов бобовых растений Южного Урала представлены всеми основными родами ризобий: Rhizobium, Mesorhizobium, Ensifer (Sinorhizobium), Bradyrhizobium.
Основными симбионтами дикорастущих видов бобовых растений подтрибы Astragalinae трибы Galegeae и трибы Hedysareae в почвенно-климатических условиях Южного Урала являются бактерии рода Mesorhizobium.
Для растений трибы Genisteae характерно преобладание в клубеньках бактерий рода Bradyrhizobium.
Для клубеньковых бактерий дикорастущих видов растений трибы Vicieae, относящихся к виду Rhizobium leguminosarum, характерна высокая степень гетерогенности, обусловленная различиями в их плазмидном составе.
Используя гены лектинов бобовых растений в качестве трансгенов, можно создавать искусственные ассоциации клубеньковых бактерий с несимбиотрофными растениями.
Конкурсная поддержка работы. Исследования были поддержаны грантами РФФИ-Поволжье (№ 10-04-97018_а) и грантами Президента Российской Федерации для государственной поддержки ведущих научных школ России (НШ-1003.2006.4 и НШ-649.2008.4), ГК N02.740.11.0290 ФЦП «Научные и научно-педагогические кадры инновационной России на 2009-2013гг.» Апробация работы. Материалы диссертации были доложены на Международной школе-конференции молодых ученых «Биотехнология будущего» (Санкт-Петербург, 2006); Международной конференции «Генетика в России и мире», посвященной 40-летию Института общей генетики им. Н.И. Вавилова РАН (Москва, 2006); III Межрегиональной конференции молодых ученых «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2006); Международной школе-конференции «Генетика микроорганизмов и биотехнология» (Москва, 2006); Всероссийской
конференции с международным участием «Фундаментальные и прикладные аспекты исследования симбиотических систем» (Саратов, 2007); V Всероссийской конференции молодых учёных «Стратегия взаимодействия микроорганизмов и растений с окружающей средой» (Саратов, 2010); 14-й международной Пущинской школе-конференции молодых учёных «Биология -наука XXI века» (Пущино, 2010); Всероссийском симпозиуме «Растение и стресс (Plants under Environmental Stress)» (Москва, 2010); VI Съезде Общества физиологов растений России «Физиология растений - фундаментальная основа экологии и инновационных биотехнологий» (Нижний Новгород, 2011); Международной конференции «Микробиология в решении современных проблем сельскохозяйственной микробиологии» (Санкт-Петербург, 2011). Публикации. Основные материалы диссертации изложены в 34 печатных работах, в том числе, 16 статей опубликованы в журналах из Перечня ВАК, из них 13 из международной базы цитирования, в 1-й монографии, а также депонированы в международных банках данных DDBJ/EMBL/GenBank. Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 302 страницах, содержит 35 рисунков и 6 таблиц и состоит из введения, обзора литературы, описания объектов и методов исследований, результатов исследований и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитированной литературы, включающего 580 работ.
