Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 7
1.1. Современные представления о структуре и фолдинге белков. Промежуточные и неправильно свернутые состояния, их роль в образовании нативного белка и нарушениях фолдинга 7
1.1.1. Первичная структура белка определяет его нашивную пространственную структуру и путь сворачивания 13
1.1.2. Особенности фолдинга белков в клетке 15
1.1.3. Одностадийное кооперативное сворачивание небольших белков 16
1.1.4. Сворачивание белков через образование промежуточных состояний 19
1.1.5. Модель энергетической воронки 21
1.1.6. Переходное состояние и ядро сворачивания 21
1.1.7. Развернутое состояние белка 23
1.1.8. Нативное состояние - отвечает ли оно глобальному минимуму свободной энергии 24
1.1.9. Промежуточные состояния, их роль в образовании агрегированных форм белков 26
1.2. Свойства актина в различных структурных состояниях 28
1.2.1. Собственная флуоресценция нативного актина. Микроокружение триптофановых остатков и их вклад во флуоресценцию белка 31
1.2.2. Инактивированный актин - термодинамически стабильное промежуточное состояние белка 42
1.2.3. Вторичная структура нативного и инактивированного актина 46
1.2.4. Диэлектрические и релаксационные свойства микроокружения триптофановых остатков нативного и инактивированного актина 48
1.2.5. Локализация триптофановых остатков в инактивированном актине 51
1.2.6. Гидродинамические размеры инактивированного актина 53
1.2.7. Внутримолекулярная подвижность триптофановых остатков нативного и инактивированного актина 55
1.2.8. Свойства поверхности инактивированного актина 58
1.2.9. Представляет ли инактивированныи актин структуру типа расплавленной глобулы 60
2. Материалы и методы 62
2.1. Получение, очистка и характеристика препаратов актина 62
2.2. Флуоресцентные измерения 62
2.3. Кинетические эксперименты по сворачиванию-разворачиванию актина 63
2.4. КД измерения 64
2.5 Фосфоресцентные измерения 64
3. Результаты и обсуждение 65
3.1. Кинетика денатурации актина 66
3.1.1. Существенно развернутый кинетический интермедиат, предшествующий образованию инактивированного актина 66
3.1.2. Кинетические константы процесса денатурации актина гуанидингидрохлоридом 72
З.1.З. Кинетика разворачивания актина формамидом 74
3.1.4. Кинетика образования инактивированного актина 77
3.2. Специфические взаимодействия актина с гуанидингдрохлоридом 87
3.3. Новая схема процессов сворачивания-разворачивания актина 93
Выводы 104
- Свойства актина в различных структурных состояниях
- Локализация триптофановых остатков в инактивированном актине
- Кинетические эксперименты по сворачиванию-разворачиванию актина
- Специфические взаимодействия актина с гуанидингдрохлоридом
Введение к работе
Актуальность исследования 4
Цели и задачи исследования 5
Научная новизна исследований 5
Теоретическое и практическое значение работы 6
Свойства актина в различных структурных состояниях
Актин, один из основных белков системы мышечного сокращения и цитоскелета эукариотических клеток (Sheterline et al., 1998; Pollard et al., 2000). Глобула G-актина (42 kDa) сформирована одной полипептидной цепью, состоящей из 375 аминокислотных остатков (Рис. 1.7). При низкой ионной силе актин существует в виде мономера (G-актин), а в присутствии нейтральных солей он полимеризуется с образованием двухцепочечной спирали, состоящей из молекул G-актина (так называемого фибриллярного или F-актина). F-актин формирует остов тонких филаментов скелетных мышц. Трехмерная структура была определена для актина в комплексе с белками, препятствующими полимеризации актина — ДНКазой I (Kabsch et al., 1990), гельзолином (McLaughlin et al., 1993; Robinson et al., 1999) и профилином (Schutt et al., 1993), а также для АДФ-актина, модифицированного тетраметилродамин-5-малеимидом (Otterbein et al., 2001). По данным рентгеноструктурного анализа комплекса G- актина с ДНКазой I, молекула актина состоит из двух доменов, ее общий размер составляет 55 55x35 А (Рис. 1.7, 1.8). Как N-, так и С-конец полипептидной цепи находятся в малом домене. Каждый домен состоит из двух субдоменов. Малый домен в свою очередь состоит из субдомена I (остатки 1 - 32, 70 - 144 и 338 - 372) и субдомена 2 (остатки 33 - 69), а большой домен — из субдомена 3 (остатки 145 - 180 и 270 — 337) и субдомена 4 (остатки 181 - 269). Элементами структуры малого домена являются пять р-складчатых структур, окруженные пятью а-спиралями (в субдомене 1) и три антипараллельных р-складчатых листа с а-спиралью, соединяющей концы двух Р-листов (в субдомене 2). В субдомене 3 большого домена имеется пять Р-складчатых структур, окруженные тремя а-спиралями и в субдомене 4 - два антипараллельных Р-слоя и четыре а спирали (Рис. 1.8). Домены разделены глубокой щелью. В щели между доменами расположены нековалентно связанная молекула АТФ (или АДФ) и один двухвалентный катион, который стабилизирует глобулярную структуру белка. In vivo актин связывает ион магния, in vitro он обычно замещается на ион кальция. Катион находится в гидрофобном кармане, образованном фосфатными группами нуклеотида и остатками Asp 11, Gin 137 и Asp 154. Адениновое основание входит в карман, образованный остатками Lys 213, Glu 214, Thr 303, Met 305, Туг 306 и Lys 336. Между этими аминокислотными остатками и АТФ (АДФ) нет специфического взаимодействия.
Гидроксильные группы рибозного кольца и фосфатные группы нуклеотида участвуют в образовании водородных связей с гидроксильными и амидными группами аминокислотных остатков Ser 14, Gly 15, Leu 16, Lys 18, Asp 157, Gly 158, Val 159 и Gly 302 субдоменов 1 и 3, расположенных в области щели. 1.2.1. Собственная флуоресценция нашивного актина. Микроокружение триптофановых остатков. В нативном состоянии актин имеет относительно коротковолновый спектр флуоресценции (Ятах = 325 нм, А = 2.6; Kuznetsova et al., 1988). Лишь немногие из изученных триптофансодержащих белков, например, азурин Pseudomonas aeruginosa (Finazzi-Argo et al., 1970), РНКаза ТІ (Yamamoto and Tanaka, 1970), РНКаза C2 (Agekyan et ah, 1988) и парвальбумин мерланга (Permyakov et ah, 1980) имеют более коротковолновый спектр флуоресценции. Как известно, положение и форма спектра флуоресценции белка определяются наложением спектров флуоресценции отдельных триптофановых остатков — их положением в шкале длин волн и относительным вкладом в суммарное свечение. Актин содержит четыре триптофановых остатка, которые расположены в субдомене 1. Триптофановые остатки Тгр 79, Тф 86 и Тф 340 входят в состав а-спиралей, образованных остатками Тф 79 - Asn 92 и Ser 338 - Ser 348. Триптофановый остаток Тгр 356 расположен в неструктурированной области между а-спиральными участками, образованными остатками Ser 350 - Met 355 и Lys 359 - Ala 365 (Рис. 1.7, 1.8). Вклад отдельных триптофановых остатков актина в собственную флуоресценцию белка. Положение спектров флуоресценции отдельных триптофановых остатков зависит от полярности их микроокружения и его способности релаксировать за время жизни флуоресценции триптофанового остатка. Необходимо учитывать, что полярность микроокружения триптофанового остатка определяется не только его доступностью молекулам растворителя, но и собственными полярными группами белка, входящими в состав микроокружения. Коротковолновый спектр белка может появляться в двух случаях: если триптофановый остаток расположен в гидрофобном микроокружении, вне зависимости от релаксационных свойств последнего, либо за счет жесткости микроокружения, если даже оно полярное. В последнем случае излучение происходит из неравновесного состояния, не отвечающего минимуму энергии взаимодействия со средой. Положение спектра флуоресценции актина можно объяснить, основываясь на результатах анализа микроокружения каждого триптофанового остатка. Анализ микроокружения триптофановых остатков актина был выполнен (Кузнецова и Туроверов, 1998) с использованием данных о пространственной структуре актина в комплексе с ДНКазой I (файл Pdblatn.ent в Protein Data Bank). При этом было сделано предположение о том, что пространственные структуры свободного актина и актина в комплексе с ДНКазой I совпадают. За микроокружение триптофановых остатков была принята совокупность всех атомов, удаленных от геометрического центра индольного кольца на расстояние г, меньше некоторого заданного значения г0.
При выборе величины г0 учитывалось, что максимальное расстояние от центра индольного кольца до его периферии с учетом водородного атома составляет 4.2 А, а Ван-дер-Ваальсов радиус атомов углерода с присоединенными к ним атомами водорода составляет приблизительно 2.2 А. Отсюда следует, что углеродная группа может контактировать с индольным кольцом своим атомом водорода, в том случае, если атом углерода удален от центра индольного кольца не более чем на 6.4 А. Различие размеров атомов углерода, азота и кислорода для данного анализа несущественно. Для того, чтобы при анализе наверняка учесть все атомы, контактирующие с индольным кольцом, величина г0 была выбрана равной 7 A (Turoverov et al., 1985; Кузнецова и Туроверов, 1998). Анализ микроокружения каждого триптофанового остатка позволил выявить все группы боковых цепей белка, которые могут влиять на их флуоресцентные свойства (Табл. 1.2). Одним из параметров микроокружения, существенным для анализа флуоресцентных свойств, является плотность упаковки входящих в его состав атомов. Мера плотности упаковки атомов микроокружения определяется как число атомов, входящих в его состав (число атомов, координаты которых попадают в сферу радиуса 7 А, за исключением 9 атомов самого кольца), или отношение объема, занимаемого атомами микроокружения, к общему объему сферы с радиусом 7А: Объем каждого атома определялся на основании известных Ван-дер-Ваальсовых радиусов, причем учитывалась лишь та часть объема, которая попадает в сферу с радиусом 7 А. Конечно такое рассмотрение не совсем точно, так как атомы образуют друг с другом химические связи и, следовательно, занимают меньший объем. Тем не менее, для сравнительной оценки плотности упаковки микроокружения разных триптофановых остатков данное обстоятельство не является существенным. Обычно принимается, что флуоресцентные характеристики триптофановых остатков зависят от их доступности растворителю. Доступность триптофановых остатков молекулам растворителя зависит не только от плотности упаковки микроокружения триптофанового остатка, а также от его локализации в макромолекуле белка, т.е. расположен остаток в центре макромолекулы белка или на периферии. Для расчета доступности триптофанового остатка растворителю рассчитывалась радиальная зависимость плотности упаковки атомов вокруг геометрического центра триптофанового остатка:
Локализация триптофановых остатков в инактивированном актине
Экспериментально измеренные зависимости 1(/1 от концентрации акриламида [Q] для нативного и инактивированного актина представляют собой кривые, выгнутые к оси абсцисс (Рис. 1.16). В то же время зависимости г0/г от [Q] во всем экспериментальном интервале изменения концентрации акриламида (от 0 до 0.8 М) имеют линейный характер. Это, а также линейный характер зависимости 1(/1-exp(V[QJ) от концентрации акриламида [Q], где V - константа статического тушения, свидетельствуют о существовании как для нативного, так и для инактивированного актина наряду с динамическим, статического тушения. Константы Штерн-Фольмера динамического (К) и статического (V) тушения, а также бимолекулярная константа динамического тушения (q), определенные с учетом времен жизни возбужденного состояния (Табл. 1.4), свидетельствуют о низкой эффективности динамического тушения флуоресценции актина не только в нативном, но и в инактивированном состоянии (Kuznetsova et al., 1999а). Таким образом, триптофановые остатки, ответственные за флуоресценцию инактивированного актина, находятся во внутренних, недоступных для растворителя, областях макромолекулы, сформированных полярными группами боковых цепей аминокислот. Длинноволновый сдвиг спектра триптофановой флуоресценции очень часто связывают с увеличением доступности триптофаиовых остатков молекулам растворителя. Именно такое объяснение длинноволнового сдвига спектра флуоресценции при инактивации актина приводится в литературе (Lehrer and Kerwar, 1972; Bertazzon et al., 1990). На примере актина становится очевидным, что положение спектра триптофановой флуоресценции определяется не только доступностью триптофаиовых остатков растворителю, но и полярностью микроокружения, сформированного собственными группами белка. 1.2.6. Гидродинамические размеры инактивированного актина. Переход нативный - инактивированный актин сопровождается возрастанием анизотропии флуоресценции (Рис. 1.10 — 1.12). Независимость для инактивированного актина (также как и для F-актина) величины 1/г от вязкости растворителя (Рис. 1.17; Kuznetsova et al., 1988) означает, что время вращательной релаксации макромолекулы как целого для инактивированного и F-актина много больше времени жизни возбужденного состояния ответственных за флуоресценцию триптофаиовых остатков. В случае F-актина это связано с включением глобулы актина в полимерную цепь, в случае инактивированного актина — со специфической ассоциацией макромолекул актина при инактивации.
По данным седиментационного анализа, инактивированный актин представляет монодисперсный и стабильный ассоциат с константой седиментации 20S (Kuznetsova et al., 1988). Косвенные свидетельства самоассоциации макромолекул актина при инактивации были получены из анализа спектров КД в дальней УФ-области спектра (Kuznetsova et al., 1988). Использование метода гельфильтрации подтвердило монодисперсность образований, представляющих инактивированный актин, независимость гидродинамических свойств от способа получения образцов инактивированного актина и концентрации препарата в пределах от 1.0 до 0.0005 мг/мл (Kuznetsova et al., 1999а). Радиус Стокса, определенный на основании данных гельфильтрации (Уверский, 1998), оказался равным 28 и 80 А для нативного и инактивированного актина, соответственно. Молекулярная масса инактивированного актина, определенная на основании известного соотношения (Тенфорд, 1965): \-v2p где S - коэффициент седиментации, Rs - радиус Стокса, NA - число Лвагадро, rj -вязкость растворителя, р - плотность раствора (при бесконечном разбавлении равна плотности растворителя р0), v2 - парциальный удельный объем растворенного вещества в растворе, оказалась равной 646 Ша. Молекулярная масса мономерного актина составляет 42 kDa. Это означает, что в составе монодисперсного ассоциата, представляющего собой инактивированный актин, содержится 15 мономерных единиц. С учетом возможных погрешностей, связанных с калибровкой колонки, следует относиться с осторожностью к оценке размеров ассоциата. Однако можно с уверенностью говорить о том, что инактивированный актин является монодисперсным ассоциатом (Kuznetsova et al., 1999а, b; Turoverov et al., 1999a). Тенденция к агрегации (или, возможно, как в случае актина, к специфической ассоциации), обусловленная наличием обширных гидрофобных кластеров на поверхности, наряду с сохранением компактности и вторичной структуры, присущей нативному белку, по-видимому, одно из неотъемлемых СВОЙСТВ, присущих любому белку в промежуточном состоянии типа расплавленной глобулы. В этом отношении актин не является исключением (см., например, Cleland and Randolph, 1992; Gokhale et al., 1996; Geziraati et al., 1996; Tani et al.,1995; Уверский, 1998). 1.2,7. Внутримолекулярная подвижность триптофановых остатков нативного и инактивированного актина. Для G-актина, в отличие от инактивированного и F-актина, наклон перреновской зависимости, полученной путем изменения вязкости смешанного водно-глицеринового растворителя, не равен нулю.
В то же время, как и следовало ожидать, наклон асимптоты кривой этой зависимости для G-актина значительно меньше, чем наклон для полностью развернутого белка в 8 М мочевине (Рис. 1.17). Для решения вопроса о том, обусловлен ли наклон только подвижностью макромолекулы как целого, или, кроме того, имеет место внутримолекулярная подвижность триптофановых остатков, был выполнен специальный анализ (Turoverov et al., 1999а). Измерение кривых затухания флуоресценции (Рис. 1,18) и определение времен жизни (Табл. 1.4) позволило оценить время вращательной релаксации р Кинетические кривые затухания флуоресценции для нативного, инактивированного и полностью развернутого актина не могут быть удовлетворительно описаны в моноэкспоненциальном приближении, но хорошо описываются биэкспоненциальными кривыми. Поскольку немоноэкспоненциальный характер затухания имеет место и для белков с одним триптофановым остатком и для модельных соединений в растворе (Szabo and Rayner, 1980), обнаруженный биэкспоненциальный характер затухания не следует напрямую связывать с существованием в актине нескольких триптофановых остатков. Полученные экспериментально значения г были использованы для оценки времени вращательной релаксации актина. Величина р для G-актина оказалась равной 46 не. Для того чтобы сделать заключение о существовании или отсутствии внутримолекулярной подвижности триптофановых остатков G-актина, со временем сопоставимым со временем жизни возбужденного состояния триптофановых остатков, значение р следует сравнить с расчетным значением р0, которое было определено исходя из размеров макромолекулы, ее формы и предполагаемой гидратации (см. Кузнецова и др., 1981 Туроверов и Кузнецова, 1983). Расчет показал, что для G-актина ро 54нс, С учетом того что макромолекула актина может быть вписана в прямоугольный параллелепипед со сторонами 55, 55 и 35 A (Kabsch et al., 1990), т.е. она может быть аппроксимирована сплюснутым эллипсоидом вращения с соотношением осей 1.0: 1.6, д может составлять, в зависимости от ориентации триптофановых остатков относительно главных осей макромолекулы, от 58 до 62 не. Сопоставление р и д свидетельствует о том, что установленный
Кинетические эксперименты по сворачиванию-разворачиванию актина
Все кинетические эксперименты были выполнены в микрокговетах 101.0I6-QS 5x5 мм (Helma, Germany). При проведении кинетических экспериментов перевод белка в растворы с различной концентрацией GdnHCl выполнялся путем ручного смешивания раствора белка (50 мкл) с буфером, содержащим соответствующую концентрацию GdnHCl (350 мкл). В экспериментах по ренатурации необходимую концентрацию GdnHCl получали разведением растворов актина в 4 М GdnHCl G-буфером. "Мертвое время" подобного рода кинетических экспериментов было определено экспериментально. Для этого 350 мкл буфера вводилось в 50 мкл раствора нативного белка, и 350 мкл 4М GdnHCl вводились в кювету с 50 мкл раствора белка в 4М GdnHCl. Эти эксперименты показали, что "мертвое время" кинетических экспериментов, т. е. время необходимое для полного перемешивания раствора после смешения, меньше 4 с. Измерение быстрой кинетики выполняли с помощью аппаратуры стоп-флоу MOS 450 фирмы Bio-Logic в лаборатории д-ра Форже (СЕА, Гренобль). Конечная концентрация GdnHCl в растворах контролировалась по показателю преломления с использованием рефрактометра Abbe (ЛОМО). Для построения кинетических кривых анизотропии флуоресценции использовали временные зависимости вертикальной и горизонтальной составляющей интенсивности флуоресценции, на основании которых определяли анизотропию (Jablonski, 1957): r=(#-G/j)/(/;+2G/;) где Іу и Ґн — вертикальная и горизонтальная компоненты интенсивности флуоресценции, возбуждаемой вертикально поляризованным светом, G - коэффициент, характеризующий различие чувствительности установки к вертикально и горизонтально поляризованному свету (G = I" I lff ). Для построения кинетических кривых параметра А использовались временные зависимости интенсивности флуоресценции, зарегистрированные при длинах волн 320 и 365 им, на основании которых определяли значение параметра А. 2.4. КД измерения. Регистрация спектров КД в дальней УФ — области была выполнена с использованием дихрографа Mark V (Jobin-Yvon, USA). Длина оптического пути используемых кювет 0.1 см. Концентрация актина 0.4 мг/мл. При построении КД спектра белка учитывался спектр КД растворителя. Значение эллиптичности в, конвертировали в эллиптичность на один аминокислотный остаток {&], в соответствии с формулой: где / - длина оптического пути в см, с - концентрация белка в мг/мл, MWR -средняя масса аминокислоты в белке. 2.5. Фосфоресцентные измерения.
Кинетику затухания ФКТ регистрировали с помощью автоматизированного высокочувствительного устройства с монохроматорами в каналах возбуждения и регистрации (Mazhul1 and Shcharbin, 1997; Mazhul and Shcharbin, 1998). Время разрешения фосфороскопа составляло І мс. Возбуждение фосфоресценции проводили при длине волны 297 нм. Регистрацию кинетики затухания фосфоресценции осуществляли при длине волны 445 нм. ФКТ актина измеряли в кварцевой кювете с длиной оптического пути 2 мм. Кинетику затухания ФКТ актина анализировали в биэкспоненциальном приближении по методу наименьших квадратов с помощью программы Fotobio, разработанной Отделом системного анализа БГУ: I(t)/fo - Х\ ехр (-//ґ[) + а2ехр (-г/г2), где /(/) - интенсивность фосфоресценции, /о - интенсивность фосфоресценции в начальный момент времени, ті - время жизни быстрого компонента, хі - время жизни медленного компонента, oti - и 0 - амплитуды быстрого и медленного компонента, соответственно (ai+ct2=l). Для оценки адекватности выбранной модели экспериментальным данным использовали критерий %, а также характер временной зависимости средневзвешенных остатков (разности между измеренными значениями функции затухания и ее восстановленными значениями) и автокорреляционной функции остатков. Во всех работах, посвященных процессам денатурации актина, предполагалось, что актин последовательно переходит от нативного к инактивированному, а затем к полностью развернутому состоянию (Татунашвили и Привалов, 1984; Кузнецова и др., 1998; Nagy and Jencks, 1962; West et al., 1967; Lehrer and Kerwar, 1972; Nagy and Strzelecka-Golaszewska , 1972; Strzelecka-Golaszewska et al., 1974; Contaxis et al., 1977; Strzelecka-Golaszewska et al., 1985; Kuznetsova et al., 1988; Turoverov et al., 1999b): N -I U, (3.1) т.е. инактивированный актин рассматривался во всех этих работах как промежуточное состояние между нативньш и полностью развернутым состояниями белка. Результаты измерения равновесных зависимостей различных физических характеристик, казалось бы, подтверждают эту модель. Действительно, данные представленные на Рис. 1.10 свидетельствуют о том, что GdnHCI вызывает по мере увеличения его концентрации два последовательных конформационных перехода: переход от нативного к инактивированному актиігу в области концентраций 0-0.8 М GdnHCI и переход от инактивированного к полностью развернутому состоянию в области концентраций 1.8—4.0 М GdnHCI, разделенных областью концентраций от 0.8 до 1.8 М GdnHCI, в которой актин находится преимущественно в инактивированном состоянии. При этом переход от нативного состояния к инактивированному является необратимым (Bertazzon et al., 1990; Le Bihan and Gicquaud, 1993; Kuznetsova et al., 1999b; Turoverov et al., 1999b; Schuler et al., 2000), и, поэтому, все структурные характеристики актина в диапазоне низких концентраций денатуранта (0.0-0.8 М) являются квазистационарными. В связи с этим необходимо отметить, что кривые, представленные на Рис. 1.10 были зарегистрированы после инкубации актина в течение 24 ч в растворах GdnHCI соответствующей концентрации. В эту схему, однако, совершенно не укладываются данные о том, что инактивированный актин является термодинамически стабильным монодисперсным ассоциатом (Kuznetsova et al., 1999b).
В связи с этим в настоящей работе было предпринято более тщательное, с привлечением новых методических подходов, исследование равновесных (квазиравновесных) денатурационных зависимостей, а также кинетики разворачивания актина и образования инактивированного актина. 3.1. Кинетика денатурации актина Переход от нативного к инактивированному актину необратим. Поэтому в области концентраций GdnHCl от 0 до 0.8 М зависимости флуоресцентных характеристик актина от концентрации денатуранта носят квазистационарный характер. Это обстоятельство, а также то, что инактивированный актин, является ассоциатом и должен образовываться путем постепенного наращивания массы, определило необходимость изучения кинетики денатурации актина. 3.1.1. Существенно развернутый кинетический интермедиат, предшествующий образованию инактивированного актина. Для изучения процесса образования инактивированного актина под действием GdnHCl были измерены кинетические кривые изменения интенсивности собственной флуоресценции (Turoverov et al., 2002). Сравнение спектров флуоресценции белка в нативном, инактивированном и полностью развернутом состоянии свидетельствует о том, что наибольшее различие в интенсивности флуоресценции наблюдается при длине волны регистрации 320 нм (Рис. 1.14). Этим определяли выбор длины волны флуоресценции при изучении процессов разворачивания актина. Форма кинетических кривых изменения интенсивности флуоресценции, измеренных при разных конечных концентрациях GdnHCl, существенно различается (Рис. 3.1а). При небольших концентрациях GdnHCl (меньше 1.0 М) интенсивность флуоресценции монотонно уменьшается со временем, медленно достигая своей равновесной величины (Рис. 3.16). При высокой концентрации GdnHCl (выше 3.0 М) интенсивность флуоресценции так же уменьшается монотонно и быстро достигает значения, характерного для полностью развернутого актина. Наиболее интересные результаты получены для промежуточных концентраций GdnHCl (от 1.0 до 2.0 М). При этих концентрациях GdnHCl интенсивность флуоресценции сначала падает, а затем медленно растет, достигая равновесной величины через несколько часов (Рис. 3.16).
Специфические взаимодействия актина с гуанидингдрохлоридом
Для объяснения причины сложного характера зависимости интенсивности флуоресценции АНС от концентрации GdnHCl в растворах актина (см. рис.3.66) были зарегистрированы аналогичные зависимости для ряда других характеристик, в том числе для интенсивности светорассеяния. Результаты этих измерений, выполненных после инкубации исходно нативного актина в растворах GdnHCl различной концентрации в течение 24 ч, представлены на Рис. 3.10а. На Рис. 3.106 представлены аналогичные зависимости, зарегистрированные для исходно инактивированного актина. Интенсивность флуоресценции АНС в водном растворе (0.0М GdnHCl) в присутствии инактивированного актина приблизительно в 20 раз больше по сравнению с интенсивностью флуоресценции АНС в присутствии нативного актина той же концентрации. Максимальная интенсивность флуоресценции АНС наблюдается при концентрациях 0.45-0.50 М и 0.2-0.3 М GdnHCl для растворов исходно нативного и исходно инактивированного актина, соответственно. При этих же концентрациях GdnHCl наблюдается максимальная интенсивность светорассеяния. Сходство характера зависимостей интенсивности флуоресценции АНС и интенсивности светорассеяния для исходно нативного и исходно инактивированного актина заставляет искать причину обнаруженных эффектов в универсальном характере взаимодействия GdnHCl при его небольших концентрациях в растворе, с макромолекулами белка. Мы объяснили этот эффект взаимодействием групп NH2 катионов гуанидингидрохлорида (GuH4) с группами С=0 карбоксильных групп глутаминовой и аспарагиновой кислот и амидных групп глутамина и аспарагина, находящегося на поверхности макромолекулы нативного или инактивированного актина. Число отрицательно заряженных групп OD2 (22 группы) и ОЕ2 (28 групп) глутаминовой и аспарагиновых кислот в макромолекуле актина больше числа положительно заряженных групп NZ лизина (18 групп), NH1 групп аргинина (18 групп) и NE2 групп гистидина (9 групп). Таким образом, в целом макромолекула актина несет отрицательный заряд. Распределение отрицательно заряженных групп OD2 и ОЕ2, положительно заряженных NZ Lys, NE2 Arg, NH1 His, а также групп C=0 на поверхности макромолекулы актина представлены на Рис. 3.11.
С ростом числа ионов GuH , связанных с белком, увеличивается количество положительных групп на поверхности белка и при некоторой концентрации GdnHCl макромолекула белка в целом становится нейтральной. При этом создаются условия агрегации макромолекул актина между собой. Это и является причиной возрастания светорассеяния и связывания молекул АНС, которые встраиваются между макромолекулами актина, образующими агрегат. При дальнейшем увеличении концентрации GdnHCl число положительно заряженных групп на поверхности макромолекулы белка начинает превышать число отрицательно заряженных групп. Наличие положительно заряженных групп на поверхности макромолекулы препятствует их агрегации. То обстоятельство, что зависимости интенсивности флуоресценции АНС и интенсивности светорассеяния от концентрации GdnHCl для исходно нативного и исходно инактивированного актина имеют некоторые различия, позволяет предположить, что в состав агрегатов могут входить макромолекулы как нативного актина, так и инактивированного актина. Как было отмечено выше максимумы зависимостей интенсивности флуоресценции АНС и интенсивности светорассеяния в случае исходно нативного актина наблюдается при больших концентрациях GdnHCl по сравнению с аналогичными зависимостями для исходно инактивированного актина. Это может быть связано с тем, что поверхность инактивированного актина несет меньшее число нескомпенсированных отрицательно заряженных групп по сравнению с поверхностью нативного актина и для нейтрализации избыточно отрицательного заряда на поверхности необходимо меньшее число катионов GuH1". Если наша гипотеза верна, то это означает, что в растворах GdnHCl размер агрегатов инактивированного актина существенно зависит от концентрации денатуранта. Инактивированный актин представляет из себя монодисперсный ассоциат, состоящих из 15 мономерных единиц, вне зависимости от того, каким образом он получен, лишь в водном растворе в отсутствие GdnHCl. Зависимости ц гъ Щ, Лшт от концентрации GdnHCl для исходно нативного и исходно инактивированного актина совпадают в области концентрации GdnHCl от 0.8 до 1.8 М (Рис 3. 12), При концентрации GdnHCl меньше 0.8 М значения ц, т2 и /„нТ меньше, а оц больше для исходно нативного актина по сравнению с соответствующими значениями для исходно инактивированного белка. Это обусловлено тем, что в этой области концентраций GdnHCl значения всех этих характеристик ФКТ для исходно нативного актина являются квазистационарными и не достигают своих равновесных значений, характерных для инактивированного актина, при инкубации в растворах GdnHCl в течение суток и более. Значения тх и х% для инактивированного актина слабо уменьшаются с ростом концентрации GdnHCl в области от 0 до 1.8 М. За счет перераспределения вкладов быстрой и медленной компоненты среднее значение времен затухания фосфоресценции остаются постоянными в этой области концентрации GdnHCl. В тоже время интегральная интенсивность фосфоресценции существенно уменьшается с ростом концентрации GdnHCl от 0 до 1.8 М (Рис. 3.126). Это уменьшение настолько значительно, что на его фоне не регистрируется четко изменение интегральной интенсивности фосфоресценции, обусловленное превращением инактивированного актина в полностью развернутое состояние, происходящее в области концентраций GdnHCl от 1.8 до 3.5 М.
В настоящее время трудно однозначно объяснить, почему время затухания ФКТ для инактивированного актина практически не зависит от концентрации GdnHCl в растворе в пределах от 0 до 4.0 М, в то время как /инт существенно уменьшается с ростом концентрации GdnHCl. Интегральная интенсивность ФКТ полностью развернутого актина равна нулю, поэтому в области концентраций GdnHCl, отвечающих переходу инактивированный актин - полностью разверігутое состояние (1.8-3.5 М GdnHCl) интегральная интенсивность ФКТ уменьшается по мере уменьшения доли инактивированного актина, а время затухания ФКТ остается неизменным и равным времени затухания ФКТ инактивированного актина. Известно, что разворачивание исходно инактивированного актина при его переходе в раствор 4 М GdnHCl осуществляеся медленно (см. раздел 3.3), так что даже через сутки после начала инкубации в 4 М GdnHCl в растворе сохраняется некоторое количество инактивированного актина. Вот почему для исходно инактивированного актина зависимость Ium от концентрации GdnHCl удается измерять вплоть до 4 М GdnHCl. Времена жизни ФКТ растворов исходно инактивированного актина в 4 М GdnHCl после инкубации в течение 24 часов, как и следовало ожидать, сохраняют значения характерные для инакгивированного актина. В области концентраций GdnHCl от 1.8 до приблизительно 3.0 М зависимости интенсивности флуоресценции АНС отражают переход инактивированного актина к полностью развернутому состоянию (Рис. 3.10). При этом превращение инактивированный актин - полностью развернутый актин для исходно инактивированного актина проявляется не так резко, как в случае исходно нативного актина. Это согласуется с данными о том, что разворачивание инактивированного актина происходит значительно медленнее по сравнению с процессом U - I, полученными при регистрации характеристик собственной флуоресценции (см. раздел 3.3). По сравнению с зависимостями, представленными Рис. 1.10 выявлено возрастание величины параметра А и анизотропии флуоресценции в области концентраций 0.0-0.1 М GdnHCl, которое при дальнейшем увеличении концентраций денатуранта сменяется уменьшением величины этих характеристик.
Похожие диссертации на Кинетика образования и свойства промежуточных и неправильно свернутых мономерных и агрегированных форм актина
