Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАОТЫ . 7
1.1. Краткая характеристика основных групп диазотрофов . 9
1.2. Современные аспекты изучения процесса биологической азотфиксации 13
1.2.1. Основы биохимии азотфиксации 13
1.2.2. Исследование генетики азотфиксации на модельном объекте Klebsiella pneumoniae .........15
1.2.3. Генетический контроль азотфиксации 29
1.3. Основные пути решения проблемы обеспечения растений биологическим азотом . 33
1.4. Бактерии, развивающиеся в растениях, как потенциальные азотфиксаторы 36
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ. ................ 41
2.1. Номенклатура 41
2.2. Виды и штаммы бактерий 41
2.3. Питательные среды . 44
2.4. Методы 45
2.4.1. Генетические 45
2.4.2. Молекулярно-биологические 47
2.4.3. Физико-химические .48
2.4.4. Методы фитопатологии 54
ГЛАВА 3. ПЕРЕНОС ПЛАЗМИДЫ pRD1 ИЗ Е. coli В ФИТОПАТОГЕННЬЕЕ
БАКТЕРИИ И ЭКСПРЕССИЯ ЕЕ ДЕТЕРМИНАНТОВ 56
3.1. Эффективность конъюгационного переноса плазмиды pRDi при скрещивании Е. coli с фитопатогенными бактериями 56
3.2. Экспрессия детерминантов антибиотикоустойчивости плазмиды pRDi у трансконъюгантов 59
3.3. Исследование ацетшіенредуктазной ( нитрогеназной ) активности трансконъюгантов 62
3.4. Особенности азотфиксации у трансконъюгантов X. beticola 8717 и Е. aroideae 8947 со стабильным
nif-фенотипом 67
3.4.1. Влияние кислорода на ацетиленредуктазную активность. . 68
3.4.2. Изучение гидрогеназной активности 69
3.5. Анализ плазмид трансконъюгантов 72
ГЛАВА 4. ВЛИЯНИЕ ПЛАЗМИДЫ pRD1 НА ИЗМЕНЕНИЕ НЕ ДЕТЕРМИНИРУЕМЫХ ІШАЗМИДОЙ СВОЙСТВ ИССЛЕДУЕМЫХ БАКТЕРИЙ. ... 81
4.1. Вирулентность и агрессивность трансконъюгантов. . .81
4.2. Культурально-биохимические свойства трансконъюгантов .93
4.3. Изучение возможности функционирования nif -генов трансконъюгантов Е. aroideae 8947 при развитии
их в растении, вегетирующем в открытом грунте. . .101
ГЛАВА 5. ОБСУЖДЕНИЕ РЕЗУЛЬТАТОВ. . . . . 106
ВЫВОДЫ 117
ЛИТЕРАТУРА 118
- Краткая характеристика основных групп диазотрофов
- Номенклатура
- Эффективность конъюгационного переноса плазмиды pRDi при скрещивании Е. coli с фитопатогенными бактериями
- Вирулентность и агрессивность трансконъюгантов.
Введение к работе
Превращение н2 в мн- является важным процессом на Земле. Осуществляют этот процесс отдельные прокариотические организмы (свободноживущие или симбиотические), превращая молекулярный азот атмосферы в аммоний, легкодоступный для низших эукариотов и растений.
Биологически связанный азот снабжает растения лишь на 60-70 #. Для обеспечения сельскохозяйственных культур азотом используют минеральные азотные удобрения. Их производство требует значительных энергетических затрат, а применение удобрений приводит к загрязнению окружающей среды и нарушению баланса в экосистемах /Gutschnik, 1980/.
Учитывая вышеизложенное, решение проблемы азотного дефицита возможно путем радикального увеличения вклада биологической азотфиксации. Для этого, прежде всего, необходимо понимание генетики этого процесса и разработка способов переноса генов азот-фиксации (nif) между различными бактериями. Наибольшее количество экспериглентов по изучению переноса и экспрессии генов азот-фиксации выполнено с гибридной плазмидой ріФі, сконструированной Диксоном с соавторами на основе плазмиды RP4 и ДНК Klebsiella pneumoniae /Dixon et al., 1976/. С ПОМОЩЬЮ этой плазми-ды созданы новые формы грам-отрицательных и грам-положительных бактерий с nif-фенотипом. Исследование экспрессии ее детерминантов в различных объектах дает возможность установить закономерности выражения генов азотфиксации в неодинаковых условиях, а также изучить их генетическую стабильность.
В данной работе плазмида рШ)1 использовалась для изучения возможности переноса генов азотфиксации в бактерии Xanthomonas beticola и Erwinia aroideae, развивающиеся в растениях, и в процессе исследования этой проблемы изучалась более детально. Основные вопросы, решаемые в работе, можно сформулировать следующим образом:
Осуществим ли перенос плазмиды рШ)1 в бактерии родов Xanthomonas И Erwinia ?
Будет ли происходить экспрессия генов азотфиксации з этих бактериях?
Какова судьба ДНК плазмиды pRDi в рецшшентных клетках?
Какое влияние оказывает введение плазмиды на фенотипи-ческие свойства бактерий?
Возможно ли функционирование nif-генов, перенесенных на плазмиде pRDi, в клетках бактерий, развивающееся in pi ant а?
Основные результаты, полученные в данной работе, сводятся к следующему: - плазмида pRD1 переходит ИЗ Escherichia colі K-12J62 в исследуемые объекты при конъюгащш, однако в клетках коныогантов нестабильна и диссоциирует у небольшой части трансконъюгантов X, beticola 8717 сразу после перехода из донора и у большинства трансконъюгантов X. beticola 8717, 7325 и Е. aroideae 8634, 8947 - при пассировании бактерий в неселективных условиях; при этом в первом случае nif -гены интегрируют в хромосому реципиента в результате постконыогащюнной рекомбинации, в другом -pRDi деградирует с элиминацией nif-генов из клетки (X, beticola 8717, 7325, Е. aroideae 8634, 8947) ШШ транспозицией их из плазмиды в хромосому реципиента (Е. aroideae 8947). Во всех случаях "образуются плазмиды меньшей молекулярной массы, идентичной - RP4; - стабильные по nif-признаку клоны X. beticola 8717(pRDi) и е. aroideae 8947(pRDl) экспрессируют гены, ответственные за азотйиксанию, в аэробных условиях, в отличие от донора nif-генов К. pneumoniae; перенос плазмиды pRDl из Е. сої і методом конъюгации в X, beticoia 8717 сопровождается изменением фенотшшческих свойств трансконъюгантов и появлением у них признаков, не свойственных родительским штаммам; стабильная экспрессия nif-генов К. pneumoniae возможна у трансконъюгантов Е. aroideae 8947 (рШ>1)при развитии последних не только на специальной среде, но и непосредственно в ткани растения.
ШВА I. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
Около ста лет назад Гельригель и Вильфарт обнаружили азот-фиксацию у бобовых растений. К тому времени уже были описаны клубеньковые бактерии М.С. Ворониным и высказано предположение о их роли в образовании клубеньков у бобовых растений. Позднее М. Бейеринк изучил свойства бактерий, выделенных из клубеньков гороха, вигны, чины, фасоли и других бобовых, а Б. Франк ввел в литературу родовое название этих бактерий Rhizobium. Исследование этого процесса проводилось в дальнейшем в микробиологическом и агрономическом аспектах. Только в последние 50 лет было сосредоточено внимание на изучении биохимии, а немногим более 10 лет назад - генетики азотфиксапии.
На рубеже XX века уже были описаны свободноживущие азотфик-сируїощие анаэробы и аэробы: в 1893 г. G.H. Виноградский выделил ИЗ ПОЧВЫ Clostridium pasteurianum, позже, В 1901 Г., М. Бейе-ринк описал Azotobacter. Долгое время клостридии и азотобактер считались едва ли не единственными свободноживущими азотфиксато-рами, и, вероятно, поэтому они стали традиционными объектами исследования процесса биологической азотфиксации в течение длительного времени.
В первой четверти нашего века обнаружили способность фиксировать азот в чистой культуре у синезеленых водорослей; в течение следующих 25 лет открыты фотосинтезирующие бактерии. Дальнейшие исследования, особенно после появления высокочувствительного ацетиленового метода /Hardy et ai., 1968/, позволили открыть в почве и водоемах большое количество микроорганизмов, обладающих способностью связывать азот атмосферы. Это актиномицеты, мико -бактерии, спириллы и многие другие прокариоты (Табл. I). Ни один эукариотический организм таким свойством не обладает /Кононков и др., 1979/. В настоящее время известны не только естественные,
Таблица I Биологические агенты, способные Фиксировать азот - 14 тыс. видов - 160 тыс. видов атмосферы й Симбиоз Ризобии + бобовые растения Актиномицеты, бактерии + небобовые покрытосеменные высшие растения
Симбиотические ассоциации синезеленые^^ клубеньки на листьях водоросли х^^/^>клубеньки на корнях іайники бактерии еченочники филлосферные ассоциаци изосферные ассоциации
Асимбиоз
Естественные азотфиксаторы:
Синезеленые Бактерии: аэробные (Azotobacter, Azospirillum) факультативные (Bacillus polymixa) анаэробные нефотосинтетшш (Clostridium, Desulfovibrio, Methanobacterium) анаэробные фотосинтетики: пурпурные несерные (Rhodopseudomonas, Rhodospirillum) пурпурные серные (Thiocapsa)
Сконструированные азот-фиксаторы: Escherichia colі Salmonella typhimurium Serratia marcescens Erwinia herbicola Enterobacter cloaceae Bacillus subtilis
По данным литературы, цитированной в тексте но и сконструированные человеком микроорганизмы-азотфиксаторы. Кроме них описано много симбионтов неустановленной таксономии.
I.I. Краткая характеристика основных групп азотфикси- руюпшх организмов
Значительное большинство прокариотических диазотрофов образуют взаимополезные физиологические ассоциаций с другими организмами, в том числе с высшими эукариотами. Наиболее давно известен симбиоз бактерий рода Rhizobium с бобовыми растениями. Фиксация азота происходит в высокоорганизованных (генетически и биохимически) корневых клубеньках, формирующихся при взаимодействии бактерий с растениями. Ризобий снабжают растения продуктами азот-фиксации, в то время как роль растения заключается в том, чтобы поставлять окисляемые субстраты (энергию) для процесса азотфик-сации /Bergersen, 1967/.
Известны небобовые растения, на которых могут образовывать клубеньки и фиксировать азот ризобий. Это растения Parasponia и Tribuius. Сами эти растения имеют также азотфиксирующие клубеньки с собственными бактериями-симбионтами, которые напоминают ^ медленнорастущих ризобий. Симбионты клубеньков Tribuius могут эффективно заражать такие типичные бобовые растения, как вигна /Trinick, 1976, 1979/.
Высокоорганизованным азотфиксирующим симбиозом является симбиоз актиномицетов (сем. Frankiaceae) с небобовыми покрытосеменными растениями /Becking et ai., 1964/.По разнообразию видов растений, способных образовывать на корнях азотфиксирующие клубеньки, этот симбиоз занимает ведущее место. Являясь, в основном, древесными и кустарниковыми растениями,они играют важную роль в природных экосистемах,произрастая на почвах,бедных азотом, и обогащая их биологически связанным азотом.В настоящее время симбиоз актиномицеты - небобовые растения не имеет такого практичес- кого значения, как бобово-ризобиальный, однако в будущем оно может оказаться немалым. Растения, на корнях которых образуются клубеньки при инфекции актиномицетами, могут быть полезными при рекультивации земель (Alnus glutinosa, A. rubra, Dryas sp. ), получении древесины (Causarina), борьбе с эрозией ПОЧВ (НІррО-phae, Purshia) /Калакуцкий, Парийская, 1982/.
В последние годы обнаружено, что азотфиксируїощие бактерии образуют и менее специализированные ассоциации с корнями растений. Они не формируют клубеньки, а размножаются на поверхности корней или в межклеточниках /Dobereiner et ai., 1976/. Такие ассоциации названы ризосферними и существуют по такому же принципу, как и клубеньковые: бактерии используют корневые выделения растений или углеводы их внутренних тканей корня, а растение - связанные формы азота, поставляемые бактериями-азотфиксаторами. Ассоциации такого типа обнаружены у кукурузы, риса, пшеницы и других ценных сельскохозяйственных культур. Согласно данным лаборатории Доберейнер, устойчивые ассоциации- образуют бактерии видов Azo-spiriiium lipoferum и A. brasilense, причем наблюдается определенная форма хозяйской специфичности. Так, A. lipoferum предпочтительно заражают растения С^-группы (кукуруза, тропические травы) , a A. brasilense - растения Cg-группы (рожь, пшеница, овес, ячмень) /Dobereiner, Boddley, 1981/. Азоспириллы способны фиксировать азот как в свободоживущем состоянии, так и в ассоциации с растением.
Среди различных азотфиксируюших прокариот особый интерес представляют синезеленые водоросли цианобактерии , обладающие способностью фиксировать молекулярный азот и строить свои клетки за счет энергии солнца, воды и С02. Местом связывания азота у си-незеленых, принадлежащих, к родам Nostocales и Stigonomales, - II - являются гетероцисты - клетки, в которых не происходит фотосвязывания С0 и выделения кислорода, что: способствует поддержанию в них низкого парциального давления С^. У синезеленых', не имеющих гетероцист (Plectonema, Phormidium, Gleocapsa и др.), обнаружено связывание азота лишь в анаэробных условиях /Fay et al., 1968; Калининская и др., I98I/.
Экологическая ниша обитания синезеленых - места с пониженным парциальным давлением, кислорода - затапливаемые рисовые поля, озера с недостатком растворенного 02, горячие источники, засоленные марши. Отдельные виды синезеленых ассоциированы с эукариота-ми - грибами.(лишайники), водорослями, мхами, папоротниками, печеночниками, саговниками, растениями из семейства цикадовыхги некоторыми мангровыми. Такие ассоциации отличаются высокой специфичностью. В ассоциациях: синезеленые имеют более высокую биохимическую активность, отличаются интенсивной окраской, претерпевают ряд морфологических изменений по сравнению с чистой культурой. Вероятно, синезеленые извлекают пользу из совместного существования с эукариотами, используя их ферментные системы (в частности, глютаминсинтетазу ) /Rai et al.,1981/. В последние годы обращают внимание на такой компонент ассоциации синезеленые - эукариоты, как бактерии, играющие роль в поддержании низкого парциального давления кислорода в окружении синезеленых /Gates et al., 1980/.
Описаны многочисленные виды свободноживущих азотфиксирующих бактерий. По современным представлениям, несимбиотическую азот-фиксацию осуществляет очень широкий круг разнообразных: гетеротрофных и. автотрофних бактерий - аэробных, факультативно-анаэробных и-аэробных, фотосинтезирующих и нефотосинтезирующих, грам-положи-тельных и грам-отрицательных, споро- и цистообразующих:, метаноб-разующих и метанокисляющих, сульфатредуцирующих, водородных л других /Stewart, 1982/.
Широкое распространение и высокую численность в почвах всех типов имеют гетеротрофные сапрофитные диазотрофы Azotobacter, Bacillus, Clostridium, Klebsiella, ЧТО дает основание считать их активными участниками в суммарном процессе биологической фиксации азота в почве. Обнаружена их высокая азотфиксирующая активность в ризосфере растений /Мишустин и др., 1978/.
Свободноживущие азотфиксиругощие организмы и организмы, живущие в ассоциации с высшими и низшими растениями, поставляют в биосферу ежегодно 175 млн. метрических тонн азота /Postgate, 1978/. Около половины этого количества приходится на долю клубе-ньковых бактерий (80 х 10 мтонн). Микроорганизмы, живущие в симбиозе с зелеными растениями, имеют преимущество перед другими азотфиксаторами в том, что углеводы, выделяемые растениями, используются ими как источник энергии для азотфиксации. Свободноживущие синезеленые водоросли и фотосинтезирующие бактерии сами синтезируют углеводы в процессе фотосинтеза и поэтому способны синтезировать азот в значительных количествах. Бактерии, не способные усваивать солнечную энергию, должны получать ее из органических соединений, синтезируемых другими организмами. По этой причине ризобии усваивают от 67 до 600 кг/га в год азота, свободноживущие синезеленые - 25, а в ассоциации с высшими растениями - до 600, свободноживущие бактерии Azotobacter ИЛИ, Clostridium - от 0,1 до 0,5 кг/га в год /Postgate, 1978 /.
Всего на долю биологически связанного азота приходится 60-70 % от общего количества азота, поступающего в биосферу. Минимальное количество его соединений поступает в общий баланс азота Земли в результате различных атмосферных явлений. Всего этого количества азота, поставляемого азотфшссирующими прокариотами и атмосферой, далеко не достаточно для снабжения растений важным ор- - ІЗ - галогенным элементом. Поэтому в почву для питания растений ежегодно вносятся десятки миллионов тонн, дорогостоящих минеральных' и. органических: азотных,удобрении (сульфата аммония, калийной селитры, мочевины и др.). Вносимые азотные удобрения усваиваются растениями-лишь на 30-40 %, кроме того, иг применение приводит к подавлению развития диазотрофов в почве денитрификаторами. и загрязнению окружающей среды. Оправданным, путем решения проблемы снабжения растений азотом может быть только биологическая азот-фиксация. В настоящее время определились основные направления, по которым может развиваться азотфиксация /Evans, Barber, 1977; Postgate, 1978; Кордюм, 1982/. По некоторым из них ведется интенсивная работа, однако успешно решить проблему азотного дефицита растений можно лишь на основе всестороннего изучения процесса азотфиксации: его биохимии, генетики, регуляции.
1.2. Современные аспекты изучения процесса биологической азотфиксации 1.2.1. Основы биохимии, азотфиксации
Сведения о нитрогеназе (1.6.6.1.) - ферменте, ответственном за биологическую азотфиксацию, - появились в период 1960-1965 гг. В I960 г. впервые был выделен бесклеточный экстракт нитрогеназы из CI. pasteurianum /Carnahan et al., 1960/. На основании его исследования были сделаны следующие важные выводы: I) фермент является чувствительным к кислороду; 2) для его активности, необходимо наличие восстановителя и. АТФ; 3) переносчиками электронов к нему служат ферредоксин и флаводоксин.
Исследования последних лет показали наличие сложной четвертичной структуры нитрогеназы. Высокоочищенные препараты нитрогеназы получены из всех:основных групп азотфиксирующих: прокариот; у всех ихс она имеет удивительную универсальность структуры и. состоит из двух белков. Mo-Ре-белок является cL^-fii. тетрамером с молекулярной массой около 220 тыс. и содержит 2 атома Мо, 22-34 Ре и такое же количество кислотолабильной серы на один тет-рамер; Ре-белок - димер молекулярной массы 50-60 тыс. - содержит 4Pe4S кластер/Eady et ai., 1982/. Кинетические опыты выявили 3 участка в сложном активном центре нитрогеназы: центр восстановления азота, АТФ-азный центр и центр* переноса электронов. Ключевое событие в процессе восстановления молекулярного азота -гидролиз АТФ. При этом сопряженно происходит перенос электронов с Ре-белка, на который электроны поступают от экзогенного донора, на Mo-Ре -белок, окислительно-восстановительный потенциал которого становится достаточным для восстановления молекулярного азота. Редукция N« до аммиака происходит с образованием промежуточных продуктов - гидрида азота и гидразина /Eady et ai., 1981/. На эту реакцию затрачивается in vitro от 12 до 15 молей АТФ /Shubert, Evans, 1976/. Кроме N2 и других субстратов (ацетилен, азид, цианид, метилизоциан), нитрогеназа восстанавливает Б* до Hg /Mortenson, Chen, 1974/. Около одной трети энергии в виде АТФ и восстановительных эквивалентов теряется при вьщелении водорода у К. pneumoniae /Andersen et al., 1977/.
Некоторые азотфиксирующие организмы (ризобии, азотобактер, азоспириллы) обладают системой окисления ^-hup (hydrogen uptake) , которая потребляет водород, образующийся в результате функциошфования нитрогеназы, и, таким образом, препятствует потере энергии в процессе азотфиксации. /Dixon, 1968; Pinkwart et al., 1979; stephan et al., 1981/. На окисление H? затрачивается Q2, в результате, чего происходит образование АТФ путем окислительного фосфорилирования, а также осуществляется дыхательная защита нитрогеназы /Dixon, 1972; Emerich et al., 1979/. Rh. meiiioti может окислять весь водород, образующийся при азотфиксации /Emerich et al., 1980/. У A. chroococcum энергия, выделяемая за счет рециркуляции водорода, образующегося при действии нитрогеназы, составляет 7 % от общего количества энергии, выделяемой при дыхании- /Walker et al., 1981/.
Кпд азотфиксаторов, имеющих hup*-фенотип, значительно выше, чему hup"-вариантов. Так, показано, что урожайность сои выше, если, клубеньки на ее корнях образованы использующими водород штаммами hup+ Rh. japonicum , а не штаммами hup /Lim et al., 1980/. Между Тем» в природе преобладают азотфиксирующие микроорганизмы, имеющие hup"-фенотип. Поэтому одной из немаловажных задач биологической фиксации азота является создание методами генетической инженерии hup+ хозяйственно -ценных азотфикси-рующих организмов. Сейчас уже известно, что у многих бактерий ішр+-фенотил детерминирован: плазмидами, некоторые из них являются трансмиссивными /Lira et al., 1980; Andersen et al.,1981 /. Hup-гены ризобий клонируют в составе гибридных плазмид Е. coli / Cantrell et al., 1983/. Перенос генов hup на укороченные R-плазмиды и введение таких R-hup-плазмид в агрономически ценные штаммы ризобий может дать заметный экономический эффект.
1.2.2. Исследование генетики азотшиксации на модельном объекте К. pneumoniae Для решения проблемы снабжения растений биологически связанным азотом появилась необходимость исследования генетики азотфиксации. Без знания ее невозможно изучение nif-генов и направленного их изменения по пути создания новых хозяйственно-ценных азот1-фиксирующих организмов. Ближайшими задачами, возникшими в этом плане, были разработки, методов генетического переноса nif-генов для различных бактерий, усваивающих азот, а также методов карти- рования их nif -области. Для выполнения поставленных заданий созрели, и объективные предпосылки: методические подходы, позволяющие изучать генетическую организацию и осуществлять передачу генетического материала, были разработаны к тому времени у Е. coii. Логичным оказался выбор Стрейхера с соавт. /streicher et ai., 1971/ в качестве объекта исследования генетики азотфик-сапии родственную кишечной палочке азотфиксирующую энтеробакте-рию К. pneumoniae.
К. pneumoniae ОТНОСИТСЯ К семейству Enterobacteriaceae. Это близкая кишечной палочке бактерия, способная фиксировать азот в анаэробных или микроаэрофильных условиях. Кяебсиелла и кишечная палочка легко конъюгируют друг с друтом, имеют общих фагов, их геномы высокогомологичны. В природе к. pneumoniae широко распространена и часто выделяется из почвы /Knittie, 1975; Knowles et ai., 1974/ и воды, с поверхности овощей и семян /Silver, 1969; Brown, Seidler, 1973/. Известна она как патогенный агент ЖИВОТНЫХ И. человека /Bergersen, Hipsley, 1970; Chambers, Silver, 1977/, существует как симбионт тропического растения Psychotria bacteriophyta, на листьях которого образует клубеньки /silver et el., 1963/.
Для изучения процесса азотфиксации в качестве модельного объекта избран бескапсульный штамм к. pneumoniaeM5al, полученный П. Вильсоном.
Одной, из главных основ для генетических исследований на любом объекте является выделение различных мутантов. В период 1971-1976 гг. у к, pneumoniae выделены сотни разнообразных nif-мутантов методами химического мутагенеза и трансдукции. Анализ де-леций, полученных с помощью бактериофага PI, позволил определить локализацию nif-генов на генетической карте хромосомы- к. pneu- moniae: они располагаются кластером между генами his и shi А /streicher et ai., 1972/. В 1975 г. группой Сент-Джона картированы первые 5 nif-генов /St John et al., 1975/*
В дальнейших исследованиях для получения мутаций в. nif-области: использовали бактериофаг Ми, что значительно увеличило возможности1 генетического анализа. В норме штаммы к. pneumoniae резистентны к фагу Ми, В 1976 г. Бахубер с соавт. выделили клоны клебсиеллы, чувствительные к Ми, и разработали метод получения nif-делеции с помощью этого фага /Bachhuber et al., 1976/. В течение 1977-1978 гг. этим методом была создана огромная коллекция nif-мутантов клебсиеллы, которые кроме делений содержали и мутации сдвига рамки считывания-.
Работы Диксона с соавт. /Dixon et al., 1977/ положили начало получению полярных мутаций у к. pneumoniae с помощью транс-позонов Тп5, Тп7, ТпЮ, имеющих специфичность к nif-генам. Делеции, полученные в nif-кластере к. penumoniae с помощью одних транспозонов или совместно с Ми, успешно использовали для генетического и физического картирования nif-области хромосомы.
Второй основой для генетики считают возможность переноса между штаммами хромосомного материала, что достигается посредством трансдукции, конъюгации, трансформации.
Для клебсиеллы была известна трансдукция общего типа фагом PI. Возможности, этого метода были расширены за счет фага Ми. (йюіщфическуто трансдукцшо nif-генов осуществляют фаги М»Сконструированы они с помощью Ми и nif-плазмиды РТМ. Изучение генетических свойств Л& nif показало, что они включают различное количество nif-генов (от 4 до 14). Некоторые фаги содержат только nif-гены, другие - nif- и смежные с ними his -гены /McNeil, Brill, 1980/.
Конъюгация для К, pneumoniae MA5I не была описана, так как для клебсиеллы не была известна собственная система переноса генетической информации. Впервые перенос хромосомных маркеров клебсиеллы при помощи R-фактора был получен в 1972 г. Диксоном и Постгейтом, которые ввели в клетки бактерии плазмиду R144 от: Е. coli и получили перенос хромосомных маркеров с частотой 10 на клетку донора /Dixon, Postgate, 1972/. Поскольку эта частота, мала для эффективного генетического анализа, метод конъюгащш практически не применялся при изучении структуры nif-области. Сейчас ,с использованием бактериофага Ми ,разработан метод существенного повышения частоты переноса хромосомных маркеров при конъюгации. Фаг Ми включают в трансмиссивны!! R -фактор и в хромосому, в результате чего благодаря рекомбинации между профага-ми бактериальная хромосома может быть мобилизована R-фактором.; частота переноса хромосомных маркеров при этом повышается на 3-4 порядка. Помимо мобилизации хромосомных генов бактериофаг Ми, введенный в клетки клебсиеллы в составе ллазмиды, может сущест-венноувеличить частоту включения nif-генов из хромосомы в плазмиду за счет интеграции его в хромосому и транспозиции из нее генов в плазмиду. Сейчас получена транспозиция в плазмиду his-nif -района клебсиеллы, и показано, что транспозированная ДНК в: плазмиде. окружена двумя профагами Ми в одинаковой ориентации /Faeien, Toussaint, 1976/. Введение бактериофага Mute в клетки, реципиентов, содержащих nif-плазмиду с мутацией в гене rfb ( вследствие чего клетки чувствительны к Mu), обеспечивает включение nif-генов в хромосому /Nguyen et al., 1983/.
С помощью фага Ми разработан качественно новый метод изучения работы nif -оперонов - метод слияния nif-генов клебсиеллы и lac -оперона кишечной палочки. В качестве меры выражения слившихся оперонов применяют активность не нитрогеназы, а легкоопределяемого фермента js-галактозидазы /Mac Neil, Brill, 1979/. Широкие возможности генетического анализа nif-области К. pneumoniae открыло создание плазмид, несущих nif-гены клебси-еллы. Сконструированы трансмиссивные плазмиды двух грутш несовместимости, несущие nif-гены К. pneumoniae. Это F-плазмида PN68 и Р-плазмида pRDi и ее производные. PN68 несет his, nif и некоторые другие детерминанты хромосомы К. pneumoniae, а также гены Е. соїі, ДЖ ї"-фактора и. Р-плазмиды /Cannon et al., 1976/. Эту плазмиду использовали для получения информации относительно сохранения и экспрессии nif -генов при переносе их в другие виды микроорганизмов. Шв8 ЭКСПрессировала nif-гены В Klebsiella aerogenes, Salmonella typhimurium /Cannon et al., 1976/, в разнообразных мутантах E. coli /Skotnicki, Rolf, 1977a,d; 1978/. В Erwinia herbicola передавались лишь гены, ответственные за резистентность к кар-бенищшшну и образование фимбрий. Не обнаружен перенос этой плазмиды в Proteus mirabilis.
Такім образом, было показано, что круг хозяев для плазмиды, сконструированной на основе Р -фактора, невелик, так как она ре-стриктируется в неродственных видах бактерий. Это препятствие на пути создания разнообразных nif-организмов преодолевается созданием nif-плазмид на основе Р-плазмид. Последние принадлежат к особому тішу плазмид, отличительной особенностью которых является сосуществование в клетке с другими плазмидами. Это свойство расширяет круг их возможных хозяев. Описаны они: у рода Pseudomonas, поэтому и получили название Р-плазмид. Используя RP4-фактор, обнаруженный у P. aeruginosa S8 /Datta et al., 1971/, Диксон, Кэннон и Кондороши создали новую плазмиду RP41, вставив в него nif-гены к. pneumoniae /Dixon et al., 1976/.
Позднее плазмида была переименована в pRDi.
Плазмида pRDi имеет молекулярную массу 101 мД и контурную длину 49 мкм /Puhler et al., 1979; Puhler, Klipp, 1981/. Кроме маркеров RP4, она имеет гены gnd, rfb, his, nif, ShiA К. pneumoniae /MacNeil et al., 1979/. ДНК плазмиды pRDi стабильна в recA"* штаммах e. coii, в гесА+ штаммах она после 6 пассажей в неселективных условиях спонтанно деградирует с образованием двух типов плазмид: 39 мД (RP4) и 4 мД (предположительно, репликон PRD1) /Puhler et al., 1979/.
С плазмидой pRDi проведено наибольшее количество экспериментов по изучению структуры и функций nif-обдасти К. pneumoniae. Появление pRDi позволило применить диплоидный анализ, осуществляя комплементационный тест на аллелизм между плазмидой и хромосомными мутациями. Это дало новые возможности в тонком генетическом картировании nif-области /Dixon et al., 1977/. На ее основе получены производные, несущие мутации в nif-районе, которые использовались в генетических анализах nif-генов /Merrick et al., 1978; Elmerich et al., 1978; MacNeil et al., 1978; Puhler, Klipp, 1981/. Плазмида pRDi служила исходным материалом nif-генов в результате рестрикционного анализа /Aueubell et al., 1978; Cannon, 1978; Cannon et al., 1979; Riedel et al., 1979/. На основе вектора pMB9 была получена коллекция плазмид,несущих в различных сочетаниях ген hisD и nif-гены клебсиеллы из состава pRDi /Ausubell et al., 1979/. Это открыло возможности для получения большого количества nif-генов при изучении биохимии и генетики азотфиксации, а также получен исходный материал для дальнейшего конструирования генетических элементов, реплицирующихся и экспрессирующихся в клетках различных объектов. Кроме того, наборы nif-генов, локализованные на многочисленных плазми- дах, заложили основу для разработки метода физического картирования хромосомных nif -генов К. pneumoniae. Метод физического картирования, созданный для К. pneumoniae, успешно применяется для бактерий, не имеющих естественных способов переноса генетического материала.
Плазмида pRDi является основой для конструирования новых nif-плазмид. Получен укороченный ее вариант - pEAI, сохранивший все nif-гены, his, детерминанты устойчивости к антибиотикам и трансфертів гены родительской плазмиды, но утративший' гены gnu и rfb. Эта плазмида успешно использовалась для идентификации рестршщионных фрагментов хромосомы, несущих гены his и nif К. aerogenes /Appelbaum, 1980/. Интересной "модификацией" pRDi является плазмида pMF6, имеющая все ее детерминанты, кроме детерминант лекарственной устойчивости /Klingmuller, 1979/. На основе nif-ДНК рМ)1 и ДНК векторных плазмид pcRlO и pACYCi84 получены небольшие амплифищтрующиеся плазмиды рСМІ и. pSA30, несущие индивидуальные гены или группы генов nif /Cannon et ai«, 1979/. Эти плазмиды успешно; используются для генетического изучения nif-генов. Сконструированы две гибридные многокопийные nif-плазмиды рТОИ20 и. рЖ220 на основе плазмид p\VL625» pACYC184 и рЫ)1. Плазмида рЖ120 имеет контурную длину 17мкм и молекулярную массу 34 мД. В Б. coli насчитывается более 60 ее копий /Punier, Klipp, 1979/, каздая копия имеет 15 nif-генов, организованных в 7 оперонов. Таким образом, создана удобная для работы nif-плазмида рЖ120, имеющая такие преимущества перед рШ)1, как меньшая молекулярная масса и многокопийность. Однако остается непревзойденным такое свойство рЫ)1, как иммуность к суперинфекции.
Плазмида pRDi используется как удобная модель при изуче- ний экспрессии nif-генов в других, неродственных клебсиелле видах бактерий. Она перенесена В Agrobacterium tumefacicns И R. meliloti, где экспрессия nif-генов была обнаружена только имму-нологически /Dixon et al., 1976/. Шіазмида pRDi передавалась в nif" -мутанты A. vinelandii и восстанавливала nif+ -фенотип у штаммов, имеющих мутации структурных генов,и не комплементирова-ла плейотропные регуляторные мутации /Cannon, Dixon, 1976/. Пда-змида pRD1 не передавалась в Ps. aeruginosa /Dixon et al., 1976/. Гены К. pneumoniae перенесены на плазмиде рШ)1 впів~-мутанты Serratia marcescens, Erwinia herbicola и Proteus mira-bilis /Krishnapillai, Postgate, 1980/. Трансконъюганты Serratia и Erwinia экспрессировали nif-гены, va Proteus их имел, но не экспрессировал. Генетическая информация, заключенная в pRDi,передана почвенным энтеробактериям. У некоторых штаммов она экспрессировалась /Bucheitel, Klingmuller, 1979/, В ТОМ числе у Enterobacter cloaceae /Kloberger, Klingmuller, 1980/. Nif-гены в составе pRDi из Е. col і перенесены в грам-полояси-тельные бактерии Bacillus subtilis, а таїсже части плазмиды - в: Arthrobacter /Klingmuller, 1979/. В. ІОіингмюллером впервые была показана экспрессия nif-генов в грант-положительных организмах.
Осуществлен перенос плазмиды pRDi в различные штаммы А. brasilense /Polsinelli et al., 1980; Майсурян и др., 1982 а/ и A. lipoferum /Baidanzi et al., 1980/. Высказано предположение, ЧТО nif-гены К. pneumoniae могут ЭКСПрессироватьСЯ у A, brasilense /Майсурян и др., 1982 а/.
С низкой частотой перенесена плазмида pRDi в клетки бактерий Ps. fluorescens и Ps. pubida. Трансконъюганты Ps. fluoresces не имели, nif-генов, а производные Ps. putida, получившие nif-гены в составе pRDi, не имели условий для синтеза и фушщио- нирования нитрогеназы /Lechtinen, Mantsala, 1981/. Плазмида pRDi перенесена в ряд активных и неактивных штаммов Rhizobium, и получена экспрессия ее маркеров в іслетках трансконыогантов /Ни-чик, 1980; Ничик, Лжюва, 1983/. В лаборатории. А.А. Баева осуществлен перенос плазмиды pRDi в ауксотрофный по гистидину азот-фиксирующий штамм Rh. japonicum, и, таким образом, была продемонстрирована возможность выражения his -генов К. pneumoniae у медленнорастущих ризобий /Хмельницкий и др., 1981/.
На примерах различных в таксономическом отношении :бактерий, описанных выше, показано, что гены К. pneumoniae, ответственные. за азотфшссацию, активны в бактериях, не способных к усвоению атмосферного азота в естественных условиях (Е. coli, S. typhimuri- um, S. marc esc ens и. др. \ и комплементиругот nif-мутации у ряда природных азотфиксаторов. (К. pneumoniae, A. vinelandii). В большинстве случаев наблюдалась нестабильность nif+ -признака в клетках производных, и только в. отдельных видах происходила его стабилизация за счет встраивания генов азотфиксации в хромосому реципиента. У ряда бактерий (A, tumefaciens, Rh. meliloti, Ps, pu- tida, P. mirabiiie) nif-гены функционировали неполноценно, что выражалось в синтезе неактивной нитрогеназы или отсутствии ее синтеза. Установлено, что перенос nif-генов с помощью плазмиды pRDi затруднен в некоторые виды псевдомонад вследствие наличия в их клетках эндемных плазмид той же группы' несовместимости, что И pRD1.
Наряду с исследованием возможности экспрессии азотфиксирую-щих генов к. pneumoniae в разнообразных прокариотических организмах, проводилось изучение вырансения nif-генов таких естественных азотфиксаторов, как Rhizobium и Azotobacter в неспецифичес-ких объектах. Информация, представленная по этому вопросу в лите- ратуре, свидетельствует об активности генов азотфиксации этих бактерий в различных прокариотах /Dunican, ТШшеу,1974; Page, 1978; Stanley, Dunican, 1979; Троицкий, 1982/.
Таким образом, методами генной инженерии продемонстрирована возможность переноса nif-генов К* pneumoniae, Rhizobium, Aaotobacter в различные прокариотические объекты. Однако уже первые результаты показали, что не во всех случаях nif-гены полноценно функционируют. Имея сложную систему регуляции, они неактивны в тех видах бактерии, где отсутствуют либо неактивны некоторые регуляторные механизмы процесса усвоения молекулярного азота. Несмотря на определенные успехи, достигнутые в этой области, проблема межвидового переноса nif-генов остается еще не разработанной.
Таким образом, в настоящее время для К. pneumoniae разработаны методы генетического анализа как in vivo, так и in vitro почти в такой же степени, как и у е. соїі. В результате идентифицировано 19-20 nif-генов, определен их порядок и организация. Все известные гены, ответственные за синтез и экспрессию нитрогеназы, располагаются кластером между hisD и shiA на участке ДЖ 24 кв /Cannon et al., 1979/. С помощью генетического анализа идентифицировано 16-17 nif-генов и на основе пептидной карты еще 3 nif-гена: -BALF-M -NE-KDH-J -/Merrick, Elmerich, 1978/ QBALF-MVS--NE-KDH-J -/MacNeil et al., 1979/ QBALF-MVSU-HE-KDH-J -/Merrick et al., 1980/ QBALF-MVSU-NE-KDHCJ -/Runzhi et al., 1980/ (G)Q BALF-MVSUXHEYKDH-J Z/Puhler, Klipp, 1981/ Эти гены организованы в 7-8 транскрипционных единиц, 5-6 из которых, полицистронные. Все полицистронные. опероны транскри- бирутотся в том. же направлении, чта и гистидиновый оперон.
Исследование, бесклеточных экстрактов к. pneumoniae, а также идентификация nif -специфических полипептидов на SDS -полиак-риламидном геле и в миниклетках Е. соїі дало возможность определить функции большинства nif-генов /StJohn et al., 1975; Dixon et al., 1977» Roberts et al., 1978, 1980; Houmard, Bogusz, 1981; Punier, Klipp, 1981/. Структурные гены нитрогеназы -nifH, nifD и. nifK. NifH кодирует Ре-белок, nifD и nifK кодируют^ и j& субъединицы Mo-Fe-белка. Экспрессия одних этих генов недостаточна для биосинтеза активной нитрогеназы. Так і nifM участвует в "созревании" Fe-белка /Roberts et al., 1978/, nifV вовлечен, в процессинг Mo-Fe-белка /McLean, Dixon, 1981/. Предполагают, что продукты генов nifS и nifU также участвуют в процессинге компонента I нитрогеназы /Houmard, Bogusz, 1981/. Гены nifQ(G), nifB, nifN, nifE и nif с необходимы для синтеза И процесСИНГа FeMoCo /Roberts et al., 1978; Puhler, Klipp, 1981; Runzhi et al., 1980/. Два гена, nifF и nifJf участвуют в переносе электронов к нитрогеназе /StJohn et al., 1975; Roberts et al., 1978; Hill et al., 1981/. Другая роль nif J - поддержание активности Kpl /Runzhi et al., 1980/. Позитивным активатором nif -транскрипции, является nif A /Roberts et al., 1978; Houmard, Bogusz, 1981/. Ген nifb репрессирует nif-транскрипцию в присутствии кислорода /Hill, Kavanagh, 1980/.
Выполнена первая работа по расшифровке последовательности ДНК nif-генов К. pneumoniae*, в лаборатории Аусубелла. сиквени-рован ген nifH, контролирующий Fе-белок нитрогеназы /Sunderе-san, Ausubell, 1981/. В сочетании с продолжшощимся интенсивным генетріческим изучением nif-области к. pneumoniae подобные работы должны привести, к вычленению отдельных последовательностей, от которых зависит выражение nif -генов в неестественных условиях. Изменяя затем нужным, образом эти. последовательности:, предполагается добиться таких результатов, когда nif-гены начнут "работать" в дрожжах и растительных клетках:.
На модельном объекте К. pneumoniae создана генетика азот-фиксации. Разработанные для клебсиеллы методы генетического анализа in vivo и in vitro успешно применяются для бактерий, генетики которых до последнего времени не существовало. В последние годы достигнуты значительные успехи в создании генетики, быстрорастущих ризобии. Получены разнообразные мутанты с применением разработанных на модельном объекте к. pneumoniae таких методов, как использование транспозонов, бактериофага Ми и. других /Meade et al., 1982; Plazinski, 1982/. В лабораториях Д.' Беринджера и А. Джонстона впервые показано, что nif-гены и гены, ответственные за симбиоз у Rh. l eguminosurum расположены на плазмиде /Johnston et al., 1978/. Прямое доказательство тому, что nif локализуется на плазмидах, представлено рядом лаборатории работами по гибридизации клонированных структурных nif-генов нитрогеназы к. pneumoniae с плазмидами, изолированными из Rh. 1eguminosarum /Nuti et al., 1979/; Rh. trifolii /Ruvkun et al., 1980/; Rh. meliloti /Banfalvi et al., 1981; Rosenberg, et al,, 1981; Corbin et al., 1982/. Получены доказательства в пользу того, что nif-гены и гены, ответственные за симбиоз, тесно сцеплены; /Banfalvi et al., 1981; Rosenberg et al., 1981/. Клонированы структурные гены нитрогеназы nif ДН у Rh. meliloti /Ruvkun et al., 1980/. Показано, что yRh. meliloti nif БДК транскрибируется таким же образом, как и у К. pneumoniae /Ruvkun et al., 1982/. Достигнуты определенные успехи в создании частной генетики медленнорастущих ризобии. Так, получены ауксотрофные мутанты Rh. japonicum. Построена генетическая карта хромосомы этого віща ризобий /Хмельницкий и др., 1981/, клонированы структурные гены нитрогеназы /Hennecke, 1981/.
Достигнуты успехи в разработке генетики. A. vineiandii, тлеющего уникальную систему азотфпксации. Азотобактер фиксирует азот в аэробных условиях и имеет механизмы защиты нитрогеназы от кислорода. П. Еишоп с соавт./Bishop et al., 1982/ сообщили о существовании у A, vineiandii новой ферментной системы для фиксации азота. Эта система, состоящая из 4-х ранее неизвестных белков, шщуцируется у A. vineiandii на безазотных средах, в которых вместо молибдена содершітся вольфрам. На таких средах nif"-мутанты растут и фиксируют азот несмотря на дефицит известного нитрогеназного комплекса. Показано, что плазмиды PI группы несовместимости, реплицируются и проявляют в клетках A. vineiandii признаки антибштикоустойчивости. Плазмиды RP4 и R68.45 показывают высокий уровень коныогационного перехода и могут при этом мобилизовать перенос nif -генов /Torroiего et al., 1983/. Установлено, что у A. vineiandii гены, кодирующие субъединицы двух компонентов нитрогеназы, образуют единый опе-рон, как и у К. pneumoniae /Krol et al., 1982/. В настоящее время расшифрована последовательность аминокислот в молекуле железосодержащего белка нитрогеназы A. vineiandii /Hausinger, Howard, 1982/. Сравнение первичной и вторичной структуры Fe-белка нитрогеназы с таковыми из других диазотрофов (К. pneumoniae, С. pasteurianum/ показало высокую степень их сходства.
Заметные успехи достигнуты в изучении генетики азоспирилл. Налажен мутагенез; азоспирилл и выделены различные ауксотрофные и антибиотикоустойчивые мутанты /Майсурян и др., 1982 б/. С по- мощью плазмиды RP4 осуществлена мобилизация переноса детерминантов лекарственной УСТОЙЧИВОСТИ, у A. lipoferum /Mishra, Roy, 1979/. Найдено, что клетки азоспирилл содержат 1-5 плазмид с молекулярной массой от 3,5 до 300 тыс. мД. У бактерий A. brasi-lense, выделенных из почв Финляндии, nif -гены расположены на плазмиде /Vaisanen et ai., 1982/. Сообщено о клонировании струк-турных генов нитрогеназы nif ДКУ A. brasilense /Quiviger et al., 1982/.
Созрели условия для молекулярногенетических исследований азотфиксирующих актиномицетов - симбионтов древесных растений. Подобраны условия для выделения и культивирования актиномицетов в чистых культурах с возможностью последующего эффективного заражения ими растений /Burggraaf et ai,, 1981/. Проведено серо-типирование различных изолятов; найдено, что представители одного и того же серотипа имеют и общий круг хозяев /Baker et al., 1981/. Из корневых клубеньков ольхи изолированы кольцевые молекулы ДНК различной молекулярной массы: от 0,8 до 38 тыс. мД /Добрила, 1982/.
У единственного представителя несерных фотосинтезирующих бактерий Rhodopseudomonas capsuiata обнаружен очень своеобразный, специфичный для этого вида механизм переноса генетического материала, напоминающий не специфическую трансдукцию /Yen Ни, Marrs, 1979/. Вектор» осуществляющий' перенос генетической информации- GTA (gene transfer agent) - морфологически представляет собой бактериофагоподобную структуру, но в отличие от фагов несет крайне мало, фагоспецифической ДНК и не лизирует бактериальные клетки. ' gta способен переносить любые районы хромосомы R. capsuiata с довольно высокой частотой - I %. При помощи. GTA осуществлен^ перенос nif -генов между разными штаммами R. capsu- lata,и созданы первые представления о структуре его nif-района. /Ruvkun et al., 1980/.
Внутри вида R. sphaeroides ведется разработка способов ко-нъюгационного переноса генетического материала на основе плаз-мид, имеющих вставки Ми и. транспозона /Каменева, їїоливцева, 1982/.
У синезеленых при разработке методов переноса генетической информации используются, в основном, методы генетической инженерии in vitro. У подавляющего большинства синезеленых обнаружены критические плазмиды, которые могут быть использованы для переноса генов лишь после их маркировки /Van den Honden et al., 1979/. Для изучения nif-области Anabaena используют рекомби-нантные ДНК, несущие участки nif-кластера к. pneumoniae. Методом физического картирования обнаружена локализация структурных генов нитрогеназы штамма 7А 120 Anabaena /Masur et al., 1980/. В настоящее время известна последовательность нуклеотидов гена nifH цианобактерии /Mevarech et al., 1980/.
Таким образом, на основе методов генетического анализа, разработанных для к. pneumoniae, создается частная генетика основных групп диазотрофов, без знания которой' невозможно манипулирование генами азотфиксации и расшифровка регуляторних механизмов-их экспрессии.
1.2.3. Генетический' контроль азотфиксации
Эксперименты, проведенные по изучению физиологии азотфиксации, указывают на наличие, нескольких уровней регуляции системы азотфиксации, а именно: 1) аммонийного; 2) пі^специфического; з) аминокислотного; 4-) кислородного; 5) нитратного; 6) молибденового; 7) температурного.
Синтез нитрогеназы (Вт) у к. pneumoniae репрессируется ам- - зо - монием /Tubb, Postgate, 1973/; такой же эффект наблюдается и у ' организмов, в которые перенесены nif-гены (Е. coli, s. typhy-murium, A. vinelandii) /Dixon et al., 1976; Сагшоп et al., 1976; Cannon, Postgate, 1976/. Слияние lac-оперона с каждым из известных nif-промоторов показало, что все единицы nif-транскрипции репрессируются аммонием /Dixon et al., 1980/.
В ассимиляции аммония у к. pneumoniae при концентрации его ниже I мМ существенную роль выполняет фермент глютаминсин-тетаза (ГС) /Hatagani et al., 1971/. В этих условиях:при совместном действии ГС и глютаматсинтетазы (ГГС) образуется глюта- + ГС глютамат + АТФ + N Н^ . глютимин + АДФ + Фн; глютамин -ь 2 -кетоглютарат + НАДФ + В* —±±9^. 2 глютамат + НАДФ+
В свое время была постулирована /Streicher et al., 1974; Tubb, 1974/ роль ГС в регуляции экспрессии nif-кластера на основе двух очевидных фактов: I - мутанты к. pneuminiae, утратившие ГС-активность (ginA~), не имеют Нг; 2 - мутанты, способные синтезировать ГС в присутствии HHt , могут редуцировать ацетилен в этих: условиях: /Tubb, 1974; Streicher et al., 1974/.
Однако генетические исследования Е. coli и S. typhimurium привели к открытию регуляторних: генов glnG у Е. coli /Panel, Tyler, 1979/ И glnR у S. typhimurium /Kustu et al., 1979/, близкорасположенных: к glnA - структурному гену ГС. Позже подобный регуляторный ген (glnG) был обнаружен у К. pneumoniae /Ев-pin et al., 1981; 1982/. Он состоит из двух локусов: ntrB и ntr с /Merrick, 1982/. Исследования последних лет показали, что продукт гена ntrC необходим для активации регуляторних: генов оперона nifLA /Espin et al., 1982/.
В свою очередь, продукт гена nifA позитивно контролирует - ЗІ - транскрипцию всех nif -генов, но не нужен для выражения собственного оперона nifLA. Эти данные указывают на то, что регуляция синтеза Вт фиксированным азотом, происходящая при. участии ГС, возможна лишь в nifLA оперона, а единственным положительным активатором nif -генов является nif а.
Определена последовательность регуляторной области. nifLA, локализован его промотор. Последовательность промотора nifLA нетипична для прокариот1, отсутствует последовательность Гилберта, характерная для промоторов, регулируемых позитивными факторами. В области -225-262 обнаружен палиндром, состоящий почти исключительно из ГЦ пар нуклеотидов. Предполагают, что палиндром играет существенную роль В регуляции nif-Генов /Drummond et al.,1983/.
Кроме генов оперона nifLA, nif-специфический контроль биосинтеза Бг осуществляют гены nifK и nifD, продукты которых участвуют в регуляции оперона nifHKDY, кодирующего КрІ и Кр2 /Dixon et al., 1980/, и, таким образом, выполняют роль, ауторегу-ляции синтеза этих компонентов. Для выражения генов nifK(D) и nifH необходим продукт гена nif J /Runzhi et al., 1980/.
Определенные аминокислоты, особенно глютамин в комбинации с аспартатом или глютаматом, способны репрессировать синтез; нит-рогеназы у дерепрессированньсг по Hi? мутантов к. pneumoniae /Sha-nmugam, Morandi, 1976/. Как утверждают Шанмугэм и Моранди, репрессия Бг аммонием происходит через производные аминокислот, и негативная регуляторная функция ГС заключается в обеспечении этих; продуктов. Исследуя пул аминокислот К. pneumoniae в стадиях, репрессии и дерепрессии, Клейнер показал, что существует корреляция между внутриклеточной концентрацией глютамина и нитроге-назной активностью. В противоположность этому, пул глютамата оставался стабильным в течение репрессии - дерепрессии. Такое сравнение привело автора к предположению, что глютамин может быть, корепрессором nif-системн/КІеіпег, 1979/.
Альтернативной моделью репрессии, опосредованной аминокислотой глютамином, является наличие контроля по типу аттенюатора, как например, в регуляции his, phe, leu, thr и trp-оперонов E. coli /Keller, Calvo, 1979; Kleiner, 1979/. Такой механизм не требует механического репрессора, а модулирует транскрипцию олерона соответственно уровню определенных шжноацил-тРНК-синте-таз.
Существенную роль в контроле биосинтеза Нг играет кислород. Процесс азотфиксации осуществляется только в анаэробных условиях или при очень низком парциальном давлении кислорода /Hamilton, Wilson, 1955/f так как оба компонента Нг чувствительны к кислороду /Eady et ai., 1972/, который их инактивирует, а также предотвращает; синтез обоих компонентов Нг /StJohn et ai., 1974/. Несмотря на это, Нг имеется у многих аэробных организмов. Этим организмам кослород необходим для синтеза АТФ, которая, кроме всего прочего, нужна, и для функционирования Нг. Этот парадокс разрешается организмами различными путями. /Smith, 1977/ : в бактероидах функцию защиты от кислорода выполняет леггемоглобин; у A. vinelandii- FS -П-белок, который комплексует Нг, приводя ее в состояние "Swich off" при. высокой концентрации, кислорода; у синезеленых водорослей - гетероцисты; у A. chroococcum, К. pneumoniae — образование слизистого защитного слоя; у других микроорганизмов - высокая респираторная активность, снижающая парциальное давление кислорода.
О регуляторной. роли кислорода в. биосинтезе: Нг впервые высказались Сент-Джон. и соавт./StJohn et ai., 1974/. В аэробных условиях потребляется только связанный азот и, таким образом, со- храняется энергия, которая затратилась бы клетками на синтез неактивной Нг. Исследуя этот вопрос на молекулярном уровне, Хилл с сотр. /Hill et el., 1981/ установили, что в регуляции nif-генов кислородом участвует ген піїь, продукт которого выступает как негативный эффектор.
Добавление в среду но! или Ж>~ в 'качестве акцепторов электронов также репрессирует у к. pneumoniae продукцию Нг. Регуляция биосинтеза Нг нитратом или нитритом у клебсиеллы происходит в результате воздействия его на окислительно-восстановительный потенциал клетки /Нот et а!., 1980/.
Бриллом с соавт. /Brill et al., 1974/ установлено, что молибден способен индуцировать синтез Нг у к. pneumoniae. Дальнейшие исследования показали, что он необходим для максимальной транскрипции с промотора гена nilH /Dixon et al., 1980/.
Температура <37 С не повреждает Нг, однако при такой температуре клетки К. pneumoniae не способны к росту на молекулярном азоте /Hennecke, Shanmugam, 1979; Zhu, Brill, 1981/. Мутанты, дерепрессированные по синтезу Бг в присутствии аммония, характеризуются отсутствием температурочувствительности по синтезу Нг. Таким образом, было установлено, что при непермиссивной температуре не функционирует продукт гена-регулятора nifA /Mac-Neil et al., 1981/.
1.3. Основные пути решения проблемы обеспечения растений биологическим азотом
Изучение генетики процесса биологической азотфиксации на модельном объекте к. pneumoniae повлекло за собой разработку частной генетики азотфиксиругащих организмов, а также детальное исследование генетического контроля и биохимии азотфиксации. Это создало реальную основу для применения генетической инженерии в решении проблемы обеспечения растений биологически связанным азотом. К настоящему времени сформулированы общие задачи с целью создания новых азотфиксирующих систем и организмов и улучшения уже существующих /Valentine, 1977; Кордюм, 1982/.
I) Азотфиксирующие агенты должны быть более конкурентоспособными по сравнению с дикими формами;
2 ) обладать широким спектром специфичности, что позволит установлению ассоциаций с разнообразными растениями;
3) более эффективно усваивать азот атмосферы при минимуме энергетических источников; ) реутилизировать водород, выделяющийся при функционировании Нг; ) иметь- защиту Нг от кислорода )и измененную систему регуляции nif -генов, обеспечивающую их работу в условиях избытка связанного азота; ) стабильно сохранять приобретенные полезьте свойства; )быть удобными, при эксплуатации в агрономической практике.
Конструирование подобных азотфиксаторов - дело будущего; в настоящее время разрабатываются подходы к осуществлению намеченных задач. Общепризнанным является мнение, что наиболее перспективной системой в плане получения биологически связанного азота на сельскохозяйственных угодьях следует считать симбиоз ризобии -бобовые /Hardy, Havelka, 1975; Evans, Burber, 1977; Кордюм, 1982/. Во-первых, это уникально созданная природой система, и поэтому процесс азотфиксапии является нормой в жизненном цикле как бактерий, так и растений. Во-вторых, в этой системе процесс азот-фиксации обеспечішается" энергией фотосинтеза. Вашшм является тот факт., что она веками эксплуатируется в сельском хозяйстве и значительно улучшена по сравнению с другими, симбиотическими систе- мами. Всестороннее ее изучение позволит1 в; обозримом будущем создать: "суперризобии" (повышение инфекпионности и устойчивости ризобий, к стрессовым воздействиям окружающей среды, перенесение в них hup-генов и т.д.) , что сделает более эффективным азотфик-сирующий симбиоз ризобий- не только с бобовыми, но и с друтигж. агрономически ценными растениями, в том числе со з лаками/ Andersen et ai., 1981/. Не исключается и другой путь создания высокопродуктивного: симбиоза со злаками - на основе неризобиальных культур. Перспективным претендентом на это является Azospirii-lum. Работами Доберейнер показано, что азоспириллы обнаруштаю-тся в тканях корней пшеницы и других ценных злаков и фиксируют значительное количество азота /Dobereiner et al., 1976/.
Одним из аспектов при создании азотфиксирующего симбиоза ризобий с небобовыми растениями будет и экспериментирование с последовательностью ДЖ ті-плазмидьг A. tumefaciens, ответственной за оііухолевидше перерождения клеток двудольных растений. Эту последовательность предположительно будут застраивать в ДНК плазмид ризобий /Баев, Зяотников, 1982/.
Что касается азотобактера и других свободноживутцих гетеро-трофов, то они представляются менее удачными объектами в перспективе использования их в сельскохозяйственном' производстве, так как для фиксации азота они требуют огромного количества энергии. Однако придание свободноштущигл азотфиксаторам способности, проникать и существовать в тканях сельскохозяйственных культур дало бы возможность получать эффективный симбиоз' на основе не-симбиотических азотфиксаторов /Кордюм, 1982/.
Успешно- начаты работы по преобразованию почвенной микрофлоры с целью придания им способности фиксировать азот. Детерминанты генетической информации клебсиеллы, обусловливающие спо- собность усваивать азот, переданы почвенным энтеробактериям и экспрессируются в них. /Kiingmiiller, 1979/. Однако в естественных условиях в почве преобладают не энтеробактерии, а бактерии родов Arthrobacter, Bacillus и. др. Различия клеточных стенок грам-положительных и грам-отрицательных бактерий препятствуют передаче плазмид между ними. Эта трудность преодолена методически: nif -гены клебсиеллы введены в протопласты грам-поло-жительных бактерий путем трансформации ДЕК /Bucheitel et al., 1979/.
Не вызывает, сомнения перспективность' использования симбиоза синезеленых водорослей с азоллой /Evans, Barber, 1977/. Фототрофы сами обеспечивают себя энергией и поэтому иг вклад в тропических: и субтропических странах: в общий баланс связанного азота достаточно велик.
В последние годы уделяется все больше внимания изучению симбиотической азотфиксации у небобовых растений. Являясь, в основном, древесными и кустарниковыми растениями, они играют важную роль в природных экосистемах, произрастая на бедных азотом почвах. По азотфиксирующей способности небобовые растения не уступают бобовым. Эндофитом - симбионтом у большинства таких растений являются актиномицеты сем. Frankiaceae. Использование э.тих микроорганизмов пока проблематично в интенсивном лесо-хозяйственном производстве, однако как объект изучения они представляют несомненный интерес /Evans, Barber, 1977; Кор-дюм, 1982/.
1.4. Бактетаи. -развивающиеся в растениях:, как потенциальные, азотфиксатош
Кроме перечисленных выше путей поиска решения проблемы обеспечения растений биологически связанным азотом,перспективным является путь придания азотфиксирующей активности бактериям, развивающимся в растениях /Еордюм и'др., 1980; Кордам, 1982/. Среди бактерий, заселяющих растения, встречаются как эпифиты, обитающие на их поверхности, так и эндофиты, выделяющиеся из неповрежденных тканей. К him относятся комменсалы растений, а также фитопатогенные бактерии, развивающиеся в растении с различной интенсивностью.
В природе существуют азотфиксирующие фитопатогены - это эр-ВИНИИ И агробактерии /Taboada, Herrera, 1972; Papen, Werner, 1979; Neilson, 1979/. Гетеротрофное питание не мешает им иметь nif-гены;- экспериментально показано, что количество связанного азота, выделяемого бактериями, достаточно не только для их собственного питания, но и для снабжения других организмов /Рареп, Werner, 1979/.
У фитопатогенных бактерий эволюционно отработан: механизм проникновения в растение, размножения в нем, что обеспечивает высокую степень контакта с растительной клеткой. При развитии в растении они накапливают значительную биомассу, в отличие от эпифитных и ризосферных бактерий. Одни и те же виды фитопато-генов имеют широкий спектр агрессивности по отношению к растению-хозяину, что позволило бы отбирать нужные формы, а изменение степени агрессивности экспериментальным путем не представляет трудности. Заражение растений слабовирулентныгли nlf "''-штаммами обеспечивало бы иммунизацию' его к повторной инфекции.
Выбор фитопатогенов в качестве объектов nif-переноса не случаен еще и потому, что некоторые из них тлеют эволюционное родство с классическими азотфиксаторами - клубеньковыми бактериями /Abdel-Rehim et al., 1975/.
Фитопатогенные бактерии - благоприятный материал для генетической инженерии. Для многих таксономических групп описаны или разработаны основные способы переноса генетической информации /Perombelon, Boucher, 1978; Boistard, Boucher, 1978/. Описаны плазмиды и изучены их. свойства у представителей наиболее распространенных родов Agrоbacterium /Zaenen et al., 1974; Watson et al., 1975/» Erwinia /Chatterijee, Starr, 1972; Coplin, Rowan, 1978; Panopolous et al., 1978; Lacy, Sparks, 1979; Schukin, Avdienko, 1980; Неборачко И др., 1982/ и Pseudomonas /Hollo-way, 1979/. Успешно картируются детерминанты патогенности у различных видов фитопатогенных: бактерий с помощью плазмид, мобилизующих перенос хромосомных маркеров / Chatterijee, Starr, 1977/. Широко используется для этой цели: бактериофаг Ми и транспозонная техника /Boistard, Boucher, 1978/. Гены, ответственные за вирулентность, обнаружены на плазмидах у A. tume-faciene /Watson et al., 1975/И Ps. syringae /Gonzales, Videler, 1977/. Изучается роль плазмид e. chrysanthemi в патологии растений /Sparks, Lacy, 1979/.
Таким образом, в настоящее время манипулирование генетическим материалом фитопатогенных: бактерий не представляет серьезных трудностей. А разработка генетических методов анализа для К. pneumoniae является: объективной основой для создания азотфикси-рующих. организмов/ развивающихся в растениях.
К настоящему моменту известно свыше 300 видов бактерий, развивающихся с различной интенсивностью в растениях. /Израильский, 1979/. Для nif -переноса перспективными объектами являются опу-холеобразующие бактерии. Их можно условно разделить на две группы - образующие опухоли ПО типу I (Agrobacterium) И 2 (Khizo-bium). Первые индуцируют опухоль (корончатый галл) за счет внедрения в геном растения Т-ДНК Ті-плазмида /Chilton et al., 1977/. После акта трансформации клетки агробактерий уже не нужны для поддержания опухолевого роста и могут частично или полностью исчезать из разрастающейся ткани. Для того, чтобы в таком варианте фиксировался азот, nif-гены должны быть перенесены на т± -плазмиду. Кроме того, необходимо допустить, что nif-гены будут экспрессироваться. При втором типе опухолеобразования присутствие, бактерий, является обязательным для разрастания тканей, а сами бактерии обильно растут либо внутри клеток растений, либо,' в межклеточных пространствах. Среди, таких: агентов известны бактерии X. beticola, вызывающие наросты на корнеплодах: столовой, сахарной и кормовой свеклы. Эти бактерии, а также бактерии, вызывающие мокрую гниль у растений (е. aroideae) служили в данной работе модельными объектами для изучения nif-переноса и экспрессии nif-генов в составе плазмиды pRDi.
Таким образом, нет видимых теоретических препятствий на пути разработки нового направления в азотфиксации. Для его теоретического обоснования необходимо ответить на следующие вопросы: будет ли осуществляться nif-перенос в фитопатогенные бактерии или в процессе переноса nif-кластер полностью или частично подвергнется деградации? будет ли иметь место экспрессия nif-генов, ответственных за азотфиксацию, если nif-перенос произойдет? будет ли иметь место устойчивость nif-фенотипа при его экспрессии! или выражение генов азотфиксации окажется неустойчивым, а сам nif-кластер- быстро элиминирует? сохранится ли способность реципиентов развиваться в растении в случае устойчивости: nif -фенотипа? будет ли. происходить полноценное функционирование генов азотфиксации при развитии бактерий не на специальных средах, а в растениях, если даже сохраіштся способность: развиваться в тканях хозяїша?
Краткая характеристика основных групп диазотрофов
Значительное большинство прокариотических диазотрофов образуют взаимополезные физиологические ассоциаций с другими организмами, в том числе с высшими эукариотами. Наиболее давно известен симбиоз бактерий рода Rhizobium с бобовыми растениями. Фиксация азота происходит в высокоорганизованных (генетически и биохимически) корневых клубеньках, формирующихся при взаимодействии бактерий с растениями. Ризобий снабжают растения продуктами азот-фиксации, в то время как роль растения заключается в том, чтобы поставлять окисляемые субстраты (энергию) для процесса азотфик-сации /Bergersen, 1967/.
Известны небобовые растения, на которых могут образовывать клубеньки и фиксировать азот ризобий. Это растения Parasponia и Tribuius. Сами эти растения имеют также азотфиксирующие клубеньки с собственными бактериями-симбионтами, которые напоминают медленнорастущих ризобий. Симбионты клубеньков Tribuius могут эффективно заражать такие типичные бобовые растения, как вигна /Trinick, 1976, 1979/.
Высокоорганизованным азотфиксирующим симбиозом является симбиоз актиномицетов (сем. Frankiaceae) с небобовыми покрытосеменными растениями /Becking et ai., 1964/.По разнообразию видов растений, способных образовывать на корнях азотфиксирующие клубеньки, этот симбиоз занимает ведущее место. Являясь, в основном, древесными и кустарниковыми растениями,они играют важную роль в природных экосистемах,произрастая на почвах,бедных азотом, и обогащая их биологически связанным азотом.В настоящее время симбиоз актиномицеты - небобовые растения не имеет такого практического значения, как бобово-ризобиальный, однако в будущем оно может оказаться немалым. Растения, на корнях которых образуются клубеньки при инфекции актиномицетами, могут быть полезными при рекультивации земель (Alnus glutinosa, A. rubra, Dryas sp. ), получении древесины (Causarina), борьбе с эрозией ПОЧВ (НІррО-phae, Purshia) /Калакуцкий, Парийская, 1982/.
В последние годы обнаружено, что азотфиксируїощие бактерии образуют и менее специализированные ассоциации с корнями растений. Они не формируют клубеньки, а размножаются на поверхности корней или в межклеточниках /Dobereiner et ai., 1976/. Такие ассоциации названы ризосферними и существуют по такому же принципу, как и клубеньковые: бактерии используют корневые выделения растений или углеводы их внутренних тканей корня, а растение - связанные формы азота, поставляемые бактериями-азотфиксаторами. Ассоциации такого типа обнаружены у кукурузы, риса, пшеницы и других ценных сельскохозяйственных культур. Согласно данным лаборатории Доберейнер, устойчивые ассоциации- образуют бактерии видов Azo-spiriiium lipoferum и A. brasilense, причем наблюдается определенная форма хозяйской специфичности. Так, A. lipoferum предпочтительно заражают растения С -группы (кукуруза, тропические травы) , a A. brasilense - растения Cg-группы (рожь, пшеница, овес, ячмень) /Dobereiner, Boddley, 1981/. Азоспириллы способны фиксировать азот как в свободоживущем состоянии, так и в ассоциации с растением.
Номенклатура
Символы генов, использованные в работе, даны в соответствии с последним изданием карты Е. соїі /Bachmann, bow, 1980/. 2.2. Виды и штаммы бактерий
Список, использованных в работе бактерий представлен в таблице 2.
Плазмида рЩ 1 сконструирована Диксоном, Кэнноном и Кондо-роши /Dixon et al., 1976/. Она имеет nif-гены К. pneumoniae и детерминанты устойчивости, к тетрациклину, канамицину и карбе-нициллину Рв.aeruginosa. Плазмида была введена в pro", trp" Е. coli K-12J62-1. В качестве рещшиентов. плазмиды pRDi подбирали фитопатогенные бактерии по следующим принципам:
1) неазотфиксирующие;
2) чувствительные к антибиотикам, детерминируемым плазми-ДОЙ pRD1;
3) грам-отрицательные бактерии (pRDi имеет широкий крут: хозяев среди, этих бактерий" );
4) бактерии, растущие на минимальной среде, используемой для контрселекции Е. coli;
5) бесплазмидные, не создающие трудности при анализе конъю-гантов;
6) с легко и быстро детектируемой в лабораторных условиях патогенностью;
7) накапливающие большую биомассу в тканях растений .
Такими реципиентами, избраны X. beticola 7325 и 8717 и Е. aroideae 8634, 8947. X. beticola - грам-отрицательные, факультативно-аэробные, с перитрихально расположенными жгутиками палочки размерами 0,2-0,8 Jim х 0,6-2,0JUM. Образуют окрашенные колонии на агаризован-ной питательной среде благодаря наличию нерастворимого желтого пигмента. На среде с сахарозой продуцируют обильную слизь. На среде с лакмусовой сывороткой образуют щелочь, разжижают желатин, образуют сероводород, ферментируют глюкозу, галактозу, ксилозу, маннозу, фруктозу, мальтозу, сахарозу, целлобиозу, маннит, глицерин, не ферментируют дульцит и сорбит.
Оптимальная температура роста бактерий - +25- +28 0.
Систематическое положение этого возбудителя заболевания растений еще точно не установлено. По данным ряда авторов /Гала-чьян, 1979; Сидоренко и др., 1978/,он отличается от ксантомонад по ряду признаков. Так,Х. beticoia восстанавливают нитраты, свертывают молоко без дальнейшей пептонизации, ферментируют рамнозу и инозит, арпшин и аспарагішовуїо кислоту. Это указывает на их сходство с представителями других родов фитопатогенных бактерий.
Б 8-м издании определителя Берджи /Dye, Lelliott, 1974/ количество видов Xanthomonas сокращено до пяти: X. campestris, X. ampelina, X, fraguriae, X. albilineans, X. axopodis.
E. aroideae — перитрихалъные подвижные неспоррносные папочки размером 0,5 х 2,0 - 3,0 JUM, иногда соединенные в цепочки. Колонии на агаризованных питательных средах - круглые, блестящие, белые, слегка опалесциругощие. Желатин разжижают, молоко створаживают и пептонйзируют. Лакмусовое молоко окрашивают в красный цвет, нитраты редуцируїот, индол не образуют. На декстрозе, лактозе, галактозе, сахарозе, глицерине и манните образуют кислоты, но без газа. Сероводород выделяют в малом количестве. Оптимальная температура роста бактерий - +28 С.
class3 ПЕРЕНОС ПЛАЗМИДЫ pRD1 ИЗ Е. coli В ФИТОПАТОГЕННЬЕЕ
БАКТЕРИИ И ЭКСПРЕССИЯ ЕЕ ДЕТЕРМИНАНТОВ class3
Эффективность конъюгационного переноса плазмиды pRDi при скрещивании Е. coli с фитопатогенными бактериями
Скрещивание партнеров Е. coli K-12J62-1 и Е. aroideae 8634 и 8947 проводили в жидкой среде, ориентируясьна описанный Левиным с соавт. метод /Levin et al., 1976/. Результаты конъюгации, представленные в таблице 3, указывают на то, что плазмида pRDi передавалась в клетки фитопатогенных энтеробактерий Е. aroideae 8634 и 8947 с высокой частотой - 0,1-0,25 коныогантов на клетку донора.
Проведение конъюгации между Е. coli (pRDi) и X. beticola 8717 в жидкой среде выявило низкую частоту переноса плазмиды в клетки ксантомонаса (10 ), неэффективную для проведения анализа трансконъюгантов, поэтому были предприняты меры по повышению частоты конъюгационного переноса pRDi в клетки х. beticola.
Скрещивания указанных бактерий проводили в дальнейшем на плотной питательной среде, поскольку по имеющимся данным, эффективность переноса при этом методе значительно выше, чем при скрещивании В ЖИДКОЙ среде /Dennison, Baumberg, 1975; Haas, Holloway, 1976; Cannon et al., 1976/.
Чтобы получить условия, оптимальные для переноса,постановку скрещиваний осуществляли в различных вариантах, с учетом таких факторов, как длительность инкубирования донорных и реципиентных бактерий перед скрещиванием, способа высева конъюгационной смеси, на питательную среду для предварительного подращивания, состав питательной среды.
Согласно полученным данным, максимальная эффективность скрещивания наблюдалась в том случае, когда клетки донора выращивали до плотности 10 , а реципиента - до Кг кл/мл в полноценной для каждого штамма среде и смешивали в соотношении 1:2.
В соответствии с имеющимися в литературе данными, в опытах по скрещиванию бактерий, принадлежащих к различным родам, смесь донорных и реципиентных клеток высевают для предварительного инкубирования (3, 6, 24, 48 ч ) на индифферентную среду, на которой ни донорные, ни реципиентные бактерии не растут /Deimison, Baum-berg, 1975; Sistrom, 1977/ или на питательные среды, обеспечивающие рост обоих родительских штаммов, либо одного из них - чаще всего регршиентного. При этом посев осуществляют различными, способами: обычным растиранием суспензии бактерии по поверхности агара, путем высева ее на агар методом пятен /sistrom, 1977/ или нанесением на миллипоровые фильтры, помещенные в чашей со средой /Chatterioee, Starr, 1977/.
Вирулентность и агрессивность трансконъюгантов
Вирулентность - это качественная мера патогенности; ее рассматривают как "патогенность данного паразита по отношению к определенному виду или. сорту растения-хозяина" /пит. по Попковой, 1979/. Агрессивность определяют как количественную меру вирулентности, зависящую от способности вызывать заражение минимальным количеством инокулюма, от скорости распространения паразита в зараженной ткани, от длины инкубационного периода болезни и других факторов х. beticoia является узкоспециализированным возбудителем заболевания столовой, кормовой и сахарной свеклы. Одним из факторов его патогенности являются неполитические ферменты, некро-тизирующие ткань корнеплода и свеклы /Израильский, 1979/. X. beticoia - раневой паразит: бактерии инфецируют свеклу только через поврежденные места. Тип заболевания (туберкулез) по внешним признакам похож на корончатый галл, но принципиально отличается от него: заболевание прогрессирует только в присутствии бактерий. Анатомическое различие между корончатым галлом и опухолью, вызываемой ксантомонасом, состоит в том, что при корневом раке внутренняя ткань опухоли твердая, а при туберкулезе - рыхлая, внутри ее имеются так называемые каверны, заполненные слизью и бактериями-возбудителями.
Патогенность трансконьюгантов х. beticoia 8717 и исходной культуры определяли экспресс-методом на дисках корнеплодов столовой свеклы в лабораторных условиях. В осенне-зимний период инфекция проявлялась на дисках свеклы через 7 суток после заражения их культурой х. beticoia 8717. В этот период года исходные nif -конъюганты, а также клоны, утратившие nif -фенотип, вызывали поражение свеклы на 4-е сутки (табл. II). Зараженная ткань имела бархатистый вид, искрилась по сравнению с тусклой, темной контрольной тканью, обработанной стерильной водой. Дугорки на дисках свеклы появляются в месте заражения; со временем их количество увеличивается, образуются наросты, на которых моїут появляться капли эксудата. Наросты, образуемые трансконъюгантами, имели большие размеры, чем таковые, образуемые родительским штаммом (рис. II).
Стабильные по nif-признаку клоны трансконьюгантов X.beticoia 8717 не поражали ткань свеклы, что свидетельствует об отсутствии у них вирулентных свойств.
Таким образом, клоны X. beticoia 8717 (pRDi), исходно не имевшие nif, и клоны, утратившие nif, сохранили вирулентность, причем агрессивность их заметно усилилась по сравнению с исходным штаммом; стабильные nif+ -линии X. beticoia 8717 (pRDi) не обладали вирулентными свойствами.
