Содержание к диссертации
Введение
1. Современные представления о процессах фолдинга белков 19
1.1. Сворачивание белков в клетке, роль шаперонов 19
1.2. Шаперонин цитоплазмы эукариот ССТ: структура, строение субединиц, механизм действия, взаимодействие с актином и тубулином 25
1.3. Факторы, определяющие формирование нативной структуры белка 33
1.4. Стабильность структуры белка в нативном состоянии 38
1.5. Модели сворачивания белков 44
1.6. Промежуточные состояния и их роль в сворачивании белка 52
2. Материалы и методы 57
2.1. Материалы 57
2.2. Методы 59
3. Факторы, определяющие стабильность и осо бенности процессов разворачивания-сворачивания однодоменных и двухдоменных белков 71
3.1. Обратимое разворачивание глутамин-связывающего белка. Роль лиганда в стабилизации структуры 72
3.2. Множественные денатурированные частично-свернутые состояния креатинкиназы 90
3.3. Множественность денатурированных частично-свернутых состояний однодоменного белка - карбоангидразы II 100
3.4. Одностадийный обратимый характер разворачивания-сворачивания дисульфидизомеразы С 107
3.5. Кинетические интермедиа на пути развоарчивания-сворачивания белков. Новое представление о процессах разворачиваниясворачивания актина 119
3.5.1. Инактивироваиный актин и его свойства 123
3.7. Влияние денатурирующего воздействия на процесс разворачива ния-сворачивания белка 194
4. Новые методические разработки 201
4.1. Параметрический метод представления экспериментальных данных по разворачиванию-сворачиванию белков 201
4.2. Триптофановая фосфоресценция при комнатной температуре - перспективы использования метода для изучения фолдинга белков 206
4.3. Зависимость характеристик триптофановой флуоресценции белка от длины волны возбуждающего света в нативном и развернутом состояниях 222
4.4. Особенности использования GdnHCl в качестве денатуранта 241
4.5. Спектральные свойства тиофлавина Т в растворителях различной вязкости и в составе амилоидных фибрилл. Тиофлавин Т как молекулярный ротор 249
Выводы 269
- Шаперонин цитоплазмы эукариот ССТ: структура, строение субединиц, механизм действия, взаимодействие с актином и тубулином
- Модели сворачивания белков
- Множественные денатурированные частично-свернутые состояния креатинкиназы
- Триптофановая фосфоресценция при комнатной температуре - перспективы использования метода для изучения фолдинга белков
Введение к работе
Актуальность проблемы. Вопрос о том, как белки сворачиваются в уникальное, компактное, высокоорганизованное, функционально-активное состояние, является одним из центральных вопросов современной молекулярной и клеточной биологии. По современным представлениям аминокислотная последовательность каждого конкретного белка, возникшая в результате эволюционного отбора, такова, что в ней запрограммирована структура нативного состояния, путь ее достижения и существование свободноэнергетического барьера между нативным и денатурированным состояниями белка. Последнее означает, что макромолекула белка может находиться либо в нативном, либо в денатурированном состоянии. При этом все макромолекулы нативного белка идентичны, если не считать различий структуры, обусловленных броуновским движением входящих в их состав атомов. Идентичность всех молекул каждого конкретного белка в нативном состоянии исключительно важна для его правильного функционирования. Денатурированных состояний может быть несколько. Каждому денатурированному состоянию отвечает ансамбль молекул, отличающихся друг от друга по структуре.
Хотя в клетке имеется много факторов, вовлеченных в процесс правильного сворачивания полипептидной цепи (ферменты, ответственные за цис-транс изомеризацию пролина и образование "правильных" дисульфидных связей, и шапероны), ни один из этих факторов не несет той информации, которая необходима для приобретения полипептидной цепью уникальной нативной структуры, и присутствие этих факторов не всегда является необходимым условием правильного сворачивания белка. Многие белки могут правильно сворачиваться из полностью разверну- того состояния in vitro. Несмотря на огромное число работ, посвященных фолдингу белков, вопрос о том, каким образом в аминокислотной последовательности белка закодирована его уникальная третичная структура (то, что называют иногда второй частью генетического кода), остается открытым. Основным подходом к решению проблемы фолдинга белков является изучение процессов их разворачивания-сворачивания и характеристика возникающих при этом промежуточных денатурированных частично-сверну/тых и неправильно свернутых состояний. Большинство исследований по изучению фолдинга белков выполнено на небольших однодомен-ных белках, для которых процесс разворачивания является обратимым. Актуальным является изучение путей разворачивания-сворачивания более сложных муль-тидоменных белков, выяснение вопроса о том, насколько одностадийность и обратимость разворачивания коррелирует с размером и мультидоменностыо белка, а также то, насколько путь разворачивания, последовательность образования и число возникающих денатурированных частично-свернутых состояний белка зависит от характера денатурирующего воздействия.
Долгое время процессам агрегации белков при фолдинге не уделялось должного внимания. В настоящее время совершенно очевидно, что изучение агрегации белков в процессе фолдинга имеет не только фундаментальное, но и большое практическое значение. Оказалось, что биотехнологический процесс получения рекомбинантных белков очень часто осложнен возникновением аморфных агрегатов, накапливающихся в телах включения (Frankel et al., 1990; Wetzel, 1994; Speed et al., 1996). Возникновение упорядоченных агрегатов - амилоидных фибрилл, является причиной так называемых "конформационных болезней" — многих тяжелых заболеваний, таких как нейродегенеративные болезни Альцгеймера и Паркинсона,
10 прионные заболевания и др. (Fink, 1998; Kelly, 1997; Kelly, 2000; Uversky et al.,
1999; Carrell, and Gooptu, 1998; Dobson, 2003,2004; Harper and Lansbury 1997; Гусев, 2004).
Успех исследований всегда в значительной степени зависит от наличия хорошо отработанных и адекватных методов. Поэтому одной из задач работы стало исследование спектральных свойств тиофлавина Т. Этот флуоресцентный краситель специфически взаимодействует только с белками в состоянии амилоидных фибрилл, и при этом интенсивность его флуоресценции возрастает на несколько порядков. Благодаря этим уникальным свойствам тиофлавин Т является прекрасным средством для диагностики возникновения амилоидных фибрилл в тканях и органах и, кроме того, для изучения фибриллогенеза и свойств амилоидных фибрилл in vitro (LeVine, 1999; Goers et al., 2002; Ban et al., 2003). Однако свойства этого красителя остаются мало изученными (см. Воропай и др., 2003). В связи с этим представлялось чрезвычайно актуальным выполнить исследования спектральных свойств этого красителя, которые бы позволили понять причины существенного (на несколько порядков) увеличения интенсивности флуоресценции тиофлавина Т при его инкорпорации в амилоидные фибриллы.
Цель и задачи исследования. Цель работы состояла в изучении особенностей разворачивания-сворачивания однодоменных и двухдоменных белков и свойств возникающих при этом промежуточных состояний, а также агрегированных форм белков, приводящих к необратимости процесса их денатурации. Для достижения поставленной цели необходимо было решить ряд конкретных задач: 1) Выяснить, насколько одностадийность и обратимость разворачивания- сворачивания коррелирует с размером и мультидоменностыо белка. С этой целью изучить
11 процессы разворачивания-сворачивания ряда двухдоменных белков (глобулярного актина, креатинкиназы, дисульфидизомеразы С, глутамин-связывающего белка) и однодоменного белка - карбоангидразы II;
2) Выяснить, насколько путь разворачивания каждого конкретного белка, последо вательность и число возникающих денатурированных частично-свернутых состоя ний зависит от характера денатурирующего воздействия;
3) Изучить кинетику разворачивания-сворачивания глобулярного актина, меха низмы образования инактивированного актина, охарактеризовать свойства кинети ческих интермедиатов, возникающих в процессе разворачивания этого белка;
Исследовать, на примере глутамин-связывающего белка, роль лигандов в стабилизации структуры белков к денатурирующему воздействию GdnHCl и нагревания;
Выяснить, на примере флуоресцентных белков EGFP, DsRed и их мутантных форм, особенности процессов разворачивания-сворачивания белков типа 0-бо-чоика и роль четвертичной структуры в стабилизации белков этого класса;
6) Осуществить разработку новых методических подходов для изучения процес сов разворачивания-сворачивания белков и для исследования свойств возникаю щих при этом интермедиатов и агрегированных форм белков и, в частности, выяс нить причины существенного возрастания квантового выхода флуоресценции ти- офлавина Т при взаимодействии с амилоидными фибриллами.
Научная новизна. Ряд результатов, полученных при изучении процессов разворачивания-сворачивания конкретных белков, получен впервые, в частности, впервые установлено одностадийное, обратимое разворачивание дисульфидизомеразы С, мультистадийное, но обратимое разворачивание креатинкиназы и глута- мин-связывающего белка под действием GdnHCl. Физико-химическими методами впервые прямо показаны изменения структуры креатинкиназы под воздействием небольших концентраций GdnHCl (0.1 М), ранее обнаруженные по изменению каталитической активности фермента. Предложена и обоснована принципиально новая схема процессов разворачивания-сворачивания актина, учитывающая существование вновь обнаруженных кинетических интермедиатов N* и U*, а также то, что инактивированный актин, ранее считавшийся интермедиатом на пути разворачивания белка, на самом деле является монодисперсным ассоциатом, образование которого препятствует правильному сворачиванию белка in vitro. Впервые на примере инактивированпого актина показано, что GdnHCl может, при определенных условиях, вызывать агрегацию белков. Впервые флуоресцентные свойства тиофла-вина Т (низкий квантовый выход в водных и спиртовых растворах и существенное возрастание квантового выхода при инкорпорации в амилоидные фибриллы) ассоциированы с принадлежностью этого красителя к классу соединений, известных как молекулярные роторы.
Основные положения, выдвигаемые на защиту.
Путь разворачивания, последовательность образования и число возникающих денатурированных частично-свернутых состояний каждого конкретного белка не зависит от характера денатурирующего воздействия и стабилизации структуры белка при связывании лиганда.
Способность белков к одностадийному обратимому разворачиванию нельзя однозначно связывать с их размером и мультидоменностыо.
Вновь обнаруженные промежуточные состояния актина N* и U* являются кинетическими интермедиатами на пути разворачивания-сворачивания актина, в то время как инактивированный актин, ранее считавшийся промежуточным состоянием белка, на самом деле является монодисперсным ассоциатом, образование которого препятствует правильному сворачиванию белка in vitro. На основании этих данных предложена принципиально новая схема процессов разворачивания-сворачивания глобулярного актина.
Четвертичная структура зеленых и красных флуоресцентных белков EGFP (зеленого мономера), zFP506 (зеленого тетрамера), mRFPl (красного мономера), "dimer2" (красного димера) и DsRedl (красного тетрамера) не является единственным фактором, определяющим различия в их стабильности.
Химический денатурант GdnHCl, часто используемый при изучении фолдинга белков, может, при определенных условиях, вызывать агрегацию белков.
Причиной существенного возрастания квантового выхода флуоресценции тиоф-лавина Т при его инкорпорации в амилоидные фибриллы является жесткость окружения, препятствующая повороту бензтиазолыюго и аминобензольного колец друг относительно друга в возбужденном состоянии. Флуоресцентные свойства тиофлавина Т характерны для соединений, относящихся к классу молекулярных роторов.
Теоретическая и практическая значимость. Сформулированная на основе полученных в работе экспериментальных результатов концепция универсального характера механизма разворачивания-сворачивания каждого конкретного белка, согласно которой путь разворачивания, последовательность образования и число возникающих денатурированных частично-свернутых состояний белка не зависит от характера денатурирующего воздействия, а также заключение о том, что способность белков к одностадийному и обратимому разворачиванию нельзя одно- значно связывать с их размером и мультидоменностью, обогащают представления о процессах разворачивания-сворачивания белков и могут быть использованы при дальнейших исследованиях процесса их фолдинга.
Обнаружение и характеристика ранее неизвестных интермедиатов, а также выяснение роли инактивированного актина в процессе разворачивания-сворачивания могут являться основой для понимания процессов фолдинга актина in vivo и для проведения дальнейших исследований, направленных на поиск путей ренатурации полностью развернутого актина in vitro с участием факторов, способствующих сворачиваниию актина в клетке (шаперонина ССТ и префолдина).
Обнаруженную на примере инактивированного актина способность GdnHCl при определенных условиях вызывать агрегацию белков следует учитывать в дальнейшем при использовании GdnHCl в качестве денатуранта в работах по изучению фолдинга белков.
Механизм существенного возрастания интенсивности флуоресценции тиоф-лавина Т при его инкорпорации в амилоидные фибриллы объяснен на основании представления о том, что тиофлавин Т относится к классу молекулярных роторов. Этот результат имеет существенное значение при проведении работ по исследованию фибриллогенеза и изучению свойств амилоидных фибрилл.
Введен в практику исследований фолдинга белков метод, основанный на параметрическом представлении экспериментальных данных, предложенный еще в 1975 г. Бурштейном (Бурштейн, 1976; Капланас и др. 1975), но долгое время практически не использовавшийся. Метод уже широко используется не только в нашей Лаборатории, но и в других лабораториях (см. например, Altschuler et al., 2005; Das et al., 2005 ).
Результаты работы используются при проведении лекционно-практических занятий для студентов Кафедры биофизики СПбГПУ.
Апробация работы. Материалы работы были представлены на 15 Международном симпозиуме биохимиков и молекулярных биологов стран Азии и Океании (FAOBMB) "Биохимия и молекулярная биология 21 века" (Пекин, Китай, 2000); Международных симпозиумах "Биологическая подвижность: новые направления исследований" (Пущино 2001, 2004); 9-й Международной конференции по спектроскопии биологических молекул (Прага, Чехия, 2001); Международных научных конференциях "Молекулярные, мембранные и клеточные основы функционирования биосистем" (Минск, Беларусь, 2002, 2004); III Съезде биохимического общества (Санкт-Петербург, 2002); V Съезде белорусского общественного объединения фотобиологов и биофизиков (Минск, Беларусь, 2002); Национальной итальянской конференции по биохимии (Рим, Италия, 2003), III Съезде биофизиков России (Воронеж, 2004), II Санкт-Петербургской конференции молодых ученых "Современные проблемы науки о полимерах" (Санкт-Петербург, 2006, пленарный доклад).
Финансовая поддержка работы. Работа выполнена с использованием оборудования ЦКП "Материаловедение и диагностика в передовых технологиях" при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 99-04-39106 ГФЕН-Китай, 00-04-49224, 00-04-81082 Бел, 01-04-49308, 02-04-39009 ГФЕН-Китай, 02-04-81013 Бел, 02-04-81018 Бел, 04-04-49290), Программы РАН "Молекулярная и клеточная биология", СОВ AS, INT-0002341(USA), INTAS (грант 01-2347), NATO Collaborative Linkage Grant PST.NR.CLG 981025 (Italy).
16 Публикации. По теме диссертации опубликовано 44 работы, из них 28 статей в рецензируемых журналах (11 - в отечественных и 17 - в международных журналах), а также тезисы 16 докладов на всероссийских и международных конференциях, совещаниях и съездах.
Структура диссертации. Диссертация состоит из Введения, четырех Глав, Выводов и Списка цитируемой литературы. В Главе 1 дан краткий обзор современных представлений о фолдинге белков in vivo и in vitro. Рассмотрена роль ша-перонов при фолдинге белков в клетке, особое внимание уделено роли АТФ-за-висимых шаперонов Hsp70 и шаперонина ССТ в клетках эукариот. Обсуждаются различные модели сворачивания белка in vitro (модель "нуклеации - роста", "стадийного сворачивания" и модель "энергетической воронки"), роль промежуточных денатурированных частично-свернутых состояний белков и переходного состояния в образовании нативного белка. Рассмотрены механизмы возникновения агрегированных форм белков и, в частности, амилоидных фибрилл. В Главе 2 дано краткое описание использованных в работе материалов и методов. В Главе 3 приведены результаты исследования процессов разворачивания-сворачивания ряда двухдо-менных белков: глутамин-связывающего белка, дисульфидизомеразы С, глобулярного актина и креатинкиназы и однодоменного белка карбоаигидразы II. Цель этих исследований состояла в том, чтобы выявить особенности разворачивания-сворачивания этого класса белков и, в частности, рассмотреть вопрос о том, насколько одностадийность и обратимость разворачивания коррелирует с размером, мульти-доменностыо и наличием лигандов, стабилизирующих белок. В этой же главе, на примере карбоаигидразы II, показана возможность мультистадийного необратимого разворачивания белка, имеющего однодоменную структуру. Результаты ис- следования процессов разворачивания-сворачивания карбоангидразы II и глута-мин-связывающего белка интересны также в связи с тем, что при переходе этого белка в состояние типа расплавленной глобулы проявляется эффект агрегирующего действия GdnHCl, наиболее ярко проявляющиеся при измерении зависимости интенсивности флуоресценции АНС и интенсивности светорассеяния от концентрации GdnHCl. Представлены также результаты сравнительного изучения устойчивости к денатурирующему воздействию GdnHCl ряда зеленых и красных флуоресцентных белков, отличающихся по их принадлежности к различным олигомер-ным формам: мономера (EGFP) и тетрамера (zFP506) зеленого флуоресцентного белка, мономера (mRFPl), димера ("dimer 2") и тетрамера (DsRedl) красного флуоресцентного белка, предпринятые для выяснения роли четвертичной структуры в стабилизации белков этого класса.
В заключительном разделе этой главы (раздел 3.7) сделано обобщающее заключение, вытекающее из результатов исследования ряда двухдоменных белков и однодоменного белка - карбоангидразы II о том, что 1) способность белков к обратимому одностадийному разворачиванию нельзя однозначно связывать с их размером и мультидомешюсть; 2) путь разворачивания, последовательность образования и число возникающих денатурированных частично-свернутых состояний каждого конкретного белка не зависит от характера денатурирующего воздействия и стабилизации структуры при связывании лиганда и о том, что, по-видимому, 3) АНС связывается не с гидрофобными кластерами на поверхности белка в состоянии расплавленной глобулы, а с ассоциатами макромолекул белка в состоянии расплавленной глобулы, образующимися в результате "слипания" макромолекул за счет гидрофобных взаимодействий в отсутствие электростатического отталкивания.
В Главе 4 представлены сведения о новых собственных методических разработках, использованных при проведении исследований, а также о тех результатах работы, учет которых может быть полезным при проведении исследований процессов разворачивания-сворачивания белков в дальнейшем. В разделе 4.1 излагается суть метода параметрического представления экспериментальных данных по разворачиванию-сворачиванию белков, а также приводятся наиболее яркие результаты, полученные с помощью этого подхода. В разделе 4.2 обсуждаются перспективы использования метода ФКТ для изучения свойств аморфных агрегетов, фибриллол-генеза и свойств амилоидных фибрилл. В разделе 4.3 рассмотрен вопрос о зависимости вклада отдельных триптофановых остатков белков от длины волны возбуждающего света - эффект, который необходимо учитывать при использовании метода собственной флуоресценции для изучения структуры и конформационных превращений белков. В разделе 4.4 представлены данные о том, что GdnHCl, при определенных условиях может вызывать агрегацию белков, что необходимо учитывать в работах по изучению фолдинга белков при использовании GdnHCl в качестве денатурата. И, наконец, в разделе 4.5 приведены результаты изучения спектральных свойств тиофлавина Т, позволившие объяснить существенное возрастание квантового выхода этого красите при его инкорпорации в амилоидные фибриллы на основе представления о том, что этот краситель относится к классу молекулярных роторов.
Шаперонин цитоплазмы эукариот ССТ: структура, строение субединиц, механизм действия, взаимодействие с актином и тубулином
Наиболее сложное и отличающееся от других шаперонинов группы II строение имеет цитоплазматический шаперонин эукариот ССТ (Chaperonin Containing ТСР-1; ТСР-1 - tailless complex polypeptide-1; также называемый TRiC) (Carrascosa et al., 2001; Willisonand Horwich, 1996; Gutsche et al., 1999; Willison, 1999; Leroux and Hartl, 2000; Willison and Grantham, 2001, Valpuestaa et al., 2002). В отличие от других шаперонинов ССТ участвует в фолдинге лишь небольшого числа белков (см. ниже). Сложность структуры ССТ выражается также в том, что хотя он также как другие шаперонины состоит из двух наложенных друг на друга тороидов (Llorca et al., 1999 a, b; 2000; 2001), каждый тороид образован восемью, хотя и гомологичными (30% идентичности), различными субъединицами (рис. 1.1.3 и 1.2.1; ССТ а, Р, у, 5, є, , г), 0; ССТ1-ССТ8 в дрожжах) со строго определенным положением в кольце (Liou and Willison, 1997; Liou et al., 1998; Grantham et al., 2000). Каждая субъединица ССТ кодируется своим геном, идентичным во всех изученных организмах и во всех тканях (Willison and Grantham, 2001), исключение составляет ткапеспецифический ССТ2 яичка млекопитающих (Kubota et al., 1997). Структура ССТ была получена с разрешением 25-30 А с помощью криоэлектронной микроскопии (Llorca et al., 1999 a, b; 2000; 2001) и очень похожа на структуру других шаперонинов этой группы (Ditzel et al., 1998; Schoehn et al., 2000 a, b; Kubota et al., 1997) - рис. 1.2.1. Это - цилиндрическая структура, имеющая вид бочонка диаметром 150 А и высотой 160 А. Каждая субъединица одного кольца контактирует только с одной субъединицей другого кольца (Ditzel et al., 1998; Llorca et al., 1999 а), в то время как в шаперонине группы I тороиды несколько смещены друг относительно друга (Braig et al., 1994; Xu etal., 1997). К сожалению, до сих пор рентгеноструктурный анализ ССТ не проводился. Копформационные изменения ССТ, обусловленные взаимодействием с АТФ, существенно отличаются от тех, которые происходят в при этом в GroEL. В шаперонинах эубак-терий связывание с нуклеотидом вызывает небольшие изменения, которые позволяют присоединиться кошаперону, который в свою очередь вызывает существенные изменения олигомерной структуры и закрывает полость, существующую внутри колец (Xu et al., 1997; Roseman et al., 1996; Llorca et al., 1997; Szpikowska et al., 1998).
В тоже время связывание АТФ с ССТ (и с другими шаперонинами группы II) само по себе вызывает существенные копформационные перестройки в апикальных доменах, что приводит к закрытию полости (Ditzel et al., 1998; Llorca et al., 1999 a; Schoehn et al., 2000 a, b; Llorca et al., 1998). Закрытие полости осуществляется за счет дополнительного фрагмента, расположенного в верхней части апикального домена шаперонинов группы II, который работает по типу ирисовой диафрагмы (Llorca et al., 2001). Как и в случае других шаперонинов, для осуществления помощи сворачиванию других белков ССТ использует копформационные перестройки, возникающие при взаимодействии с АТФ (Schoehn et al., 1997, 2000 b). Процессы связывания субстрата и сворачивания полипептидной цепи также различается в шаперонинах прокариот и эукариот. Так в случае GroEL, его взаимо-действиеразвернутой полипептидной цепью является неспецифическим и происходит между гидрофобной поверхностью апикального домена любой субъединицы и гидрофобной областью развернутой полипептидной цепи (Fenton et al., 1994; Buckle et al., 1997; Farr et al., 2000). В случае эукариотического шаперонина во взаимодействии с его развернутым субстратом (актином и тубулином) участвуют только определенные субъединицы шаперонина (Carrascosa et al., 2001; Llorca et al., 2000) и связывающие детерминанты этих двух цитоскелетных белков (рис. 1.2.1; Rommelaere et al., 1999; Hynes and Willison, 2000; Ritco-Vonsovici and Willison, 2000; Dobrzynski, et al., 2000). Специфическое связывание между CCT и его субстратами предполагает присутствие заряженных остатков в области апикальных доменов, где согласно данным электронной микроскопии находится участок связывания с субстратом (Llorca et al., 1999 b; 2000). Другим отличительным свойством шапиронина ССТ по сравнению с GroEL является то, что он может взаимодействовать только с уже частично-свернутыми аминокислотными последовательностями. Многочисленные исследования показали, что GroEL узнает цепочку любой степени свернутости, если только она имеет гидрофобные кластеры (Buckle et al., 1997). В то же время, согласно данным крио-электронной микроскопии низкого разрешения с ССТ взаимодействуют только белки цитоскелета в частично-свернутом состоянии (Llorca et al., 2000; Horovitz et al., 2001). В транслокации таких частично-свернутых аминокислотных последовательностей на ССТ участвуют специальные белки. Так, например, для сворачивания актина необходимо его взаимодействие с префолдином (PFD; Hansen et al., 1999), который участвует в транслокации частично-свернутой цепи актина к шапе-ронину ССТ (рис. 1.2.2). И, наконец, еще одно важное различие между механизмом действия GroEL и ССТ заключается в особенностях взаимодействия шаперонишіа и субстрата после связывания с АТФ. В случае GroEL конформационные изменения, вызываемые взаимодействием с АТФ приводят к связыванию GroES, который способствует прохождению полипептидной цепи в полость GroEL и закрывает полость ша-перонина, в которой белок имеет возможность свернуться. Это означает, что участие GroEL в сворачивании полипептидной цепи является пассивным (см. также Shtilerman et al., 1999). ССТ участвует в сворачивании белка активно. Во всех изученных шаперонинах эукариот связывание с АТФ приводит не только к конфор-мационным изменениям, приводящим к закрытию-открытию полости, но также к аллостерическим измерениям субъединиц в тороидах (Horovitz et al., 2001). Как в случая бактериального, так и в случае цитоплазматического шаперонина их структура (типа бочонка), обеспечивает изоляцию полипептидной цепи белка от других полипептидов, но в случае цитоплазматического шаперонина эукариот ССТ его конформациопные перестройки непосредственно влияют на сворачивание субстрата, который остается связанным с шаперонином в течение всего процесса фоддинга (рис. 1.2.3, Llorca et al., 2001; Neirynck et al., 2006), а не находится в свободном состоянии в его полости, как в случае GroEL. Считается также, что сродство АТФ у разных субъединиц кольца разное (Ка-fri et al., 2001). Это согласуется с тем, что все восемь субъединиц кольца имеют фиксированное положение (Liou and Willison, 1997 ), а также с результатами ген-ноинженерных экспериментов, которые показали, что связывание АТФ с ССТ зависит от того, в какой из субъединиц произведена аминокислотная замена, в отличие от GroEL, для которого связывание АТФ зависит только от числа субъединиц, в которых произведены аминокислотные замены (Lin and Sherman, 1997).
Считается, что актин и тубулин являются основными субстратами для фол-динга с участием шаперонина ССТ (см. рис. 1.2.1). Для правильного сворачивания как in vivo так и in vitro оба белкЩ нуждаются в присутствии этого шаперонина (Sternhcht et al., 1993). Данные электронной микроскопии свидетельствуют о том, что оба белка взаимодействуют с ССТ только в уже частично-свернутом состоянии, когда уже образовано два домена, разделенных щелью, в которой на последующих этапах происходит связывание нуклеотида и иона магния (Llorca et al., 2000). В случае актина взаимодействие его двух доменов осуществляется с двумя субъединицами ССТ, локализованными в положении 1 и 4 (ССТ8 и ССТр, или ССТ5 и ССТЕ) (Llorca et al., 1999 b). Взаимодействие двух доменов тубулина осуществляется с пятью субъединицами ССТ двумя различными способами (Llorca et al., 2000). Возможно, ССТ эволюционировал из примитивного шаперонинина в более сложную структуру, обеспечивающую фолдинг цитоскелетных белков (а воз-вожно и других белков) посредством стабилизации открытой конформации. Если это так, то, возможно, критическим шагом в сворачивании актина и тубулина являются конформационные изменения вызванные в ССТ при присоединении АТФ, и они связаны с правильным сворачиванием нуклетид-связывающего центра этих белков. В то)же время, можно считать доказанным, что ССТ взаимодействует не только с актином и тубулином, но с гораздо большим числом белков (9 - 15% вновь синтезируемых белков (Thulasariman et al., 1999; Dunn et al., 2001; Willison and Grantham, 2001). Было показано, что как in vitro так и in vivo помимо актина и тубулина ССТ взаимодействует с другими белками цитоскелета, такими как тяжелый меромиозин (НММ), актин-связывающие белки, кофйлин и актин-деполимери-зующий фактор-1. Было показано, что и белки, вовлеченные в другие клеточные процессы, взаимодействуют с ССТ. Среди них Ga-трансдуцин, участвующий в фо- тотрансдукции ретиналя, и циклин Е, участвующий в контроле клеточного цикла, а так же люцифераза. ССТ участвует также в фолдинге ряда вирусных белков.
Модели сворачивания белков
Для объяснения путей и механизмов сворачивания белков было предложено несколько моделей (рис. 1.5.1). Модель "нуклеации - роста", предполагающая, что процесс сворачивания белка подобен процессу кристаллизации, и что лимитирующей стадией самоорганизации макромолекулы белка является стадия образования ядра сворачивания, хорошо объясняет процесс сворачивания небольших однодо-менных белков, происходящий по принципу "все или ничего" (Tsong et al., 1972). В основе концепции стадийного сворачивания белка лежит представление о том, что процесс самоорганизации белковых молекул сопровождается формированием ряда промежуточных состояний с последовательным возрастанием степени упорядоченности (Птицын, 1973). На первой стадии образуются зародыши а-спи-ралей и Р-тяжей, которые на следующей стадии компактизуются с образованием промежуточного состояния. В этом состоянии макромолекула белка сохраняет компактность и выраженную вторичную структуру, присущую нативному состоянию, однако отличается от нативной молекулы отсутствием жесткой упаковки бо ковых цепей. Птицыным была выдвинута идея, что это состояние белка, названное по совокупности перечисленных выше признаков "расплавленной глобулой", может играть универсальную роль в процессе самоорганизации белковой молекулы (см.: Ohgushi, Wada, 1983). Согласно современным представлениям, непротиворечиво объясняющим все полученные к настоящему времени экспериментальные данные, переход от полностью развернутого состояния в уникальное нативное состояние определяется энергетической поверхностыо, т.е. зависимостью свободной энергии макромолекулы белка ото всех координат, определяющих состояние системы (модель "энергетических поверхностей" - Pande, 1998; Dinner et al., 2000). Число возможных конформациоииых состояний полипептидной цепи уменьшается по мере приближения к нативному состоянию, поэтому такую энергетическую поверхность часто называют также "энергетической воронкой" (Dill, 1997). В рамках этой модели развернутому состоянию полипептидной цепи отвечает широкое "холмистое плато" свободной энергии, отражающее реализацию этого состояния огромным числом конформаций основной цепи. Возвышенности на плато отражают существование запрещенных конформаций (рис. 1.5.2). Переход от полностью развернутого состояния в уникальное нативное состояние может осуществляться различными путями. Число возможных конформациоииых состояний полипептидной цепи уменьшается по мере приближения к нативному состоянию, поэтому такую энергетическую поверхность часто называют также "энергетической воронкой".
Совпадение денатурационных кривых, полученных путем измерения различных физических характеристик белка, является экспериментальным свидетельством того, что переход между этими состояниями осуществляется по прин- ципу "все или ничего". Это означает, что плато отделено от входа в воронку сво-бодноэнергетическим барьером, отвечающим переходному состоянию #. Переходное состояние и ядро сворачивания. Изучение переходного состояния - один из ключевых моментов в изучении процесса фолдинга. Величина барьера между нативным и денатурированным состоянием может быть определена из экспериментов по изучению кинетики сворачивания. Для того, чтобы определить структуру переходного состояния, т.е. выявить те аминокислотные остатки, взаимодействие между которыми происходит на ранних стадиях сворачивания белка, А. Фершт предложил использовать изучение кинетики сворачивания различных му-тантных форм белка (см. например, Matouschek et al., 1989, 1990; Fersht, 1998). Точечная мутация в белке может приводить к изменению стабильности нативного белка и скорости сворачивания. Различие стабильности нативного состояния белка дикого типа и мутанта AAFN.u может быть определено на основании измерения де-натурационных кривых этих двух белков. Путем измерения констант скоростей образования нативного состояния белка дикого типа и мутанта может быть определена разность свободных энергий этих белков в переходном состоянии AAF#.u (рис. 1.4.1). Величина отношения Ф# = AAF#_u / AAFM.U является мерой участия этого остатка в формировании структуры переходного состояния. Величина Ф# равна единице в том случае, если контакты этой аминокислоты, определяющие изменение стабильности белка в нативном состоянии, возникли уже в переходном состоянии. Это говорит о том, что данная аминокислота входит в ядро сворачивания. Другой крайний случай - Ф# равно нулю. Это свидетельствует о том, что контакты данной аминокислоты, влияющие на стабильность нативного белка, возникают на последнем этапе сворачивания после преодоления молекулой свободноэнергетического барьера, отвечающего переходному состоянию. В настоящее время ключевым вопросом при исследовании фолдинга белков является выяснение структуры ядра сворачивания, что требует выполнения чрезвычайно трудоемких экспериментов с привлечением методов генной инженерии для получения мутантных форм белка и физико-химического исследования кинетики процессов их сворачивания-разворачивания. Развернутое состояние белка. Структура белков в развернутом состоянии вряд ли даже отдаленно напоминает структуру статистического клубка, характерного для линейных полимеров в "хорошем" растворителе. Белок приобретает структуру, близкую к структуре статистического клубка лишь в растворах с высоким содержанием денатурантов, таких как мочевина или гуанидингидрохлорид. Имеются, однако, данные о том, что даже при высоких концентрациях мочевины (8 М), макромолекулы некоторых белков сохраняют элементы структуры присущие нативному состоянию (Shortle, Ackerman, 2001) . Таким образом, состояние U достаточно компактно и число конформаций основной цепи, с помощью которых оно может быть реализовано, значительно меньше числа всех возможных конформаций основной цепи. Нативное состояние - отвечает ли оно глобальному минимуму свободной энергии? В том случае, если на склонах воронки нет глубоких минимумов, молекула, после преодоления свободноэнергетического барьера, быстро достигает на-тивного состояния. Скорее всего, минимум свободной энергии, отвечающий нативному состоянию, в которое белок сворачивается наиболее быстро, является одновременно и абсолютным минимумом свободной энергии. Модель энергетической воронки позволяет, однако предположить, что нативное состояние не обязательно отвечает абсолютному минимуму свободной энергии, а является состоянием, отвечающим минимуму свободной энергии, который достигается скорейшим образом. Возможно, существует еще один более глубокий или близкий по величине свободной энергии минимум, отделенный от нативного состояния свободноэнергетиче-ским барьером.
В этом случае молекула быстро сворачивается в нативное состояние, а потом медленно переходит в неправильно свернутое состояние, отвечающее этому более глубокому, или глобальному минимуму. Скорость перехода в это неправильно свернутое состояние зависит от свободноэнергетического барьера, отделяющего его от нативного состояния. Примерами белков, для которых такая ситуация реализуется, являются ингибиторы сериновых протеаз - серпины. Энергетические поверхности сворачивания прионов, по-видимому, также имеют два близких по величине минимума свободной энергии. В нативном состоянии прионы являются белками с выраженной а-спиральной вторичной структурой. Второму минимуму свободной энергии отвечает состояние с Р-складчатой вторичной структурой. Белок в этом состоянии склонен к агрегации с образованием амилоидных фибрилл. В обычных условиях такие неправильно свернутые молекулы белка ликвидируются защитными системами клетки. Привнесение этого белка извне инициирует процесс превращения сс-формы белка в Р-форму (рис. 1.5.3), что становится причиной развития инфекционной губчатой энцифалопатии - болезни "коровьего бешенства" (Zahn, 1999, Гусев, 2005). Существует ряд других тяжких заболеваний (которые иногда называют конформационными болезнями), таких как болезнь Альцгеймера, Паркинсона и т.д., также связанных с нарушением правильного фолдинга белков и возникновением амилоидных фибрилл (Harper, Lansbury, 1997; Carrell, Gooptu, 1998; Fink, 1998; Uversky et al., 1999). Болезни эти наиболее часто встречаются у людей преклонного возраста, когда защитные системы клеток и организма в целом не справляются с функцией ликвидации неправильно свернутых белков.
Множественные денатурированные частично-свернутые состояния креатинкиназы
Креатинкиназа, относящаяся к классу фосфотрансфераз, играет важную роль в быстрой регенерации АТР в клетках. Цитоплазматическая креатинкиназа из мышц кролика - димер. Мономер креатинкиназы состоит из двух доменов: а-спираль-ного N-концевого домена из 100 аминокислотных остатков и большого С-конце-вого домена из 250 аминокислотных остатков, соединенных между собой длинным линкерным участком (рис.3.2.1). Интерес к исследованию креатинкиназы был обусловлен тем, что, согласно литературным данным, для этого белка было установлено изменение ферментативной активности при концентрациях денатурирующих агентов значительно меньших тех, при которых были зарегистрированы изменения структуры фермента физико-химическими методами. Поэтому при изучении процессов разворачивания-сворачивания предполагалось особое внимание обратить на изменения структуры белка при малых концентрациях денатуранта. К моменту начала проведения этой работы в литературе не было единого мнения относительно числа и свойств промежуточных состояний, возникающих при разворачивании креатинкиназы под действием GdnHCl. В то же время было известно, что процесс разворачивания креатинкиназы осложнен ассоциацией частично-свернутых интер-медиатов. В связи с этим одна из задач работы состояла в том, чтобы выявить и охарактеризовать возникающие в процессе разворачивания-сворачивания промежуточные состояния и агрегированные формы белка (см. Kuznetsova et al., 2002а). Даже беглый взгляд на изменение спектра флуоресценции креатинкиназы под действием GdnHCl (рис.3.2.2) позволяет судить о сложности происходящих в белке структурных превращений. На основании анализа изменений величины CD в ближней и дальней УФ-областях спектра (рис. 3.2.3 и 3.2.4) и изменения гидродинамического объема (рис.3.2.5), происходящих под действием GdnHCl, можно сделать заключение о том, что процесс разворачивания-сворачивания креатинкиназы происходит с образованием по крайней мере двух частично-свернутых промежуточных состояний. Первый интермедиат возникает в области 0.5-0.6 М GdnHCl. Белок в этом состоянии элюирует с колонки одним пиком, отвечающим Rs = 33.7 А, в то время как нативная креатинкиназа также элюирует с колонки одним пиком, соответствующим радиусу Стокса Rs = 35.3 А, что хорошо согласуется с литературными данными (см. Kuznetsova et al., 2002а ) и подтверждает данные о том, что в нативном состоянии креатинкиназа является димером. Изменение радиуса Стокса при денатурации GdnHCl объяснено диссоциацией белка на мономеры, имеющие больший объем, чем в составе димера нативного белка.
Белок в этом состоянии является компактным интермедиатом, имеющим вторичную структуру сходную со вторичной структурой нативного белка, но несколько нарушенную третичную структуру, т.е. напоминает интермедиат типа расплавленной глобулы. Интересно, однако, отметить, что криатинкиназа уже в нативном состоянии связывает АНС и интенсивность флуоресценции красителя лишь незначительно возрастает при увеличении концентрации GdnHCl, причем максимальная интенсивность АНС наблюдается в растворах 0.0-0.3 М GdnHCl (рис. 3.2.5). Второй интермедиат наблюдается в области 2.0-2.5 М GdnHCl и характеризуется нарушением вторичной структуры и увеличением Rs, т.е. имеет свойства, характерные для состояния типа "предшественник расплавленной глобулы". С помощью метода собственной УФ-флуоресценции удалось также зафиксировать изменения структуры белка при небольших концентрациях денатуранта (0.1 М GdnHCl). Зависимости величины параметра Л и анизотропии флуоресценции (рис. 3.2.6, вставка) свидетельствуют о существовании двух интермедиатов I] и І2 при 0.1 и 0.6 М GdnHCl, соответственно. Обращает внимание тот факт, что с помощью метода собственной УФ-флуоресценции впервые удалось показать возникновение промежуточного состояния под действием малых концентраций GdnHCl, ранее зафиксированных по изменению каталитической активности фермента (Fan et al., 1998), но не удалось зарегистрировать промежуточное состояние в области 2.0-2.5 М GdnHCl, существование которого было показано с помощью методов CD и гельпроникающей хроматографии. Однако все три промежуточных состояния креатинкиназы удалось зафиксировать с использованием метода, основанного на построении параметрических зависимостей (рис.3.2.6). Интересно отметить, что промежуточное состояние, возникающее при 2.0-2.5 М GdnHCl, обогащено р-структурами (рис.3.2.7), наличие которых является явной предпосылкой к образованию агрегатов. Дальнейшее подтверждение существования агрегатов было получено методом гельпроникающей хроматографии (см. Kuznetsova et al., 2002а). Надо подчеркнуть, что агрегация, наблюдаемая при разворачивании креатинкиназы необычна. Хорошо известно, что агрегация частично-свернутых белков является основной причиной того, что процессы денатурации необратимы. Однако в случае креатинкиназы показана высокая обратимость процессов разворачивания. Более того, было установлено, что растворимые агрегаты, накапливающиеся при разворачивании креатинкиназы, полностью ренатурируют в нативное состояние после удаления денатурирующих агентов. Таким образом, в результате исследования процессов разворачивания-сворачивания креатинкиназы выявлены множественные конформационные превращения фермента, происходящие под действием GdnHCl. В частности, впервые, с использованием физико-химического метода, зарегистрированы изменения структуры креатинкиназы при небольших добавках денатуранта (0.1М GdnHCl), приводящих к изменению активности фермента.
На основании сопоставления спектров собственной флуоресценции креатинкиназы в растворах с различным содержанием GdnHCl, полученных при денатурации из раствора нативного белка и при ренатурации из раствора полностью развернутого белка в ЗМ GdnHCl (их совпадения), сделано заключение о полной обратимости процессов сворачивания-разворачивания фермента. Показано, что при разворачивании креатинкиназы существенную роль играет агрегация частично-свернутых денатурированных интермедиатов. Предложена модель разворачивания креатинкиназы, которая учитывает как структурные изменения, так и ассоциацию частично свернутых интермедиатов. Карбоангидраза - небольшой однодоменный цинк-содержащий белок с выраженной Р-складчатой структурой (рис. 3.3.1), единственная полипептидная цепь которого состоит из 259 аминокислотных остатков, карбоангидраза является ферментом, относящимся к классу карбонат-дегидротаз. Карбоангидраза быка содержит 7 триптофаповых остатков, три из которых (Тф 16, Тф 97 и Тф 209) являются внутренними с исключительно высокой плотностыо микроокружения (/=0.83, 0.81 и 0.82, соответсвенно) и следовательно малодоступными растворителю. Триптофа-новые остатки Тф 5 и Тф 125 также являются внутренними, но плотность их микроокружения несколько меньше(й?=0.78). Наиболее доступны растворителю Тф 192 и Тф 245. Плотность их микроокружения составляет 0.69 и 0.66, соответственно. По литературным данным (Martesson et al., 1995) наибольший вклад в излучение вносят триптофановые остатки Тф 97 и Тф 245 (52 и 38% соответственно). Относительно небольшие размеры карбоангидразы (29 KDa), отсутствие ди-сульфидных связей и свободных SH- групп сделали карбоангидразу предметом интенсивного изучения процессов разворачивания-сворачивания (Yazgan et al., 1982; Wong et al., 1974; Carlsson et al., 1973; Martensson et., 1993, 1995; Rodionova et al., 1989; Uversky and Ptitsyn, 1996; Bushmarina et al., 2001). Изучение разворачивания-сворачивания этого фермента было предпринято в связи с надеждой выявить, используя параметрическое представление экспериментальных данных по разворачиванию-сворачиванию, новые, ранее неустановленные, промежуточные состояния, и, в частности, состояние, обусловленное стабилизирующим действием на структу- ру белка малых концентраций GdnHCl, подобно промежуточному состоянию, обнаруженному для креатинкиназы при 0.1 М GdnHCl.
Триптофановая фосфоресценция при комнатной температуре - перспективы использования метода для изучения фолдинга белков
Основным механизмом тушения фосфоресценции в среде, не содержащей кислорода, является дезактивация возбужденных триплетных состояний в результате непланарной деформации структуры хромофора при соударении с молекулами окружающей среды. Поэтому фосфоресценцию обычно наблюдают в жестких матрицах при низкой температуре. В то же время установлено, что некоторые белки в растворе фосфоресцируют при комнатной температуре (Мажуль и др. 1983; Vanderkooi, 1992) в том случае, если в белке существует необходимая для возникновения фосфоресценции жесткость микроокружения триптофановых (тирозиновых) остатков. В частности, было предположено, что триптофановая ФКТ должна наблюдаться для инактивированного актина, представляющего монодисперсный ассоциат (см. раздел 3.5.1). При локализации триптофановых остатков в жестких внутренних участках глобулы с высокой плотностью упаковки микроокружения значение г ФКТ составляет от 1-2 с до сотен миллисекунд. В таком окружении, близком по жесткости к состоянию кристалла, находится, например, остаток Тгр 109 щелочной фосфатазы E.coli (т&2 с). Значения г ФКТ остатков, локализованных в более подвижном окружении, сокращаются до десятков миллисекунд, а в некоторых случаях даже до 1-0.5мс. Возбужденные триплетные состояния триптофановых остатков, расположенных на периферии глобулы в высокоподвижном окружении, дезактивируются в основном безызлучательным путем, что проявляется в эффективном динамическом тушении ФКТ, приводящим к значительному уменьшению времени затухания (Strain- bini, 1989; Vanderkooi, 1992; Gonnelli, Strambini, 1993, 1995; Subramaniam et al., 1996; Shauerte et al., 1997; Sun et al, 1998; Мажуль и др., 1999,2000; Fisher et al., 2000). Существенное влияние на характеристики триптофановой фосфоресценции может оказывать локализация в непосредственной близости от индолыюго кольца триптофанового остатка боковых радикалов некоторых аминокислот - тушителей фосфоресценции. По способности тушить триптофановую фосфоресценцию боковые цепи аминокислотных остатков можно разделить на три класса: 1) сильнотушащие (kq «5-Ю8 М с"1), к которым относятся остатки цистеина и цистина; 2) умереннотушащие (&q=5-105 - 2-Ю7 M V1) - остатки тирозина, гистидина и триптофана; 3) слаботушащие и нетушащие (kq 10"5 M V1), включающие все остальные остатки аминокислот (Gonnelli, Strambini, 1995).
Тушение ФКТ боковыми группами цистеина, цистина, тирозина и триптофана возможно, если расстояние между индольным кольцом и тушащей группой соизмеримо с величиной Ван-дер-Вальсового радиуса (не превышает нескольких ангстрем). Особая роль в эффектах внутримолекулярного тушения принадлежит дисуль-фидным группам. Их выраженная способность к тушению ФКТ объясняется способностью акцептировать электрон от триптофана в возбужденном триплетном состоянии (Li et al., 1989; 1992; Shauerte et al., 1997). Внутримолекулярное тушение может осуществляться не только при перманентном контакте индолыюго кольца с боковой группой остатка аминокислоты (статическое тушение), но и в моменты их относительно кратковременных контактов, происходящих в результате флуктуации структуры белка (Gonnelli, Strambini, 1995). Таким образом, эффективность тушащего действия групп - потенциальных тушителей фосфоресценции, сближенных с индольными кольцами в силу особенностей пространственной структуры макромолекулы, также в значительной мере определяется внутримолекулярной подвижностью микроокружения хромофоров. Присутствие в составе микроокружения триптофанового остатка групп - потенциальных тушителей ФКТ не всегда приводят к эффекту тушения фосфоресценции. Эффективность тушения определяется не только расстоянием между остатком триптофана и тушащей группой, но и положением тушащей группы относительно индолыюго кольца триптофанового остатка. Из-за сложности учета всех факторов, приводящих к дезактивации триплетных возбужденных состояний, определить точно параметры фосфоресценции каждого индивидуального триптофанового остатка в белке удается далеко не всегда. Большинство белков в растворе даже при отсутствии кислорода не фосфоресцирует при комнатной температуре в миллисекундном и секундном диапазонах. Это обусловлено прежде всего достаточно высокой эффективностью динамического тушения фосфоресценции хромофоров. Возрастание жесткости структуры не способных к ФКТ белков в результате перевода их из раствора в твердое агрегатное состояние (кристаллы, собственные пленки) во всех случаях приводит к появлению хорошо регистрируемой ФКТ. У способных к ФКТ белков такая процедура сопряжена с увеличением квантового выхода и времени затухания ФКТ в десятки раз. Сходный эффект наблюдается при образовании агрегатов белков (Мажуль и др., 1983, 2000). Триптофановая ФКТ актина в различных структурных состояниях. Зарегистрированные нами спектры триптофановой ФКТ нативного G- и F-актина и инак-тивированного актина имеют максимумы при длинах волн 417, 445 и 470 нм и не различаются между собой по форме (рис. 4.2.1). На (рис. 4.2.2) представлена кинетика затухания ФКТ нативного и инактивиро-ванного актина. Кинетика затухания триптофановой ФКТ G-, F- и инактивированного актина удовлетворительно описывается суммой двух экспонент. Значения различных параметров ФКТ (гь т2, т , сс\, S\) для G-, F- и инактивированного актина приведены в табл. 4.2.1. Следует обратить внимание на хорошее совпадение значений времен жизни быстрой и медленной компонент ФКТ и их вкладов для G- и F-актина, с данными, полученными Страмбини и Лерером (Strambini, Lehrer, 1991). При полимеризации актина быстрая компонента триптофановой ФКТ не изменяется, а значение медленной компоненты и ее вклад в суммарную фосфоресценцию увеличиваются (табл. 4.2.1). Оказалось, что для инактивированного актина время жизни ФКТ существенно больше, чем для нативного актина вне зависимости от способа инактивации.
При этом увеличивается как ц, так и Тг- Кроме того, изменяются вклады этих компонент в суммарную фосфоресценцию. В отличие от G- и F-актина, в инактивирован-ном актине больший вклад в фосфоресценцию вносит медленная компонента. Изменение характеристик ФКТ при денатурации актина GdnHCl. На рис. 4.2.3 {а, б) представлены кинетические зависимости т и 1Ш„ ФКТ растворов актина различной концентрации при инкубации в 1.8 М GdnHCl. В наших экспериментах начало фосфоресцентных измерений лимитировалось "мертвым временем", необходимым для удаления из раствора тушителя фосфоресценции - кислорода, которое составляло приблизительно 7 мин. Было установлено, что при концентрации белка 0.8 мг/мл в первые минуты после начала измерений ФКТ актина не регистрируется. Затем появлялась слабая по интенсивности ФКТ. При дальнейшей инкубации актина в растворе GdnHCl значения г и 7Ш1Т ФКТ увеличивались во времени и достигали максимума приблизительно через 70 мин (рис. 4.2.3). При увеличении концентрации актина до 1.0 - 2.5 мг/мл ФКТ регистрировалась сразу же после окончания процедуры удаления кислорода из раствора, т.е. через 7 мин после начала инкубации с GdnHCl, и максимальный уровень значений г и /инт достигался значительно быстрее. После достижения максимальных значений величины т и /инт ФКТ актина сохраняли постоянство. Максимальное значение т ФКТ является качественной (интенсивной) характеристикой инактивироваппого актина и, как и следовало ожидать, не зависит от концентрации актина. Максимальное значение /инт зависит от концентрации актина, поскольку /инт - экстенсивная характеристика системы. Результаты исследования кинетики изменения /инт ФКТ при переводе актина в 1.8 М GdnHCl, выполненные при относительно низкой концентрации белка (0.8 мг/мл), подтвердили вывод о том, что образованию инактивированного актина предшествует существенное разворачивание макромолекулы белка. Эти эксперименты свидетельствуют также о том, что в этом состоянии (U ) /инт ФКТ равна нулю. Слабую ФКТ удается зарегистрировать в этих условиях лишь через несколько минут после начала фосфоресцентных измерений (до этого еще 7 мин требуется для удаления кислорода).
