Содержание к диссертации
Введение
ЧАСТЬ I. Обзор литературы 6
Глава 1. Активные формы кислорода, окислительный стресс и антиоксидантная защита клетки
1.1. Активные формы кислорода (АФК) 6
1.2. Роль АФК в развитии окислительного стресса и его биомаркеры 10
1.3. Антиоксидантная защита клетки 15
Глава 2. Роль белков и аминокислот в окислительно-восстановительном балансе клетки
2.1. Свободнорадикальное окисление белков 24
2.2. Способность аминокислот к нейтрализации последствий окислительного стресса 36
Глава 3. Долгоживущие белковые радикалы 40
ЧАСТЬ II. МЕТОДИЧЕСКАЯ 46
Глава 4. Материалы и методы исследования 46
4.1. Материалы 46
4.2. Методы 47
4.2.1. Воздействие ионизирующего излучения и тепла 47
4.2.2. Определение концентрации ДНК 48
4.2.3. Очистка моноклональных антител из асцитной жидкости 48
4.2.4. Иммуноферментный анализ (ИФА) 48
4.2.5. Определение продукции перекиси водорода 49
4.2.6. Определение продукции ОН-радикалов 50 4.2.7 Тест на выживание 50
4.2.8. Микроядерный тест 50
4.2.9. Измерение собственной хемилюминесцепции растворов аминокислот и яичного альбумина 51
ЧАСТЬ III. Результаты исследования и их обсуждение 52
Глава 5. Влияние аминокислот на образование АФК в водных растворах in vitro при воздействии ионизирующего излучения и тепла
5.1. Влияние аминокислот на образование АФК в водных растворах in vitro при воздействии ионизирующего излучения 52
5.2. Влияние аминокислот на образование АФК в водных растворах in vitro при тепловом воздействии 58
5.3. Радиозащитные свойства аминокислот 65
5.4. Влияние аминокислот на образование окислительных повреждений (8-оксогуанина) в ДНК под действием рентгеновского излучения 66
Глава 6. Образование долгоживущих радикалов белков и аминокислот при воздействии рентгеновского излучения
6.1. Образование ДЖРБ в растворах яичного альбумина и метионина 70
6.2. Генотоксическос действие ДЖРБ 74
Общее заключение 78
Выводы 84
Список цитируемой литературы
- Роль АФК в развитии окислительного стресса и его биомаркеры
- Способность аминокислот к нейтрализации последствий окислительного стресса
- Очистка моноклональных антител из асцитной жидкости
- Влияние аминокислот на образование АФК в водных растворах in vitro при тепловом воздействии
Введение к работе
Одним из наиболее значимых повреждающих факторов среды действующих на биологические макромолекулы, являются активные формы кислорода (АФК). Такие формы кислорода индуцируются разнообразными физическими, химическими и биологическими факторами: УФ и ионизирующим излучением, присутствием химических мутагенов и канцерогенов, а также естественным и, особенно, нарушенным аэробным клеточным метаболизмом. Недавно было показано, что тепловое воздействие приводит к образованию АФК в водных растворах [Брусков и др., 2002, 2003]. Высокая реакционная способность АФК при определенных условиях делает их чрезвычайно токсичными для биологических систем на всех уровнях организации - молекулярного, клеточного и организменного.
Повышение уровня АФК сверх предела, обусловленного антиоксидантной защитой, приводит биологические системы в состояние "окислительного стресса", которое сопровождается перекисным окислением липидов, мутагенными изменениями ДНК, модификациями белков и приводит к различным патологическим процессам [Зенков и др., 2001]. Повреждающее действие АФК сопровождает развитие многих заболеваний (в том числе нейродегенеративных, воспалительных, инфекционных, аутоиммунных и др.). АФК играют важную роль в процессах старения, мутагенеза, канцерогенеза и тератогенеза [Меньшикова и др., 1994; Cerutti, 1994; Beal, 1995; Beckman, Ames, 1998; Parman et al., 1999; Moskovitz et al., 2002]. С другой стороны, определенный физиологический уровень АФК играет важную регуляторную роль, участвуя в качестве специфических сигнальных молекул (вторичных мессенджеров) в регуляции метаболических процессов, экспрессии генов, работы иммунной, эндокринной и других физиологических систем [Дубинина, 2001; Voeikov, 2001; Гольдштейн, 2002; Droge, 2002].
Во всех живых организмах существуют системы антиокислительной защиты клеток от избыточного уровня АФК, представленные специализированными ферментами и низкомолекулярными антиоксидантами [Зенков и др., 2001]. Однако, антиоксидантные свойства широко распространенных биологических соединений в настоящее время изучены недостаточно. Наприме, лишь недавно установлено, что среди природных рибонуклеозидов гуанозин и инозин обладают ярко выраженными антиоксидантными и радиозащитными свойствами [Gudkov et al., 2006].
Одним из важнейших классов низкомолекулярных органических веществ в биологических системах являются L-аминокислоты. В настоящее время антиоксидантные свойства этих веществ и их роль в физико-химических процессах, сопутствующих
окислительному стрессу в биологических системах остается не совсем ясной. Литературные данные свидетельствуют о способности отдельных аминокислот к снижению повреждающих и патологических эффектов, обусловленных окислительным воздействием различной природы на разных уровнях организации. Например, показана способность L-цитруллина и L-аргинина к элиминации супероксид анион-радикала, что приводит к нормализации работы сердечной мышцы при воздействии окисляющих факторов [Lass et al., 2002; Hayashi et al., 2005]. Установлено, что пролин является эффективным перехватчиком синглетного кислорода и предотвращает клеточную гибель при окислительном стрессе [Chen, Dickman, 2005]. Для гистидина показана способность к перехвату пероксильных радикалов, предотвращению карбоксилирования белков и образования белковых сшивок [Деккер и др., 2000]. Показано, что ряд аминокислот предотвращают образование 8-оксогуанина в ДНК путем защиты гуанина от одноэлектронного окисления до гуанил-радикал-катиона [Milligan et al., 2003]. Эти эффекты предположительно обусловлены физико-химическими свойствами отдельных аминокислот, связанными с их способностью реагировать с АФК. В связи с этим представляется существенным детальное исследование антиоксиданти ых свойств аминокислот и их роли в физико-химических процессах, сопутствующих окислительному стрессу в биологических системах.
В настоящее время получены данные, свидетельствующие о том, что белки являются главной мишенью в клетках при воздействии наиболее реакционной формы АФК -гидроксильных радикалов, более чувствительной, чем ДНК и липиды [Du, Gebicki, 2004]. Методом ЭПР-спектроскопии установлено, что при воздействии ионизирующей радиации в растворах белков и в клетках образуются долгоживущие белковые радикалы с временами полужизни, достигающими 20 и более часов [Koyama et al., 1998]. Долгоживущие белковые радикалы (ДЖРБ) могут являться источниками образования АФК в окружающей водной среде, поддерживая условия длительного протекания окислительного стресса в биологических системах [Ostdal et al., 2002], и служат посредниками в переносе окислительных повреждений на другие клеточные компоненты, включая ДНК [Luxford et al., 1999].
Цель данной работы заключалась в исследовании антиоксидантных свойств свободных L-аминокислот при воздействии ионизирующего излучения и тепла, а также свойств долгоживущих аминокислотных радикалов в составе белков, индуцируемых ионизирующим излучением.
В соответствии с целью были поставлены основные задачи:
1 .исследование антиоксидантных свойств аминокислот в условиях близких к физиологическим для оценки их возможной роли в окислительно-восстановительных процессах в клетках,
2. определение способности отдельных аминокислот быть перехватчиками
гидроксильных радикалов, при воздействии рентгеновского излучения и тепла, для
выявления наиболее повреждаемых остатков аминокислот в белках,
3. исследование возможности защиты ДНК от окислительных повреждений
аминокислотами с наиболее выраженными антиоксидантными свойствами.
4. исследование образования и свойств долгоживущих белковых радикалов под
воздействием рентгеновского излучения in vitro в водных растворах и возможности
повреждения ДНК, индуцированные ДЖРБ.
Роль АФК в развитии окислительного стресса и его биомаркеры
Биологические процессы, проходящие в клетках характеризуются протеканием ряда окислительно-восстановительных реакций, которые проходят в условиях про- и антиоксидантного равновесия, обусловленного множеством веществ, и окислительно-восстановительного гомеостаза. В норме свободные радикалы образуются в безопасных концентрациях и более того играют важную сигнальную роль о состоянии окружающей среды. Дисбаланс окислительно-восстановительного равновесия внутри клетки, вызываемый повышением уровня АФК, может приводить к разнообразным патологическим последствиям. Количество АФК увеличивается при любом патологическом процессе прямо пропорционально тяжести состояния. При заболеваниях и старении живых организмов процесс накопления радикалов увеличивается. Повышенное содержание АФК, обусловленное недостаточностью системы антиоксидантной защиты, приводит к различным повреждениям в биологических структурах [Скальный и Кудрин, 2000; Кольман, 2000]. Подобное состояние, к которому приводит нарушение окислительно-восстановительного гомеостаза и возрастание уровня АФК, называют «окислительным стрессом».
Поскольку окислительный стресс может приводить живые системы к неблагоприятным последствиям, вызывая истощение антиоксидантных систем, деструкцию макромолекул и гибель клеток, необходимо уметь определять степень подверженности организма окислительным воздействиям. С этой целью за последние десятилетия разработан широкий спектр тест-систем, которые позволяют определять развитие окислительного стресса на том или ином уровне. Основой подобных методик является прямое или косвенное определение уровня АФК по содержанию продуктов их взаимодействия с молекулами клетки (техника «отпечатков пальцев») [Shulaev, 2006].
Методы определения АФК
В качестве прямого метода определения АФК используют электронный парамагнитный резонанс (ЭПР)- метод, позволяющий также фиксировать переход одних форм АФК в другие [Jackson et al., 2004]. К сожалению, метод ЭПР обладает низкой чувствительностью, что затрудняет его использование в системах in vivo, где определение чрезвычайно реакционноспособных АФК затруднено разнообразным биохимическим окружением. С целью расширить возможности этого метода используется техника спиновых ловушек, в которой специализированные молекулы-ловушки связываются с АФ.К, образуя намного более стабильное соединение с неспаренным электроном, эффективно регистрируемое ЭПР [Khan et al., 2003]. В настоящее время в связи с прогрессом в области разработки новых ловушек этот метод успешно используется даже для неинвазивного определения очагов АФК в целом живом организме. Подобная методика позволяет в режиме реального времени определять очаги образования АФК в организме животных, позволяя исследовать возможности коррекции окислительного стресса, например, при введении антиоксидантов [Utsumi and Yamada, 2003; Utsumi et al., 2006].
Важным показателем развития окислительного стресса также считается концентрация перекиси водорода в исследуемых системах, поскольку эта относительно стабильная форма АФК тесно связана с остальными формами, являясь их предшественником или продуктом деятельности системы антиоксидантной защиты клетки. Для определения Н2О2 используются разнообразные косвенные оптические методы, которые используют химическую модификацию внедряемого субстрата в ходе пероксидазной реакции. Для определения перекиси разработано множество методик, однако в своей массе они способны лишь зафиксировать общее развитие окислительного стресса, нежели количественно определить конкретную форму АФК [Halliwell and Whitman, 2004]. Перекисное окисление липидов (ПОЛ)
Говоря о технике «отпечатков пальцев» в исследовании окислительного стресса прежде всего необходимо упомянуть о перекисном окислении липидов (ПОЛ), неотъемлемом процессе всех живых систем, который уже длительное время привлекает внимание исследователей. Ненасыщенные альдегиды - один из продуктов перекисного окисления липидов - способны образовывать межмолекулярные ковалентные связи с белками, нуклеиновыми кислотами и инактивировать ферменты [Szweda et al., 1993]. Перекисное окисление липидов проходит при взаимодействии АФК с биологическими хмембранами, вызывая образование перекисей полиненасыщенных жирных кислот, а в итоге- а, р-ненасыщенных диальдегидов, таких как 4-гидроксинонеаль и малоновый диальдегид (МДА) [Hartley et al., 1999]. Эти вторичные альдегидные продукты ПОЛ являются общепринятыми маркерами окислительного стресса [Del et al., 2005]. Интенсивность ПОЛ особенно интенсивно исследуется на растительных объектах с помощью тиобарбитурового теста, в ходе которого продукт реакции МДА с тиобарбитуровой кислотой (ТБА) определяется спектрофотометрически. С помощью этого метода исследовано развитие ПОЛ под действием множества физических факторов - гипоксии, ультрафиолетового и ионизирующих излучений, теплового воздействия и т.п. [Shulaev, 2006]. Однако с ТБА реагируют не только связанные с ПОЛ продукты, поэтому интерпретация результатов подобных исследований требует критического анализа. [Halliwell and Whitman, 2004]. В последнее время наиболее адекватным показателем уровня ПОЛ считается определение изопростанов - специфических продуктов окисления полиненасыщеных жирных кислот: арахидоновой, эйкозапентеновой и докозагексеновой [Roberts & Morrow, 2002; Nourooz-Zadeh et al., 1997]. Повышенный уровень изопростанов наблюдался при многих патологических состояниях млекопитающих, тесно связанных с развитием окислительного стресса [Roberts & Morrow, 2002; Basu, 2004], в том числе повышение их уровня связывают с такими патологиями как диабет, сердечно-легочная недостаточность, болезнь Альцгеймера. Изопростаны активно используются как индикаторы при исследовании влияния пищевых добавок на интенсивность ПОЛ [Halliwell, 2000]. Наиболее точным и информативным методом для определения продуктов ПОЛ на данный момент является масс-спектрометрия - метод, позволяющий определять индивидуальные вторичные продукты ПОЛ до пикомолярных концентраций [Shulaev, 2006].
Способность аминокислот к нейтрализации последствий окислительного стресса
Важную роль в антиоксидантной защите, обеспечивающей стабильность живой системы среди множества окислительных факторов среды, играют пептиды. Они принимают участие в поддержании редокс-гомеостаза, как одного из факторов необходимого для функционирования биологических систем. Среди таких пептидов можно отметить глутатион [Meister and Anderson, 1983], карнозин [Болдырев, 1998], цитомедины и их малые фрагменты [Хавинсон и др., 2002] и другие.
Одними из наиболее изученных и интересных в этом плане низкомолекулярных пептидов являются гистидинсодержащие дипептиды (ГСД). К таковым относятся ацетилкарнозин, гомокарнозин, анзерин и карнозин. Все они содержат остаток гистидина или метилгистидина, соединенный с Р-аланилом или остатком у-аминомасляной кислоты в случае гомокарнозина. Исследование антиоксидантных свойств ГСД показали, что они способны воздействовать на различные стадии процесса ПОЛ - от нейтрализации АФК до взаимодействия с молекулярными продуктами их свободнорадикального окисления [Boldyrev et al., 1988; Kohen et al., 1988]. Карнозин и родственные ему соединения могут служить ловушкой для всех описанных АФК и, по-видимому, эти антиоксидантные свойства ГСД являются определяющими в спектре их биологического действия.
Для карнозина показана способность к защите делящихся клеиок о г хромосомных аббераций, вызываемых гипероксией [Gille et al., 1991] и, что особенно важно, к защите белков от образования карбонильных групп и белковых «сшивок» [McFarland, 1996; Деккер и др., 2000]. Подобные свойства этого дипептида объясняются тем, что его р-аминогруппа намного эффективнее вступает в реакции, изображенные на рис.6 по сравнению с аминогруппой остатка лизина в составе высокомолекулярных белков. Более того, ГСД проявляют синергизм в своем антиоксидантном действии в модельных системах [Болдырев, 1998]. Как медицинский препарат карнозин уже зарекомендовал себя эффективным средством в лечении катаракты и миопии, этиологию которых связывают со свободнорадикальным окислением кристаллинов [Ванг, 2000]. Нужно отметить, что были проведены сравнительные исследования антиоксидантной активности ГСД и непосредственно гистидина [Лейнсоо и др., 2006], которые показали что эффективность гистидина составляла 85-95% значений, полученных для ГСД.
Другим интенсивно исследуемым классом низкомолекулярных биологически активных пептидов являются пептиды эпифиза и их синтетические аналоги. Наиболее интересными в этом классе по проявляемым свойствам являются полученные направленным химическим синтезом пептиды вилон (Lys-Glu) и эпиталон (Ala-Glu-Asp-Gly). Модулирующие свойства этих пептидов исследованы на многих модельных системах, включая стареющих животных, инволюционные тканевые процессы, вызванные старением и ионизирующим излучением, канцерогенез и хромосомные перестройки у трансгенных животных [Хавинсон и др., 2005]. Так, при введении этих пептидов животным, существенно снижается интенсивность ПОЛ и перекисной хемилюмипесценции в сыворотке крови [Синицкая, Хавинсон, 2002], а добавление их в среду развивающихся дрозофилл стимулирует активность их ферментов антиоксидантной защиты и снижает интенсивность ПОЛ на протяжении всей жизни мух [Хавинсон, Мыльников, 2000]. Для вилона показано, что этот пептид эффективно снижает количество хромосомных аббераций как у нормальных, так и животных с ускоренным сіарением, как и эпиталон он повышает активность ядрышкового аппарата экспресии генов [Хавинсон и др., 2005]. Кроме того, для вилона показано, что этот пептид проявляет геропротекторные свойства в радиационных моделях ускоренного старения [Трофимов и др., 2004]. Механизм действия цитомединов окончательно не установлен, однако известно, что они выступают в роли природных антиоксидантов, что имеет большое значение в реализации эндогенных механизмов противоопухолевой защичы и замедления старения организма.
Антиоксидантные свойства и способность к редукции последствий окислительного стресса обнаруживаются для разнообразных пептидов и на различных уровнях организации. Так, например, показана способность к предотвращению паракват-индуцированного окислительного стресса при скармливании крысам соевых пептидов [Takenaka et al., 2002], а также получены доказательства того, что некоторые пептиды способны участвовать в химической репарации повреждений ДНК, вызванных окислительным стрессом [Milligan et. al., 2004]. L-аминокислоты представляют собой один из важнейших классов низкомолекулярных веществ в биологических системах. Они являюіся главными структурными компонентами всех природных пептидов и белков, присутствуют в биологических жидкостях в свободном состоянии. Кроме функции структурных элементов аминокислоты выполняют также и сигнальные функции в виде медиаюров и общеметаболические, участвуя в обмене веществ в качестве доноров и акцепторов химических групп. Наибольшее распространение в живых организмах имеют протеиногенные аминокислоты, то есть 20 аминокислот, кодируемых генетическим кодом, и включаемых в состав белков в процессе трансляции. Эти аминокислоты представлены в Приложении 1. Аминоксилоты в зависимости от химической структуры или полярности могут быть по разному классифицированы. Кроме того, некоторые из перечисленных аминокислот не могут синтезироваться в организме человека и должны поступать вместе с пищей. Такие незаменимые аминокислоты отмечены в таблице.
Многие аминокислоты (глицин, аргинин, лизин, глутамат, гистидин, фенилаланин) используются как лекарственные препараты и биологически активные пищевые добавки. В ряде исследований на модельных системах установлено, что аминокислоты проявляют способность к снижению повреждающих эффектов, обусловленных окислительными воздействиями различной природы на разных уровнях биологической организации. Эти эффекты, предположительно, обусловлены физико-химическими свойствами отдельных аминокислот, и их способностью реагировать с АФК и продуктами их взаимодействия с другими биологическими молекулами.
В настоящее время накапливаются сведения, подтверждающие концепцию о существовании не только независимой пептидной, но и аминокислотной систем регуляции в биологических системах [Анискина и др., 2006]. Так в исследованиях показателей специфической и нсспецифической иммунорезистентности человека показано, что аминокислоты лизин, аргинин, глутаминовая кислота и тришофан обладают различными иммуно- и фагоцитстимулирующими и детоксицирующими свойствами [Белокрылов и др., 1995]. Недавно исследовано влияние всех 20 природных аминокислот, входящих в состав белков, на клеточную пролиферацию и апоптоз в эсплантатах тканей трех типов зародышевых листков [Чалисова, Пеннеяйнен, 2003; Анискина и др., 2006]. Показано, что многие аминокислоты (гистидин, лизин, аргинин, триптофан, метионин, алифатические и дикарбоновые аминокислоты) способны к стимуляции пролиферативной активности и редукции апоптоза, причем подобное влияние носило тканеспецифический характер.
Для свободных аминокислот также показана способность к предотвращению последствий окислительного стресса в биологических системах. Так, например, для аргинина показаны радиопротекторные свойства [Рябченко и др., 2005], способность к снижению интенсивности ПОЛ, деградации ДНК тимуса и увеличению выживаемости стволовых клеток костного мозга при радиационном воздействии. Этот процесс связывают с оксидом азота, сигнальной молекулой, предшественником которой является аргинин [Пулатова и др., 2006]. Для этой аминокислоты также показана способность к предотвращению поражения миокарда крыс, вызванного генерацией супероксид-анион радикала, подобно ишемии-реперфузии [Lass et al., 2002] и развития атеросклероза у кроликов [Hayashi et al., 2005].
Очистка моноклональных антител из асцитной жидкости
Получение и детальная характеристика моноклональных антител (мкАт), специфичных к 8-оксогуанину, описано в работе [Брусков и др., 1996]. Константа аффинности, составляла 1,3x106 М 1 и более чем на 3 порядка величины превышала константы связывания с возможными перекрестными структурными аналогами. Антитела осаждали 2 раза 50% сульфатом аммония, добавляли к асцитной жидкости равный объем (NH iSCj. Центрифугировали при 20 000 g в течение 15 мин. К осадку порциями добавляли 5 мл 0,05 М фосфатного буфера рН 7.4, при эчом тщательно перемешивали раствор стеклянной палочкой, а затем добавляли 5 мл (NH SC и центрифугировали при 20 000 g в течение 15 мин. К осадку добавили 4 мл 0,05М ФСБ рН 7.4, тщательно перемешивали и добавляли 4 мл глицерина. Полученные антитела хранили в морозильной камере при -20С. Концентрация полученных антител, определенная по методу Лоури, была 2,85 10"4 М.
В нашей лаборатории, для количественного определения 8-оксогуанина в ДНК, разработан неконкурентный твердофазный иммуноферментный анализ с использованием моноклональных антител, специфичных к 8-оксогуанину [Брусков и др., 1999].
Облученные образцы ДНК (400 мкг/мл) денатурировали кипячением на водяной бане б мин и охлаждали во льду 20 мин. Аликвоты (40 мкл) наносили на дно лунок иммуноферментных планшет. ДНК иммобилизовали с помощью простой процедуры адсорбции при высушивании в течение 1,5 ч при 80С [Hirayama et al., 1996]. Блокировали неспецифические места адсорбции, используя на каждую лунку планшета 300 мкл блокирующего раствора, содержащего 1% казеина в 0.15 М Трис-HCl буфере, рН 8.5, и 0.15 М NaCl. После этого планшеты инкубировали при 30С в течение 2ч на плпншетном шейкере ST-3 (Elmi, Латвия). Образование комплекса антиген-антитело с антителами (50 мкл/лунку), специфичными к 8-OG (в разведении 1:1000), проводили в блокирующем растворе путем инкубации в течение 2 ч при 37С. Дважды промывали (300 мкл/лунка) раствором 50 мМ Трис-IICl буфер, рН 8.5, и 0.15 М NaCl на шейкере. Затем формировали комплекс с конъюгатом (анти-мышиньгм иммуноглобулином, меченным пероксидазой хрена (1:1000) в блокирующем растворе (50 мкл/лунка), инкубируя 2 ч при 37С. Потом промывали лунки 1 раз с добавлением 1% Тритон Х-100 и 2 раза аналогично тому, как описано выше. Далее добавляли хромогенный субстрат - 18,2 мМ ABTS и перекись водорода (2.6 мМ) в 0.05 М цитратном буфере, рН 4.0 (100 мкл/лунку). По достижении окрашивания, реакцию останавливали добавлением равного объема 1.5 мМ NaN3 в 0.1 М цитратном буфере, рН 4.0. Оптическую плотность образцов измеряли на планшетном фотометре (Titertek Multiscan, Финляндия) при Я.=405 нм.
Для количественного определения перекиси водорода в водных растворах, использовали высокочувствительный метод усиленной хемилюминесценции в системе люминол-/?-йодофенол-пероксидаза хрена. В качестве хемилюминометра использовали жидкостный сцинтилляционный счетчик "Бета-1" (Украина) для измерения Р-излучения, работающий в режиме счета одиночных фотонов (без схемы совпадений). Концентрацию образовавшейся перекиси водорода рассчитывали используя калибровочные графики, для построения которых измеряли интенсивность хемилюминесценции образцов содержащих добавленную перекись водорода известной концентрации. Исходную концентрацию Н2О2 используемую для калибровки определяли спектрофотометрически при длине волны 240 нм с коэффициентом молярного поглощения 43.6 (М 1 х см"1). Прогретые или облученные рентгеном образцы помещали в полипропиленовые флаконы (Beckman, США) и добавляли по 0,1 общего объема "счетного раствора" содержащего: 1сМ Трис-HCl буфер рН 8.5, 50 мкМ /7-йодфенол, 50 мкМ люминол, 10 нМ пероксидазы хрена при определении наномолярных концентраций Н2О2 . Образцы, подвергшиеся воздействию рентгеновского облучения, разводили в 10 раз бидистиллированной водой для снижения концентрации перекиси. "Счетный раствор" готовился непосредственно перед измерением. Чувствительность метода позволяет опеределять Н2О2 в концентрации 1нМ. При определении концентрации Н2О2 использовались значения измерений не менее трех образцов, по которым определяли среднее значение и среднеквадратичное отклонение.
Осуществляли с помощью реакции с кумарин-3-карбоновой кислотой (ККК), продукт гидроксилирования которой - 7-гидроксикумарин-З-карбоновая кислота (7-ОН-ККК) -является удобным флуоресцентным зондом для определения образования этих радикалов [Черников, Брусков, 2002]. В раствор ККК в воде (0.5 мМ, рН 3.6) вносили 0,2 М фосфатного буфера (рН 7.4), далее добавляли аминокислоты (1мМ). Опытные и контрольные образцы подвергали воздействию рентгеновского излучения или прогревали. Флуоресценцию продукта реакции ККК с гидроксильным радикалом - 7-ОН-ККК, измеряли в тех же пробах на спектрофлуориметре SFM 25А (Kontron Instruments, Италия) с ХСх = 400 нм, Хет = 450 нм в кварцевой зеркальной кювете. Калибровку производили с помощью коммерческой 7-ОН-ККК.
Тестировали на выживаемость самцов мышей Kv:SHK массой 28-31 г и возрастом 10 недель. Мышам вводили внутрибрюшинно аминокислоты, растворенные в 0,14 М растворе хлорида натрия. Иньецировали по 0,5 мл на мышь, через 15 мин, после облучения, повышая концентрацию аминокислот в крови в 15 раз. Облучение осуществлялось на рентгеновской установке РУТ-15 (СССР), при комнатной температуре, мощность дозы ІГр/мин. Впоследствии учет погибших животных проводили один раз в сутки. Контролем служила группа мышей инъецированных изотоническим раствором.
Оценивали цитогенетическое повреждение клеток по появлению полихроматофильных эритроцитов (ПХЭ), содержащих микроядра (МЯ). Животных кормили облученным обезжиренным творогом, контроль получал облученную пищу, выдержанную двое суток при 0С. Мышей умерщвляли методом цервикальной дислокации через 28 ч после начала кормления, поскольку максимальный выход ПХЭ с МЯ наблюдается примерно через сутки после воздействия ионизирующей радиации. Гистологические препараты готовили и окрашивали по стандартной методике [Schmid, 1975] с модифицированным
растворением клеточного материала [Uma Devi, Sharma, 1990]. Подсчет ПХЭ содержащих МЯ осуществляли с помощью светового микроскопа "МикМед-2"(ЛОМО, Россия) с иммерсионным объективом при увеличении хЮОО.
Влияние аминокислот на образование АФК в водных растворах in vitro при тепловом воздействии
Известно, что активные формы кислорода образуются в водных растворах под воздействием как ионизирующего излучения [Кудряшов, 2004], так и тепла [Bruskov et al., 2002; Брусков и др., 2003]. Наиболее долгоживущей разновидностью АФК является перекись водорода, которая способна оказывать как повреждающее действие на различные клеточные структуры [Меньшикова идр., 2006] так и играть сигнально-регуляторную роль, связанную с активацией процессов восстановления и апоптоза [Октябрьский и Смирнова, 2007]. Гидроксильные радикалы являются наиболее рсакционноспособиой формой АФК и приводят к окислительным повреждениям биологических макромолекул, таких как белки, ДНК и др.
Полученные нами данные свидетельствуют о том, что свободные аминокислоты способны изменять продукцию перекиси водорода и гидроксильных радикалов в водных растворах при воздействии рентгеновского излучения и тепла, а так же о различном влиянии отдельных аминокислот на образование АФК под воздействием этих факюров. В целом, образование Н2О2 не кореллирует с генерацией гидроксильных радикалов в присутствие различных аминокислот. Кроме того, наблюдаются существенные различия в продукции этих АФК при сравнении воздействий ионизирующего излучения и тепла.
Для интерпретации этих данных надо учитывать взаимодействия аминокислот с разными типами реакционных продуктов, такими как синглетный кислород ( Сь), супероксиданион-радикал (ОУ), гидроксильный радикал (ОН ), гидратированный электрон (е"), радикал атомарного водорода (Н ), гидроперекисный радикал (НОо ) и перекись водорода (Н2О2), генерируемые этими физическими факторами. В присутствии аминокислот в зависимости от их способности реагировать с ОН , Н , НОо" ие в принципе может происходить как уменьшение, так и увеличение концентрации Н2О2 при воздействии облучения.
Согласно литературным данным все аминокислоты способны реагировать своей общей аминокислотной частью с ОН и при этом происходит отрыв атома водорода при а-углеродном атоме с образованием аминокислотного радикала [Braams, 1966]. Наши результаты, свидетельствующие о том, что все аминокислоты уменьшают выход образования гидроксильных радикалов находятся в соответствии с этими данными. Кроме этого, боковые аминокислотные остатки также способны дополнительно реагировать с ОН-радикалом, поэтому наблюдается различное влияние отдельных аминокислот на образование ОН-радикалов. Радикалы аминокислот, образующиеся при реакции их боковых остатков с гидроксил-радикалами, идентифицированы методом электронною парамагнитного резонанса [Rustgi et al., 1977].
По способности реагировать с ОН-радикалом боковые аминокислотные остатки можно разделить на две группы. Первая группа из шести аминокислот (Cys, His, Phe, Met, Trp, Туг), которые наиболее сильно реагируют с ОН-радикалом, уменьшая их продукцию, и вторая группа более слабо реагирующая с этим радикалом (рис. 10).
По данным литературы радиочувствительность аминокислот, определяемая по константам скоростей реакции с ОН радикалом изменяются в порядке их убывания: трипюфан, тирозин, метионин, фенилаланин, гистидин, глутамин [Тимофеев-Ресовский и др., 1981].
По нашим данным аминокислоты, коюрые на 70-80% уменьшают образование ОН-радикалов под воздействием рентгеновского излучения включает группу из 6 аминокислот: Cys His Phe = Met = Trp Туг. Считается, что наиболее чувсівительньїми мишенями при воздействии кислородных радикалов индуцируемых ионизирующим излучением являются ароматические аминокислоты триптофан и тирозин [Stadtman, 1993]. Наши результаты по влиянию триптофана и тирозина на образование ОН радикалов и генерацию Н2Ог соответствуют этим данным. Эти аминокислоты, которые находятся в группе наиболее эффективных перехватчиков ОН радикалов, приводят к наименьшей продукции перекиси водорода, возможно, за счет уменьшения рекомбинации таких радикалов. Гистидин, который под воздействием рентгеновского излучения еще более сильно уменьшал величину образования ОН радикалов, в меньшей степени влиял на выход Н2О2 . В случае метионина и фенилаланина уменьшения продукции НгОт не наблюдалось вовсе. Такое влияние метионина и фенилаланина можно объяснить компенсационным уменьшением образования гидрагированного электрона или увеличением образования гидроперекисных радикалов в присутствии этих аминокислот. Действительно метионин вообще не образует пероксидов, а фенилаланин дает лишь незначительный их выход [Gebicki and Gebicki, 1993].
Константы скоростей для реакции гидратированного электрона с аминокислотами показывают, что наиболее реактивны цистеин и гистидин, в меньшей степени триптофан, тирозин, аргинин, аспарагин и фенилаланин, метионин еще в меньшей степени, а остальные аминокислоты относительно слабо реагируют с ним [Braams, 1966].
Следует отметить, что для гистидина могут наблюдаться разные эффекты его влияния на образование АФК, обусловленные разными значениями рН используемых растворов. Поскольку с увеличением значения рН от 7.0 до 8.0 значительно понижается акцепторная активность гистидина по отношению к гидратированному электрону [Пикаев, 1986].
Среди наиболее частых мест окисления аминокислот в белках отмечают также His, Met, Pro, Arg и Lys [Stadtman, 1993]. Гистидин и метионин входят в группу аминокислот -наиболее эффективных перехватчиков гидроксильных радикалов, тогда как последние три аминокислоты таких свойства не проявляли (рис.10). Если Pro заметно уменьшал образование ЬЬОг, то в случае Arg, Lys и Met такого влияния не было, хотя все эти аминокислоты уменьшали генерацию гидроксильных радикалов. Можно полагать, что в случае Arg, Lys, Met и Pro окисление этих аминокислот идет и по другому пути, не связанному с воздействием гидроксильных радикалов, например, через супероксиданион-радикалы и пероксиды.
Действительно, для аргинина [Lass et al., 2002; Hayashi et al., 2005] и лизина [Gebicki and Gebicki, 1993; Чистяков и др., 2005] характерно их взаимодействие с супероксиданион-радикалами, а имипокислота пролин весьма эффективно образует пероксиды [Gebicki and Gebicki, 1993]. Ранее была исследована способность всех аминокислот к образованию пероксидов под воздействием ОН-радикалов, индуцируемых гамма-излучением. При этом аминокислоты валин, пролин, лейцин, изолейцин, лизин, глутаминовая кислота наиболее эффективно образовывали пероксиды, триптофан, глутамин, аргинин, аланин проявляли среднюю эффективность, а остальные аминокислоты - слабую [Gebicki and Gebicki, 1993].
Увеличение продукции НоОт при облучении серина и треонина в принципе могло бы свидетельствовать об отщеплении гидроксильных групп в боковых остатках этих аминокислот с образованием гидроксильных радикалов, рекомбинация которых приводит к увеличению продукции Н202, однако,у при этом нами не наблюдается увеличения образования ОН-радикалов. Увеличение продукции Н2О2 могло быть обусловлено, если бы эти аминокислоты являлись эффективными акцепторами электронов. Поскольку в случае акцепторов электронов также должно происходить увеличение продукции H2Oi [Пикаев, 1986; Брусков и др., 2003]. Однако такая электрон-акцепторная активность для серина не выявлена [Тимофеев-Ресовский и др., 1981; Braams, 1966]. Нужно учитывать также, что на одной из стадий окисления аминокислот под воздействием ионизирующей радиации в присутствии кислорода при отщеплении гидропероксида выделяется перекись водорода [Stadtman, 1993].
