Содержание к диссертации
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ 4
ВВЕДЕНИЕ 5
ГЛАВА 1. ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 7
1.1. Щелочная фосфатаза микроорганизмов и высших организмов 7
Распространение и локализация 7
Структура щелочной фосфатазы 8
Механизм ферментативного действия 11
Свойства щелочной фосфатазы 14
Механизм регуляции экспрессии (на примере Е. coli) 18
1.2. Ферменты термофильных микроорганизмов 20
Термофильные микроорганизмы 20
Физико-химические особенности ферментов термофильных 23 микроорганизмов
Термостабильные щелочные фосфатазы 29
1.3. Практическое применение щелочных фосфатаз 33
Использование щелочных фосфатаз для получения 33 ферментативных конъюгатов в методе ELISA
Применение щелочных фосфатаз в генной инженерии, 34 молекулярной биологии и диагностике
Использование щелочных фосфатаз в качестве репортерного 37 гена
ГЛАВА 2. МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 40
Культивирование штаммов микроорганизмов 40
Клонирование фрагмента гена щелочной фосфатазы М. ruber 40
Клонирование полноразмерного гена щелочной фосфатазы М. 41 ruber
Конструирование плазмид для экспрессии гена щелочной 42 фосфатазы М. ruber в клетках Е. coli
Выделение и очистка рекомбинантных щелочных фосфатаз М. 45 ruber
Определение активности щелочной фосфатазы М. ruber 48
Определение оптимума рН и температуры и термостабильности 48 щелочной фосфатазы М. ruber
Изучение влияния ионов металлов и химических агентов на 48 активность щелочной фосфатазы М. ruber
Определение субстратной специфичности щелочной фосфатазы 49 М. ruber
2.10. Дефосфорилирование 5' -концов ДНК 49
ГЛАВА 3. РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 51
3.1. Клонирование гена щелочной фосфатазы М. ruber 51
Клонирование ПЦР-фрагментов гена 51
Клонирование полноразмерного гена 54
Нуклеотидная последовательность гена щелочной фосфатазы М. 55 ruber
Сравнение аминокислотных последовательностей щелочной 59 фосфатазы М. ruber и других бактериальных щелочных фосфатаз
Биосинтез рекомбинантной щелочной фосфатазы М. ruber в 61 клетках Е. coli
Выделение и очистка рекомбинантной щелочной фосфатазы М. 67 ruber
Биохимические характеристики рекомбинантной щелочной 69 фосфатазы М. ruber
Влияние рН и температуры на активность щелочной 70 фосфатазы М. ruber; термостабильность фермента, субстратная специфичность и величина Кт для 4НФФ
Влияние ионов металлов на активность щелочной фосфатазы 74 М. ruber
Влияние химических агентов на активность щелочной 76 фосфатазы М. ruber
Дефосфорилирование 5'-концов ДНК с помощью щелочной 77 фосфатазы М. ruber
ЗАКЛЮЧЕНИЕ 79
ВЫВОДЫ 85
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ 87
СПИСОК ИСПОЛЬЗОВАННЫХ СОКРАЩЕНИЙ
ИПТГ изопропил-1 -тио-Р-О-галактопиранозид
4НФФ 4-нитрофенилфосфат
ПААГ полиакриламидный гель
ПЦР полимеразная цепная реакция
ЭДТА этилендиаминтетрауксусная кислота
п.н. пар нуклеотидов
т.п.н. тысяч пар нуклеотидов
BCIP 5-бром-4-хлор-3-индолилфосфат
CIAP щелочная фосфатаза из кишечника теленка (calf intestine alkaline
phosphatase)
ELISA иммуноферментный анализ, основанный на использовании
твердофазных носителей (enzyme linked immunosorbent assay) Fru-6-P D-фруктозо-б-фосфат
GST глутатион S-трансфераза (glutathione S-transferase)
PMSF фенилметансульфонилфторид
SDS додецилсульфат натрия
Введение к работе
Актуальность работы
В настоящее время большой интерес представляют ферменты экстремофилов - микроорганизмов, живущих в экстремальных условиях. Интерес к этим ферментам обусловлен двумя причинами. Во-первых, выяснение конкретных молекулярных механизмов, обеспечивающих повышенную стабильность к разным критическим факторам внешней среды, является актуальной задачей современной энзимологии и белковой инженерии, так как в будущем позволит направленно создавать химерные белки с заданными свойствами. Во-вторых, такие стабильные ферменты, устойчивые к критическим условиям, крайне важны для решения целого ряда практических задач. В связи с этим особого внимания заслуживают термостабильные ферменты из термофильных микроорганизмов. В качестве такой модели нами была выбрана термостабильная щелочная фосфатаза термофильной бактерии Meiothermus ruber 132-4К. Следует отметить, что щелочная фосфатаза привлекательна не только в качестве модели при изучении механизмов, обуславливающих термостабильность, но и широким применением в молекулярной биологии, генной инженерии, биотехнологии и клинической диагностике, где особенно велика потребность в стабильных ферментах. Все вышесказанное определяет актуальность работы по клонированию, экспрессии и характеристике щелочной фосфатазы Meiothermus ruber 132-4К.
Цель работы
Целью данной работы является клонирование и экспрессия в клетках Escherichia coli гена щелочной фосфатазы термофильной бактерии Meiothermus ruber, установление нуклеотидной последовательности гена, выделение и очистка рекомбинантного белка и определение его основных физико-химических и биохимических характеристик.
Научная новизна
Впервые клонирован и экспрессирован в клетках Escherichia coli ген щелочной фосфатазы Meiothermus ruber 132-4К. Установлена нуклеотидная
последовательность клонированного гена, рекомбинантный белок выделен и очищен до электрофоретически гомогенного состояния. Щелочная фосфатаза Meiothermus ruber 132-4К представляет собой термостабильный фермент с рядом свойств, общих для большинства бактериальных щелочных фосфатаз. Аминокислотная последовательность щелочной фосфатазы Meiothermus ruber 132-4К показывает высокую степень гомологии по отношению к аминокислотным последовательностям щелочных фосфатаз родственных бактерий Thermus sp. и Thermus caldophilus и демонстрирует консерватизм аминокислотных остатков, вовлеченных в формирование активного центра фермента. В то же время, фермент из Meiothermus ruber 132-4К обладает рядом таких уникальных черт, как узкий рабочий интервал рН, строгая зависимость активности от наличия экзогенного Mg2+ и устойчивость к тиол-восстанавливающим агентам - 2-меркаптоэтанолу и дитиотреитолу.
Практическая значимость
Новая термостабильная щелочная фосфатаза Meiothermus ruber 132-4К может быть использована в генной инженерии для дефосфорилирования 5'-концов нуклеиновых кислот, в молекулярной биологии и диагностике в качестве компонента нерадиоактивных систем детекции, в методе ELISA, а также в качестве репортерного гена. Кроме того, фермент может быть использован в качестве модели при изучении термостабильных белков.
