Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 6
1.1. Липидные модели клеточных мембран. 6
1.2. Распределение потенциала на границах липидных мембран. 8
1.3. Диффузная компонента граничного потенциала. Модель Гуи-Чепмена . 10
1.4. Дипольная компонента граничного потенциала. Молекулярная природа и способы регистрации. 14
1.5. Адсорбция ионов и ионизация полярных групп фосфолипидов. 17
1.5.1. Метод независимого определения параметров связывания. 19
1.6. Влияние неорганических ионов на упаковку и фазовое состояние липидов в бислое. 20
1.7. Механохимические свойства мембран. 24
1.8. Заряженные макромолекулы на поверхности мембран. 25
1.8.1. Синтетические поликатионы и их биомедицинские приложения . 25
1.8.2. Распределение поля в слое полимера - теоретические модели и экспериментальные возможности. 27
Цель и задачи исследования 29
ГЛАВА 2. Материалы и методы 31
2.1. Материалы и методы формирования липидных мембран. 31
2.2. Электрокинетический метод измерения подвижности липосом. 33
2.3. Метод регистрации граничного потенциала (метод КВП). 34
2.3.1. Перфузия растворов. 38
2.3.2. Регистрация потенциалов при изменении рН. 40
2.4. Метод измерения модуля изгиба мембран гигантских липосом. 40
ГЛАВА 3. Одновалентные катионы 42
3.1. Граничный и поверхностный потенциалы мембран при изменении рН в растворах КС1, LiCl и TMACI. 42
3.2. Измерение граничного потенциала при «дифференциальной» постановке эксперимента . 46
3.3. Определение параметров связывания ионов лития. 49
ГЛАВА 4. Упругость изгиба заряженных мембран 51
4.1. Граничный и поверхностный потенциалы мембран в присутствии сахарозы. 51
4.2. Модуль изгиба. Эксперимент и теория. 55
ГЛАВА 5. Синтетические полимеры 59
5.1. Мембраноактивные свойства синтетических поликатионов. 59
5.2. Адсорбция и десорбция на липидных мембранах
олигомеров и полимеров на основе лизина. 65
5.2.1. Адсорбция монолизина. 66
5.2.2. Пентализин: кинетика адсорбции и влияние на дипольный потенциал. 69
5.2.3. Полилизины на поверхности липосом: влияние состава, заряда мембран и ионной силы раствора. 72
Заключение 81
Основные результаты и выводы 81
Публикации автора по теме диссертации
- Диффузная компонента граничного потенциала. Модель Гуи-Чепмена
- Синтетические поликатионы и их биомедицинские приложения
- Метод регистрации граничного потенциала (метод КВП).
- Измерение граничного потенциала при «дифференциальной» постановке эксперимента
Введение к работе
Транспортные явления и функционирование мембранных белков в значительной мере зависят от наличия зарядов на поверхности мембраны и в ее окрестности. Распределение электрического поля в этой области и его участие в работе белков, контролирующих энергетические и транспортные процессы, является предметом биофизических исследований. Разработка липидных моделей разной сложности и методов их изучения ведется во многих лабораториях достаточно давно, однако это направление исследований остается по-прежнему актуальным как с теоретических позиций, так и для различных биомедицинских приложений.
Одна из важнейших задач, которая может быть решена с использованием модельного подхода, состоит в регистрации структурных изменений в липидной части клеточных мембран, которые инициированы адсорбцией ионизованных молекул различной природы, и которые существенным образом влияют на функционирование мембранных белков. В литературе уже известен ряд фактов, когда состояние упаковки липидов вокруг белков в присутствии многовалентных катионов влияет на конформационную подвижность, например, механочувствительных каналов разного типа [Ermakov,Y.A.et al. (2001); Sukharev,S. (1999)]. Представляет определенный интерес уточнить, может ли присутствие одновалентных неорганических катионов или малых органических молекул приводить к похожим изменениям структуры липидного бислоя, индикатором которых, согласно предыдущим исследованиям, служит изменение дипольной компоненты граничного потенциала. А поскольку адсорбция ионов регулирует не только состояние ионизации липидов, но и межмолекулярные взаимодействия в бислое, все эти явления должны отражаться на термодинамических и механохимических характеристиках мембран.
С другой стороны, многие фармакологически важные препараты имеют макромолекулярную природу, и их связывание с клеточными мембранами может вызвать значительные изменения в упаковке липидов в бислое вплоть
до образования в нем необратимых дефектов [Demina,T.et al. (2005b)]. Есть основание полагать, что разрыв клеточных мембран при адсорбции некоторых синтетических полимеров с выраженным цитотоксическим действием, является следствием таких процессов в липидном матриксе. В любом случае, адсорбция на мембранах является первой и необходимой стадией мембранотропного эффекта подобных полимеров. Хорошо известно также, что синтетические поликатионы способны вызвать значительные изменения в латеральном распределении фосфолипидов в мембране. Поэтому одной из актуальных задач для развития биомедицинских приложений подобных полимеров является оценка эффективности их адсорбции на поверхности и способности менять свойства липидного матрикса. Влияние таких полимеров на поведение грамицидиновых каналов, встроенных в плоские БЛМ, является удобной модельной системой для изучения биологически важных следствий структурных изменений в липидом бислое.
В литературе нет достаточно подробных сведений о влиянии размеров заряженных макромолекул на распределение электростатического потенциала на границе модельных и клеточных мембран с водным окружением. Систематическое исследование этого вопроса возможно с использованием синтетических полипептидов с разной длиной молекулярной цепи, каждое из звеньев которой представляет собой аминокислоту лизин, а ее длина варьируется в широких пределах и регламентируется паспортом производителя. Выбор полилизинов для исследования обусловлен их широким использованием в биомедицинской практике при формировании различного рода наногранул в комбинации с отрицательно заряженными макромолекулами и ДНК. Однако более важным мотивом для их изучения является тот факт, что на основе полилизинов синтезируются многие препараты, обладающие иммуноактивными свойствами и имеющие определенные перспективы при лечении раковых заболеваний. В основе биологической активности подобных препаратов лежит их адсорбция на поверхности клеточных мембран и участие в транспортных процессах.
Диффузная компонента граничного потенциала. Модель Гуи-Чепмена
Падение потенциала в диффузной части двойного электрического слоя определяется обычно электрокинетическими измерениями в суспензии липосом. Этот метод дает возможность измерить величину потенциала в плоскости скольжения на некотором удалении от поверхности липосом в глубине электролита. Эта плоскость условно показана на рис. 1.2 пунктиром. Экспериментальных методов для регистрации потенциала непосредственно на поверхности не существует. Поэтому для вычисления поверхностного потенциала по данным электрокинетических измерений необходимо учитывать распределение потенциала в диффузной части двойного электрического слоя вблизи заряженной поверхности. Для этого в данной работе была использована модель Гуи-Чепмена, предложенная еще в начале прошлого века в работах Гуи [Gouy,M. (1910)] и Чепмена [Chapman,D.L. (1913)]. Несмотря на свою простоту, данная теория хорошо описывает экспериментальные данные, полученные методом электрофореза для случаев неорганических ионов [ЕрмаковДО.А. (2000); Cevc,G. (1990)].
Диффузная часть двойного электрического слоя представляет собой ионы электролита, концентрация которых вблизи заряженной поверхности отличается от объемной и определяется локальным значением электрического потенциала и тепловым движением ионов. В рамках модели Гуи-Чепмена предполагается, что заряд самой поверхности, которую для простоты можно считать плоской, непрерывным образом распределен (размазан) по поверхности, а равный ему и противоположный по знаку заряд содержится в диффузной части двойного электрического слоя. Диэлектрические свойства водного раствора считаются неизменными вплоть до самой заряженной плоскости, а ионы отождествляются с точечными зарядами. Эти предположения значительно упрощают расчеты и одновременно вызывают большие возражения своими неправдоподобными значениями параметров. Но, несмотря на это, предсказания теории удивительно хорошо согласуются с данными экспериментов, в том числе и с результатами микроэлектрофоретических. измерений на липосомах [Ермаков,Ю.А. (2000); Cevc,G. (1990)].
В рамках теории Гуи-Чепмена учитываются два типа зарядов: заряды, фиксированные на самой поверхности и заряды, распределенные вблизи этой поверхности, которые составляют диффузную часть двойного электрического слоя, и локальная концентрация которых удовлетворяет соотношению Больцмана: Ci(X) = Ci,bulk exp(-eZiP(x)/fcr) (1.1) где Cj(buik - концентрация в объеме раствора ионов валентности z\, р(х) потенциал на расстоянии х от границы раздела, е - заряд электрона, к — константа Больцмана, Т — температура в Кельвинах.
Распределение электрического потенциала, р(х), вблизи заряженной поверхности описывается дифференциальным уравнением Пуассона-Больцмана, которое учитывает диэлектрические характеристики среды, єєо, состав электролита, С{(х), и плотность заряда, а(х), в области, где отсутствует электронейтральность: "Иг = сг(х) = z іеС І (х) (1.2)
Аналитические решения данного уравнения приводятся во многих монографиях и учебниках по физической и коллоидной химии (см., например, [Дерягин,Б.В.е1 al. (1987); Щукин,Е.Д.е1 al. (1992)]). В простейшем случае симметричного электролита, когда валентность и концентрация анионов и катионов в объеме раствора одинаковая аналитическое решение уравнения Пуассона-Больцмана можно представить в виде: Pl 2kT или rs = V8kT ocbuik sinh( — -) (1 3) 2кТ as ps = — arcsinh( ) (L4) здесь cps— поверхностный потенциал на мембране.
При выводе этих формул поверхностная плотность заряда, as, считалась параметром, величина которого не зависит от состава раствора, т.е. рассматривается случай индифферентного электролита. В общем случае растворы содержат смесь ионов различной валентности и зависимость поверхностного потенциала от состава раствора при фиксированной поверхностной плотности заряда (т.е. без учета их адсорбции) может быть выражена только в неявной форме соотношением Грэма [Grahame,D.C. (1947)]: crs2 = 2kT 0]Г [с. bulk Qxp(-zi(ps/kT)-\] (15) Эта формула позволяет учитывать экранирование поверхностного заряда электролитами произвольного состава.
В случае симметричных электролитов (например, растворы КС1, LiCl, ТМАС1) модель Гуи-Чепмена допускает аналитическое решение уравнения Пуассона-Больцмана (1.2), которое приводит к выражению для распределения потенциала (р(х) вблизи заряженной поверхности в достаточно простой форме [Hunter,RJ. (1981); McLaughlin,S. (1989)]: J , ( eZQ)(x)\ ( \ , fez CO Л tanh — = exp (- юс jtanh — - { 4kT J FV {4kT J (1.6) 2e2c где K - J 7ZT обратная дебаевская длина экранирования. В экранирование поверхностного заряда наибольший вклад вносят противоионы, концентрация которых вблизи заряженной поверхности намного выше, чем в объеме раствора. Формула (1.6) в некоторых случаях может быть использована и для более сложных смешанных электролитов. В этом случае, z, принимается равной валентности противоионов с максимальной валентностью, а вместо концентрации электролита используется ионная сила раствора: 1 = 0.52 ci,buikzi (1 j) При расчете поверхностного потенциала, ф3, по формуле (1.6) мы учитывали, что ф(хо)= и вносили поправку на положение плоскости скольжения.
Для экспериментальной оценки величины дзета-потенциала использовали уравнение Смолуховского [Hunter,RJ. (1981); Щукин,Е.Д.е1 al. (1992)]: здесь ju - экспериментально определяемая электрофоретическая подвижность липосом, которая связана с величиной электрического потенциала - С,, вязкостью - 77, и диэлектрическими свойствами раствора. Электрофоретическая подвижность коллоидных частиц в обычных экспериментальных условиях пропорциональна величине электрического потенциала в плоскости, которая называется плоскостью скольжения и расположена на некотором расстоянии, х0, от поверхности (см. рис. 1.2). В пределах диффузной части двойного электрического слоя имеется повышенная концентрация противоионов, которые перемещаются вдоль поверхности электрическим полем и увлекают за собой жидкость. Однако, на расстояниях, меньше хо жидкость в результате адгезии остается неподвижной относительно поверхности, и только в плоскости скольжения начинается перемещение жидкости относительно поверхности (или заряженной частицы в неподвижной жидкости). Строгий теоретический анализ показывает, что электрофоретическая подвижность даже сильно заряженной частицы, потенциал которой составляет 100-150 мВ, не зависит от ее размеров, формы и суммарного заряда до тех пор, пока эти размеры (и кривизна поверхности) существенно превышают дебаевскую длину экранирования (0.1-10 нм в обычных растворах). Положение плоскости скольжения в общем случае не известно, поэтому для потенциала, определяемого по электрофоретической подвижности частиц, был введен специальный термин — дзета-потенциал (Q. Однако в случае достаточно «гладких» липидных мембран положение этой плоскости было установлено на основании экспериментальных данных [Eisenberg,M.et al. (1979); Ermakov,Yu.A. (1990); McLaughlin,S. (1989)] и принимается равным 0.2 нм.
Синтетические поликатионы и их биомедицинские приложения
Изучение адсорбции соединений с большой молекулярной массой на поверхности клеточных и липидных мембран представляет несомненный практический и научный интерес, по крайней мере уже потому, что высокомолекулярными являются большинство природных и синтетических лекарственных препаратов. Биологические и медицинские аспекты проблемы взаимодействия водорастворимых полимеров, в большинстве случаев полиэлектролитов, с мембранами весьма многообразны. Например, синтез иммунологически активных соединений, сочетающих в себе важные терапевтические свойства, должен учитывать минимальные нарушения барьерных свойств клеточных мембран и возможность их эффективного удаления из организма [IIeTpoB,P.B.et al. (1988)]. Весьма существенно и влияние полимеров на устойчивость суспензий клеток, субклеточных частиц и липосом, т.е. имеют место типичные проблемы устойчивости коллоидных систем [Дерягин,Б.В.е1 al. (1987); Щукин,Е.Д.еі al. (1992)].
Широкий класс полимеров представляет интерес в медицинской практике в качестве дезинфицирующих средств. В частности, сравнительно недавно были синтезированы полимеры ряда полидиаллиламмониевых солей (ПДАА) - высокая биоцидная активность которых была доказаны экспериментами на культуре клеток E.Coli [Тимофеева,Л.М.е1 al. (2005)]. Полимеры, синтезированные на основе полилизина и полиэтиленоксида, представляют интерес в качестве перспективных противораковых препаратов [Demina,T.et al. (2005с); Krylova,O.O.et al. (2005)]. И в том и в другом случае первичной «мишенью» являются клеточные мембраны. Исследования на искусственных липидных мембранах дают возможность проверить вероятные механизмы их биологического действия, сравнить различные варианты состава и структуры макромолекул, и выбрать те из них, которые обладают максимальным фармакологическим эффектом. Нам удалось внести свой вклад в это благородное дело в сотрудничестве с лабораториями, синтезирующими эти полимерные препараты. Целенаправленный синтез полимеров биомедицинского назначения подразумевает использование детальных сведений о механизме их взаимодействия с клеточными мембранами. Достаточно очевидно, что мембраноактивные свойства, кинетика адсорбции и встраивания таких полимеров в биомембраны зависят не только от химической структуры и конформации макромолекул, но и от липидного состава мембран и, прежде всего, от наличия заряженных групп в полярной головке фосфолипидов. Поскольку большой класс биологически значимых полимеров является поликатионами, а клеточные мембраны содержат отрицательно заряженные компоненты, особый интерес представляет изучение электростатических эффектов.
Эксперименты по адсорбции поликатионов поли-4-винил-К-этилпиридиния бромида (ПВЭПБ), поли-4винил-ТЧ-цетилиридиния (ПВЦПБ), а также четвертичной аммонийной соли поликонидина, [Февралева,И.С al. (1986)] показали, что одна из наиболее характерных особенностей полимеров заключается в их практически необратимом связывании с поверхностью. Последовательное повышение концентрации исследуемого вещества с одной стороны БЛМ приводило уже при микромолярных концентрациях к изменению потенциала, которое быстро достигало предельного значения 100-150 мВ [Ермаков,Ю.А. (1990)]. При этом зависимость потенциала от концентрации полимера оказывалась столь крутой, что практически не поддавалась экспериментальному определению.
Важной особенностью взаимодействия поликатионов с липидными мембранами является их способность «собирать» в кластеры липиды, имеющие отрицательно заряженные группы. Это явление, было изучено в работе [Ярославов,А.А.е1 al. (1996)] методом ДСК. Методом флуоресцентной микроскопии в работе [Denisov,G.et al. (1998)] было показано, что на мембране, состоящей из фосфатидилхолина и фосфатидилсерина, при адсорбции пентализина также формируются домены, обогащенные фосфатидилсерином. Образование доменов на поверхности липидных мембран при адсорбции крупных молекул полилизинов было доказано несколькими методами совсем недавно в работе [Schwieger,C.et al. (2007)]. Однако в цитированных здесь работах практически ничего неизвестно о влиянии этих сложных структур на распределение электрического поля в мембране и ее окрестности. В данной работе такое исследование проведено нами на синтетических полипептидах с разной длиной молекулярной цепи, каждое из звеньев которой представляет собой аминокислоту лизин, несущую в обычных условиях положительный заряд.
Количественное описание взаимодействия полиэлектролитов с заряженной поверхностью ставит ряд трудноразрешимых теоретических и экспериментальных задач. Ценность электрокинетических методов существенно зависит от того, насколько удается связать электрофоретическую подвижность частиц с величиной потенциала и плотностью заряда на их поверхности. Понятно, что из-за существования объемного фиксированного заряда распределение электрического поля в достаточно протяженном слое полимера, подобном гликокаликсу клеточных мембран, должно существенно отличаться от случая электрического двойного слоя в модели ГЧШ. Определенные выводы о характере распределения поля в слое полимера, адсорбированного или жестко связанного с поверхностью, можно сделать, решая задачу о поведении электролита вблизи поверхности с фиксированными поверхностным и объемным зарядами. Количественное описание таких систем разрабатывается уже давно (см., например, [Levine,S.et al. (1983)] [Voigt,A.et al. (1989)]) и в настоящее время получило развитие благодаря применению современных вычислительных средств.
Метод регистрации граничного потенциала (метод КВП).
Для исследования кинетики десорбции применяли непрерывную замену раствора в одном из отсеков ячейки (перфузию). Для этого в cis- отсек экспериментальной ячейки помещали трубки для подачи и выведения перфузируемого раствора. Перфузия проводилась с использованием специально оборудованного двухканального перистальтического насоса (Microperpex 2132), а скорости подачи и выведения жидкости были отрегулированы таким образом, чтобы минимизировать изменение объема водного раствора в отсеке (2 мл) при постоянной и заданной скорости протока (обычно около 1 мл/мин). При большом объеме жидкости, пропускаемом через ячейку, даже небольшое различие скорости подачи и выведения жидкости может привести к изменению уровня жидкости в ячейке. Для уменьшения этого эффекта в cis-отсек ячейки была помещена трубка, связывающая отсек с дополнительным буферным сосудом (рис. 2.3, 9), площадь которого много больше площади ячейки. Таким образом, изменение уровня жидкости в резервуаре и отсеке намного замедлялось (см. рис.2.3). В начале опыта обычно контролировали симметричность распределения граничного потенциала на БЛМ (мембрана, сформированная в симметричных условиях имеет разность граничных потенциалов 0 мВ).
Перфузия фоновым раствором, как правило, обнаруживает некоторое изменение потенциала (не более 10 мВ). Эти изменения позволяют экспериментально зафиксировать характерное время перфузии ячейки. Прямое измерение этой величины было проведено при введении и «отмывании» растворов КС1, превышающих фоновую концентрацию [EpMaKOB,K).A.et al. (1993)]. В этой работе была получена эмпирическая формула для расчета концентрации электролита при перфузии: С = СХ+{С0-СХ) ехр(- V/V0) (2.7) где Со - первоначальное значение концентрации, Сі.- новое значение концентрации, V0 - объем ячейки, а V - объем раствора концентрации Сь пропущенного через отсек в ходе перфузии. При типичной скорости потока раствора 1 мл/мин и объеме ячейки 2 мл стократное изменение концентрации достигалось уже через 10-15 минут перфузии. Подробности методики перфузии описаны в [EpMaKOB,K).A.et al. (1993); Ермаков,Ю.А.е1 al. (2002)].
Изменение рН при регистрации -потенциала на липосомах осуществлялось дискретными добавками кислоты или щелочи. Величина рН суспензии липосом регистрировалась рН-метром фирмы VWR модель 2000 pH/Temp Meter (США), комбинированным рН-электродом. Измерения рН осуществлялись до и после измерения « -потенциала, при этом расхождение рН было не более, чем на 0.2 единицы.
При измерении граничного потенциала методом КВП значение рН варьировали дискретными добавками небольших количеств кислот и щелочей в cis-отсек экспериментальной ячейки. Величину рН измеряли параллельно, в отдельном сосуде, для этого туда добавляли соответствующие количества фонового электролита и кислоты или щелочи.
Метод определения модуля изгиба при всасывании гигантских липосом в микропипетку был впервые предложен в работе И.Ивенса [Evans,E.et al. (1990)] и широко используется различными исследователями. Суть метода состоит в том, что микропипетка размером около 1 мкм касается стенки однослойной липосомы, размер которой должен быть существенно больше диаметра пипетки (см. рис. 2.4).
Зная диаметры липосомы, Rv и пипетки, Rp, нетрудно рассчитать натяжение мембраны, у, по закону Лапласа при заданной разнице давлений в среде и пипетке Ар: _ ЬрЯДр
Если затем понижать давление в пипетке, (например, понижая гидростатическое давление по цепочке сообщающихся сосудов), то часть мембраны всасывается в пипетку и образует небольшой выступ. Длина этого выступа, L, увеличивается по мере понижения гидростатического давления, однако на первом этапе всасывания размер липосомы практически не меняется. Это происходит потому, что в пипетку втягиваются «лишние» участки мембраны, которые ранее образовывали свободно флуктуирующие изгибы поверхности липосомы. Проникновение этих участков в пипетку сопровождается понижением флуктуации формы и устранением изгибов поверхности. Это происходит в диапазоне сравнительно небольших давлений (при натяжении мембраны 0.5 дин/см).
Согласно теории, разработанной И.Ивенсом, этот диапазон характеризуется логарифмической зависимостью длины L от натяжения у. При повышении давления, когда «лишняя» поверхность липосомы убрана в пипетку, дальнейшее всасывание и увеличение длины L сопровождается растяжением самой мембраны, которое требует значительно больших усилий. В этом случае зависимость L(y) становится линейной. Эти закономерности хорошо согласуются с экспериментальными данными и могут быть представлены в общем виде формулой:
Измерение граничного потенциала при «дифференциальной» постановке эксперимента
Изучение адсорбции на поверхности клеточных и липидных мембран соединений с большой молекулярной массой представляет практический интерес уже потому, что высокомолекулярными являются большинство природных и синтетических лекарственных препаратов. В литературе описано много синтетических высокомолекулярных веществ, обладающих фармакологическими свойствами. Некоторые из них уже исследовались в лаборатории биоэлектрохимии с применением электрокинетического метода и методов, применимых к плоским БЛМ, в том числе и КВП [EpMaKOB,IO.A.et al. (1985); ЕрмаковДО.А. (1990а)].
Противораковые препараты на основе полилизина.
Биологические и медицинские аспекты проблемы взаимодействия водорастворимых полимеров, в большинстве случаев полиэлектролитов, с мембранами весьма многообразны. При разработке фармакологических полимерных препаратов возникает целый ряд вопросов, ответы на которые могут дать эксперименты с модельными системами. Прежде всего требуется уточнить, насколько взаимодействие этих препаратов с клеточными мембранами нарушает их проницаемость для ионов. Еще важнее (и сложнее) установить, могут ли они нарушать структуру липидного матрикса и тем самым влиять на функционирование мембранных белков. В совместном исследовании с кафедрой полимеров Химического факультета МГУ, в нашу задачу входило изучение особенностей адсорбции полимеров, образованных положительно заряженной цепью полилизина и нейтральными боковыми группами разной молекулярной массы. Из предыдущих исследований было известно, что эти поликатионы, которые синтезируются в качестве противораковых препаратов, не разрушают липидные мембраны, хотя и вносят существенные изменения в их структуру [Erukova,V.Y.et al. (2000); Kozlova,N.O.et al. (2001)]. Отрицательный заряд мембран был задан присутствием либо молекул кардиолипина, либо синтетическим полипептидным аналогом мембранных белков, грамицидином, формирующим ионные каналы. Функционирование этих каналов в модельных мембранах хорошо изучено и во многом зависит от латерального взаимодействия пептидов между собой [Koeppe,R.E.et al. (1992); Rokltskaya,T.I.et al. (2002)]. Проводимость мембран и ее изменение при внешних воздействиях, например при освещении фоточувствительного аналога грамицидина модифицированного О-пиромилитином, связана с процессом образования и распада димеров полипептида. Взаимодействие поликатионов с такими пептидами в известном смысле моделирует их влияние на транспортные системы и белки в естественных клетках. В частности, ранее было показано, что каналы грамицидина при освещении распадаются и проводимость мембраны падает, тогда как присутствие полилизина существенно замедляет распад димеров грамицидина [Antonenko,Y.N.et al. (2002)]. Адсорбированный на поверхности поликатион организует кластеры грамицидина и тем самым стабилизирует проводимость мембраны. Предполагалось, и экспериментально было показано в совместном исследовании [Pashkovskaya,A.A.et al. (2006)], что наличие нейтральных групп в полимере нарушает такую стабилизацию и способствует распаду димеров при освещении. В контексте данной работы было интересно проследить, как при этом меняется характер адсорбции поликатионов и в какой мере он зависит от природы поверхностного заряда.
Изучение влияния боковых нейтральных групп полимера на характер адсорбции и проводимость грамицидиновых каналов являлось предметом наших совместных исследований. Образцы представляли собой полимеры, синтезированные на основе полилизина (PLL) с незаряженными боковыми цепями полиэтиленоксида (ПЭО) с молекулярной массой 4 кД (PLL-РЕО4000) и 20 кД (PLL-PEO20000).
Адсорбция изучалась на липосомах, отрицательный заряд которых определялся присутствием кардиолипина (20% CL) (рис. 5.1.а) или встроенными молекулами О-пиромилитин грамицидина (OPg ) (рис. 5.1.6). Во всех случаях было обнаружено изменение знака заряда липосом, причем положение точки нулевого заряда оставалось примерно одинаковым в шкале, отражающей отношение концентрации заряженных звеньев поликатиона к полной концентрации отрицательно заряженных групп кардиолипина в суспензии липосом. Однако, присутствие у адсорбированного полимера нейтральных цепей ПЭО, существенно снижало его способность влиять на латеральное взаимодействие ионных каналов грамицидина. Наиболее вероятно, группы ПЭО препятствуют латеральному разделению заряженных и нейтральных компонент в мембране и образованию кластеров, возникающих при адсорбции крупных молекул полилизина.
Поликатионы с цитотоксическим действием. Взаимодействие крупных поликатионов с мембранами и мембранными белками не только влияет на биохимические процессы. Во многих случаях их адсорбция сопровождается образованием дефектов и разрушением мембран. Это обстоятельство значительно осложняет их исследование на модельных мембранах, особенно на плоских БЛМ. В этих случаях приходится ограничиваться электрокинетическими измерениями. Для таких полимеров сравнить данные, полученные двумя методами регистрации электрических потенциалов, используемыми в нашей работе, практически невозможно. Это относится, прежде всего, к полимерам на основе диалилламинов (ПДАА), которые обладают сильным цитотоксическим эффектом [Тимофеева,Л.М.е1 al. (2005)]. Изучение адсорбции таких полимеров на липосомах, проведенное в данной работе, можно рассматривать как первый шаг к пониманию их биологической активности.
Для изучения морфологической картины адсорбции полимеров на стенках липосом, мы приготовили липосомы из кардиолипина и фосфатидилхолина для электронной микроскопии. Концентрация полимера, добавлялась такая, при которой на заряженных мембранах достигается плато электрокинетической подвижности. На мембранах из фосфатидилхолидина не было обнаружено признаков присутствия полимера вблизи поверхности. На рис. 5.2 (снимки полученные методом электронной микроскопии) изображены отрицательно заряженные липосомы, приготовленные нами из кардиолипина в фоновом растворе (0.01 М КС1), до и после введения в суспензию полимера Р-50 вплоть до насыщения. Насыщение регистрировалось методом микроэлектрофореза (см. рис.5.3).
