Содержание к диссертации
Введение
Глава I. Обзор литературы 9
I.I. Бактериальный фотосинтез 9
I.I.I. Общая схема бактериального фотосинтеза 9
I.1.2.Реакционные центры фотосинтезирующих бактерий 12
I.1.3.Первичный акцептор электрона при бактериаль ном фотосинтезе 14
1.1.4.Цитохромы: их функции в бактериальном фотосинтезе 17
1.2.Фотосинтез у высших растений 24
I.2.1.Общая схема фотосинтеза у высших растений.. 24
1.2.2. Строение и функции фотосистемы I 26
1.2.3. Строение и функции фотосистемы 2 28
1.2.4. Локализация фотосинтетического аппарата в клетке 29
1.3. Методы измерения мембранного потенциала на мембранах фотосинтезирующих объектов . 33
1.3.1. Объекты исследований 34
1.3.2. Спектральные методы измерений 36
1.3.3. Потенциометрические методы измерений 41
Глава 2. Материалы и методы исследований 45
2.1. Выделение хроматофоров 45
2.2. Выделение и встраивание реакционных центров-из RJaodopseudomonas spJaaeroidas в мембрану протеолипосом 45.
2.3. Выделение субхлоропластных фрагментов 46
2 2. Ассоциация белково-липидных везикул с искусственной фосфолипидной мембраной 47
2.5. Измерение быстрой кинетики генерации в системе "белково-липидные везикулы - искусственная фосфолипидная мембрана" 48
2.6. Регистрация кинетики светозависимых спектральных изменений в препаратах хроматофоров 49
2.7. Окислительно-восстановительное титрование 52
2.8. Измерение концентрации фенадинметосульфата 52
2.9. Источники света 52
2.10.Реактиви 57
Глава 3. Результаты и обсуждение 58
3.1. Исследование быстрой кинетики генерации мембранного потенциала реакционными центрами фотосинте-зирующей бактерии Rps. spaeroides 58
3.2. Исследование быстрой кинетики образования разности потенциалов фотосинтезирующими бактериями Chr. minutissimum u Ect. shaposiinikovii.
3. 2.1. Исследование кинетики нарастания и спада хроматофоров 72
3.2.2. Окислительно-восстановительное титрование , возникающей на мембранах хроматофоров 75
3.2.3. Сопоставление кинетических и потенциометричес-ких характеристик генерации Д^с характеристиками электротранспортных процессов у бактерий Слг. minutissimum u Ect. snaposianikovii. 80
3.3.1. Исследование фотоэлектрической активности легкой фракции субхяоропластных фрагментов... 93
3.3.2. Исследование фотоэлектрической активности тяжелой фракции субхлороплаотных фрагментов.. 103
ВЫВОДЫ 109
СПИСОК ЛИТЕРАТУРЫ III
- Общая схема бактериального фотосинтеза
- Ассоциация белково-липидных везикул с искусственной фосфолипидной мембраной
- Исследование быстрой кинетики генерации мембранного потенциала реакционными центрами фотосинте-зирующей бактерии Rps. spaeroides
Введение к работе
Актуальность проблемы. Согласно хемиосмотической гипотезе Митчелла (ІЗІД32І , в последнее время получившей всеобщее признание и многочисленные экспериментальные подтверждения, генерация трансмембранной разности электрических потенциалов(Д"цг)является важнейшим этапом в процессе преобразования химической и световой энергии в универсальный энергетический эквивалент клетки - молекулу АЇФ.
Кроме того, электрическая энергия в виде аг-р на сопрягающих мембранах может непосредственно использоваться для совершения осмотической,механической и др.видов работ в клетке.
Велика роль мембранного потенциала также в регуляции биохимических процессов, протекающих в мембранах.
В связи с этим, большой интерес представляет изучение закономерностей генерации д"ьк , природы этих процессов, их кинетических и термодинамических характеристик.
В последнее время, с появлением соответствующих технических возможностей у нас в стране и за рубежом особенно интенсивно ведется исследование быстрых стадий образования разности электрических потенциалов на мембранах фотосинтезирующих объектов. Однако методы, применяемые для определения трансмембранной Д^К являются по большей части косвенными, (регистрация каротиноидного сдвига, использование красителей - индикаторовДЦ* идрН }, и, зачастую, интерпретация получаемых ответов вызывает определенные трудности.
Используемая нами методика прямого измерения Д'Ф в сочетании со спектральными методами позволяет идентифицировать отдельные переносчики электрона, вносящие вклад в процесс генерации ЛН-*" при фотосинтетическом транспорте электронов и определить кинетические и термодинамические параметры этих процессов, что представляет несомненный научный интерес.
Цель и задачи исследований. Целью настоящего исследования явилось систематическое изучение быстрых стадий генерации Л"^ на мембранах фотосинтезирующих объектов как растительного, так и бактериального происхождения, а также исследование электрогенной активности изолированных светопреобразующих пигментбелковых комплексов в модельной системе.
Были поставлены следующие задачи: І) в связи с тем, что регистрация Аїр на мембранах высших растений не проводилась прямым методом с высоким временным разрешением, была сделана попытка выбрать подходящий для этой цели объект, подобрать условия для измерения Д^и исследовать особенности быстрых стадий генерации на мембранах высших растений; 2) исследовать влияние ингибиторов электронного транспорта на процесс генерации Лif, а также выяснить роль двух фотосистем в этом процессе; 3) на объектах бактериального происхождения - хроматофорах фотосинтезирующих объектов Ectotiornodospira snaposimikovii И Ciiromatium. minutissimum, -исследовать влияние редокс-медиаторов на кинетику генерируемой д-ф- , определить среднеточечные потенциалы.отдельных переносчиков электрона путем потенциометрического титрования амплитуды фотоэлектрических ответов и выяснить роль низкопотенциальных и высокопотенциальных цитохромов в процессе генерации A\[f ; 4) изучить работу изолированного реакционного центра в модельной системе и показать, что первичный процесс генерациийЦЇ происходит именно в реакционном центре.
Научная новизна работы. В результате проведенных нами экспе- риментов впервые удалось зарегистрировать прямым методом и с высоким временным разрешением генерацию трансмембранного электрического потенциала на субхлоропластных фрагментах высших растений и исследовать влияние окислительно-восстановительных условий и ингибиторов электронного транспорта на этот процесс.
Проведенное на хроматофорах фотосинтезирующих бактерий исследование роли цитохромов в процессе генерации Д Y позволило предложить модель расположения переносчиков электронтранспорт-ной цепи бактерий и уточнить расстояние между ними и локализацию переносчиков в мембране.
В модельной системе впервые прямым методом продемонстрирована фотоэлектрическая активность изолированного реакционного центра, выделенного из фотосинтезирующих бактерий. Rnodopseu-domonas spnaeroides Изучено влияние редокс-медиаторов и ингибиторов электронного транспорта в модельной системе на процесс первичного разделения зарядов в реакционном центре.
Совокупность полученных данных позволила сделать вывод об общности механизмов первичной генерации UXjS в фотосинтезе высших растений и бактерий.
Практическое значение работы. Результаты исследований генерации трансмембранного потенциала на мембранах фотосинтезирующих объектов углубляют существующие представления о молекулярных механизмах, происходящих при фотосинтезе процессов.
Перспективность применения принципов аккумулирования солнечной энергии живыми организмами делает подобные исследования необходимым этапом в создании искусственных систем, способных к высокоэффективному использованию солнечной энергии для практических нужд.
Общая схема бактериального фотосинтеза
В последние годы ведется интенсивное изучение механизмов бактериального фотосинтеза. Эти исследования позволяют понять сущность процессов фотосинтеза у высших растений, хотя различия в строении фотосинтетического аппарата бактерий и высших растений велики. При освещении зеленых растений происходит выделение кислорода, в отличие от бактерий, у которых кислород либо препятствует росту, либо угнетает синтез бактериального хлорофилла. Другая существенная особенность бактериального фотосинтеза - наличие только одной световой реакции.
Экзогенными донорами электронов при бактериальном фотосинтезе служат восстановленные органические субстраты. У серных фотосинтезирующих бактерийCnlorobiaceae и Cnromatiaceae -это сероводород и тиосульфат, а у несерных бактерий Riiodospi-rillaceae - яблочная и янтарная кислоты. Кроме того, фотосинтезирующие бактерии различаются по природе пигментов, входящих в состав светособирающей антенны, передающей возбуждение на реакционный центр. Ciiromatiaceae и Rhodospirillaceae -так называемые пурпурные фотосинтезирующие бактерии - содержат в светособирающей антенне бактериохлорофиллы айв, в то время как Cnlorobiaceae - зеленые фотосинтезирующие бактерии - особый вид хлорофилла, называемый хлоробиум-хлорофиллом, более близкий по своим спектральным свойствам к хлорофиллу высших растений I4l
Внутриклеточные органеллы, ответственные за процесс фотосинтеза, называются хроматофорами. Они представляют собой впадины внутренней бактериальной мембраны, глубоко вдающиеся в цитоплазму и на определенной стадии роста у некоторых видов бактерий отделяющиеся от мембраны [87]. В процессе выделения из клеток методом ультразвуковой обработки, хроматофоры образуют замкнутые пузырьки, имеющие в диаметре от 300 А у рода Curomatium до 1000 А у рода Rnodospirillum , что примерно в 100 раз меньше тилакоидов высших растений.
Хроматофоры представляют собой, таким образом, самые малые мембранные образования, способные к фотосинтезу. В белково-ли-пидную мембрану хроматофоров "встроены" компоненты электронно-транспортной цепи (ЭТЦ) бактерий, а также светособирающая антенна. В мембране одного хроматофора содержится примерно 20 ЭТЦ и около 5000 молекул Бхл ГіІ} .
Ассоциация белково-липидных везикул с искусственной фосфолипидной мембраной
В качестве искусственной фосфолипидной мембраны использовали коллодиевую пленку, пропитанную раствором азолектина из соевых бобов в н-декане. Для приготовления коллодиевой пленки 0,03 мл 1% раствора нитроцеллюлозы в изоамилацетате наносили на водную поверхность. Через несколько минут образовавшуюся на поверхности воды пленку коллодия снимали с помощью кольца, вырезанного из сынпорового фильтра с диаметром пор 0,17 мкм. Пленка сохла на воздухе в течение 1-2 часов. Высохшую пленку смачивали раствором азолектина в концентрации 100 мг/мл, помещали на отверстие диаметром 4 мм в разборной тефлоновой кювете и зажимали между двумя отсеками кюветы. После этого в оба отсека добавляли 4 мл среды инкубации и в один из отсеков -суспензию исследуемых белково-липидных везикул.
Ассоциация везикул с искусственной фосфолипидной мембраной достигалась добавлением в каждый отсек 25 мМ МпО или 20 мМ СаСІ и инкубацией в течение 5- 12 часов при постоянном и интенсивном перемешивании магнитными мешалками. Затем производилась замена среды в обоих отсеках с помощью перистальтического насоса.
Исследование быстрой кинетики генерации мембранного потенциала реакционными центрами фотосинте-зирующей бактерии Rps. spaeroides
Светозависимый перенос электронов в мембранах фотосинтези-рующих бактерий приводит к образованию трансмембранной разности электрических потенциалов [60 ] . Как было показано [72 ] , функцию фотоэлектрического генератора в хроматофорах несерных пурпурных бактерий выполняют комплексы реакционных центров Р870. Быстрая кинетика генерации и спада АЦ была исследована на хроматофорах, выделенных из различных видов фотосинтезирую-щих бактерий [8, 22) .В последнее время в ряде лабораторий были сделаны попытки изучить генерацию реакционными центрами в бислойных мембранах [167 ] . Однако фотоэлектрические ответы в такой системе были весьма незначительны по амплитуде и регистрировались только в присутствии доноров и акцепторов электронов, добавляемых по разные стороны бислойной мембраны. Кроме того, в этих работах не содержалось доказательств истинного встраивания реакционных центров в бислой и не было проведено исследования быстрой кинетики процессов образования и спада светозависимой Д1+ Метод прямой регистрации быстрой кинетики генерации Д "4 впервые применен нами для исследования фотоэлектрической активности протеолипосом, содержащих реакционные центры из бактерий Rps. spJaaeroides.
