Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
Глава 2. Материал и методы исследования 37
Глава 3. Материалы собственных исследований 51
3.1 Биохимические и гематологические показатели крови у спортсменов после тренировки
3.2 Биохимические и гематологические показатели крови у спортсменов на финише полумарафонского забега
3.3 Биохимические и гематологические показатели крови у спортсменов на финише марафона и через сутки после марафонского забега 63
3.4 Изменение осмотической резистентности популяции эритроцитов при разных функциональных состояниях спортсменов 68
3.5 Изучение роли пассивных ионных каналов в регуляции осмотической стойкости клеток 71
3.6 Влияние; мембранных белков и связанных с ними сиаловых кислот на процессы адсорбции макромолекул на эритроцитарных мембранах
Глава 4. Обсуждение результатов 77
Выводы 99
Литература 100
- Биохимические и гематологические показатели крови у спортсменов после тренировки
- Биохимические и гематологические показатели крови у спортсменов на финише полумарафонского забега
- Биохимические и гематологические показатели крови у спортсменов на финише марафона и через сутки после марафонского забега
- Изменение осмотической резистентности популяции эритроцитов при разных функциональных состояниях спортсменов
Введение к работе
Среди множества актуальных вопросов современной биологии и медицины микроциркуляция занимает одно из ведущих мест. Повышенный интерес к изучению различных аспектов этой проблемы не случаен, поскольку определяется той фундаментальной ролью, которую играют процессы транспорта и обмена биологических жидкостей и растворенных в них веществ для жизнедеятельности организма [86, 301].
В области микроциркуляторного русла реализуются все основные функции сердечно-сосудистой системы. Состояние микроциркуляции во многом определяет функциональные возможности сердечно-сосудистой системы, а, следовательно, и физическую работоспособность организма [71].
В настоящее время имеет место пристальный интерес ученых к процессам адаптации системы кровообращения и реологии крови при занятиях спортом [31, 32, 33, ПО, 111]. Изучение приспособления организма к мышечным нагрузкам является удобной моделью для понимания адаптации в целом, помогает выявить потенциальные резервы различных органов и систем, устойчивость объективных критериев адаптивности организма и наметить пути управления данным процессом.
Систематические физические нагрузки разной интенсивности и длительности вызывают изменения, касающиеся как состояния сосудистой системы, так и самой крови [30, 31, 32, 136, 163].
В области микроциркуляторного русла реология крови определяется двумя основными процессами - агрегацией и деформацией клеточных элементов [64]. На данный момент существуют две модели агрегации эритроцитов (мостиковая модель и модель истощения) [40, 189, 224, 268, 269, 289, 317]. В обоих случаях процесс образования агрегатов связывают с наличием или отсутствием на поверхности мембран эритроцитов адсорбирован-
ных белков. Согласно мостиковой модели высокомолекулярные белки плазмы, такие как фибриноген и макроглобулины, обеспечивают образование молекулярных мостиков между клетками, способствуя преодолению сил электростатического отталкивания между клетками [86, 320]. В то же время, низкомолекулярные белки, не перекрывающие критическое расстояние взаимного отталкивания, адсорбируясь на мембранах, препятствуют агрегации красных клеток крови. Адсорбция белков на поверхности клеток в свою очередь приводит к изменению вязко-эластических свойств мембран и, следовательно, оказывает непосредственное влияние на деформируемость клеток [276].
Помимо плазменных белков большое влияние на процессы агрегации оказывает состояние клеточного фактора [64, 275, 276]. При циркуляции в сосудистой системе клетки подвергаются различным воздействиям и, поэтому, с возрастом у эритроцитов происходят изменения в биохимическом составе, структуре мембран и гликокаликса, электроповерхностных свойств и др.
Повышенное агрегатообразование ведет к возникновению нарушений периферического кровотока и тем самым оказывает отрицательное влияние на тканевой метаболизм. С другой стороны, у спортсменов в состоянии относительного покоя выявлено снижение агрегационной способности, что является приспособительной реакцией к мышечным нагрузкам [239].
Анализ данных литературы показал, что, несмотря на важность данных процессов, до сих пор нет точного представления о том, какие структурные субстраты на поверхности клетки ответственны за адсорбцию биополимеров, а, следовательно, и за агрегацию эритроцитов.
Вопрос о взаимодействии плазменных макромолекул с мембранами эритроцитов представляет значительный интерес. Образованная мембранами наружная поверхность клеток представляет собой универсальный
многоточечный гетерофункциональный сорбент. Полярные «головки» ли-пидов, образующие внешнюю поверхность двойного липидного слоя, содержат анионогенные и катионогенные группировки, а также группировки, способные образовывать водородные связи. Если рассматривать адсорбцию на поверхности липидного бислоя, то она не будет ограничена количеством мест адсорбции, что, в свою очередь, противоречит конкурентному характеру адсорбции биополимеров [118].
Участки макромолекулярных соединений могут сорбироваться на выступающих мембранных белках, которые составляют заметную долю от общей поверхности мембраны эритроцита. В структуру клеточных мембран входят и углеводы, несущие ионизируемые группировки, которые потенциально также могут быть центрами адсорбции.
Таким образом, исследование структур, ответственных за адсорбцию полимеров, позволит уточнить представления о процессах агрегации эритроцитов.
Цель исследования
Целью данной работы было изучение факторов, влияющих на процессы адсорбции белков плазмы на поверхности красных клеток крови у спортсменов при мышечных нагрузках.
Задачи:
Исследовать адсорбцию высокомолекулярных белков плазмы на эритроцитах у спортсменов в различных функциональных состояниях.
Выявить влияние концентраций отдельных фракций белков плазмы на процессы адсорбции.
Изучить влияние возрастного спектра популяции эритроцитов на процессы адсорбции
4. Исследовать влияние сиаловых кислот, связанных с белковыми структурами, на процессы адсорбции макромолекул на эритроцитарных мембранах.
Научная новизна исследования
Впервые с использованием метода импедансной спектроскопии исследовано изменение адсорбционных свойств эритроцитарных мембран у спортсменов при разных функциональных состояниях организма. Выявлены закономерные изменения степени адсорбции высокомолекулярных белков плазмы на эритроцитах при выполнении мышечных нагрузок различной продолжительности в диапазоне от 60 до 180 минут.
Изучено влияние концентрации отдельных фракций белков плазмы на степень их адсорбции на клеточных мембранах.
В модельных экспериментах со встраиванием грамицидиновых ионных каналов показана важная роль ионных каналов в мембранах эритроцитов в обеспечении их осмотической стойкости.
Выявлено ;влияние сиаловых кислот связанных с мембранными белками эритроцитов на степень адсорбции белков плазмы.
Показана важная роль состояния структурных компонентов мембраны в детерминации процесса адсорбции высокомолекулярных белков плазмы на эритроцитах.
Теоретическая и практическая значимость работы
Полученные в процессе исследования данные позволяют расширить имеющееся представление о факторах, обеспечивающих адсорбцию биополимеров на клеточных мембранах. В свою очередь, соотношение между адсорбирующимися высоко- и низкомолекулярными фракциями белков влияет на агрегационную способность красных клеток крови.
Выявленное снижение показателя адсорбции при выполнении экстремальных нагрузок позволяет определять переносимость тренировочных нагрузок при воспитании выносливости.
Результаты работы могут быть использованы для оценки функционального состояния спортсменов и соответствующей корректировки тренировочных планов, а в медицинской практике для коррекции агрегацион-ной активности эритроцитов.
Материалы диссертации могут быть использованы для преподавания частных разделов физиологии, таких как система крови и система кровообращения, при написании соответствующих учебников и руководств. Полученные материалы и примененные методы исследования могут быть использованы для проведения дальнейших исследований в гемореологии.
Основные положения, выносимые на защиту:
Качественные характеристики процесса адсорбции макромолекул на эритроцитарных мембранах определяются концентрационными соотношениями белков плазмы.
У спортсменов при выполнении больших нагрузок дополнительным фактором, детерминирующим адсорбцию, является изменение возрастного спектра эритроцитов и обусловленное им наличие сиаловых кислот, связанных с мембранными белками.
Биохимические и гематологические показатели крови у спортсменов после тренировки
Тренировки привели к повышению показателя адсорбции, который даже через сутки был на 23,6% выше, чем в состоянии покоя, а также к заметным изменениям, как общей концентрации, так и фракционного состава белков плазмы. Результаты измерений представлены в таблице 3.
При данном варианте исследований мы получали кровь сразу после финиша, т. е. отсутствовал период отдыха. Выраженность изменений изучаемых параметров оказалась существенно ярче. Результаты измерений представлены в таблице 5.
На финише полумарафонского забега зарегистрировано повышение коэффициента адсорбции на 28,2%, а также выраженное возрастание как общей концентрации белков на 12,3%, так и отдельных фракций: альбуминов на 8,8%, а2 - глобулинов на 24,1%, /5 - глобулинов на 24,7% и фибриногена на 12% .
Установлено значительное повышение осмолярности плазмы на финише полумарафона, как следствие потери воды с дыханием. Результаты представлены в таблице 6. Таблица 5 Коэффициент адсорбции, общая концентрация и фракционный состав бел ков плазмы у спортсменов на финише полумарафона
На финише марафона отмечается повышение общей концентрации белков на 7,2%, а2- глобулинов на 12,7%, /3- глобулинов на 9,4%, 7- глобулинов на 30%, а также снижение концентрации альбуминов на 7,5% и фибриногена на 24%.
Через сутки после марафона сохранялась повышенной концентрация 7-глобулинов на 17,6% и в то же время снижалась концентрация /3-глобулинов на 14,6%. Содержание фибриногена через сутки после марафонского забега возвращалось к величинам аналогичным состоянию относительного покоя.
Экстремальная нагрузка в виде 50 км гонки приводила к снижению показателя адсорбции непосредственно на финише на 39% и к его возрастанию через 18-20 часов отдыха на 48%. Результаты измерений представлены в таблицах 7 и 8.
Период отдыха продолжительностью около 20 часов после марафона приводил к значительному повышению показателя адсорбции по сравнению с состоянием как покоя, так и на финише марафона. Концентрации фибриногена возвращалась к величинам отмеченным в состоянии относительного покоя. При этом общая концентрация белков и концентрации высокомолекулярных фракций белков 0 и /3 - глобулинов понижались, достигая величин характерных для состояния покоя. Таким образом, мы зарегистрировали разнонаправленную динамику концентрации фибриногена и других фракций глобулинов. Статистически значимых изменений в концентрации эритроцитов в крови и гематокритного показателя в период отдыха нами отмечено не было. При этом концентрация гемоглобина в крови оказалась значимо ниже.
Гематокритный показатель 0,416±0,034 0,423±0,053 Осмолярность плазмы, мосм/л 300±4 295±10 Таким образом, физическая нагрузка разной интенсивности и временной продолжительности по-разному влияла как на концентрационные соотношения белковых фракций в плазме крови, так и на показатель адсорбции белков плазмы на эритроцитах. Величина показателя адсорбции после любой из обследованных нами нагрузок, имея разнонаправленную динамику, статистически значимо отличалась от состояния относительного покоя.
Нами зарегистрировано однонаправленное изменение в концентрациях высокомолекулярных белков плазмы, а так же показателя адсорбции после тренировки и на финише полумарафона. На финише марафона при повышении концентрации высокомолекулярных фракций и снижении концентрации фибриногена зарегистрировано снижение степени адсорбции на мембранах эритроцитов на 38,6% по сравнению с состоянием покоя. Однако, при практически равных концентрациях фибриногена в состоянии покоя и через 20 часов периода восстановления после марафона, показатель адсорбции в последнем случае был на 48,2 % выше. Очевидно, что величина показателя адсорбции в данном случае не может определяется только фракционным составом белков плазмы.
Адсорбция белковых молекул на поверхности эритроцитов согласно мостиковой модели агрегации определяет взаимодействие между красными клетками крови. В литературе приводятся данные о важной роли изменений поверхности эритроцитов с возрастом в детерминации агрегацион-ных взаимодействий, а, следовательно, и процесса адсорбции. В нашем исследовании мы зафиксировали изменение содержания красных клеток в крови. Длительные и интенсивные нагрузки приводили к понижению количества эритроцитов в единице объёма, а так же понижению концентрации гемоглобина и величины гематокритного показателя. При наличии периода отдыха 18-20 часов указанные параметры возвращались к исходному уровню.
Изменения указанных параметров красной крови могут косвенно свидетельствовать об интенсивном разрушении эритроцитов при нагрузках, и соответственно о стимуляции эритропоэза. Представленная в литературе несбалансированность этих процессов, как правило, приводит к изменению соотношения между возрастными фракциями эритрона. Исследование возрастного спектра циркулирующих эритроцитов было проведено в специальной серии исследований по данным осмотической резистентности эритроцитов. Способность этих клеток противостоять осмотическим воздействиям снижается с возрастом и может характеризовать возраст эритроцитов. 3.4 Изменение осмотической резистентности популяции эритроцитов при разных функциональных состояниях спортсменов
Изменения возрастного состава эритроцитов у лыжников было изучено на ограниченной группе из 4 человек, обследование которых было выполнено на протяжении года в состоянии покоя, после объемной тренировочной нагрузки и через сутки после 50 км гонки. Наличие периода отдыха после указанных нагрузок позволяет предполагать выход достаточного количества «молодых» эритроцитов в циркуляторное русло и соответствующие изменения возрастного спектра красных клеток крови.
Биохимические и гематологические показатели крови у спортсменов на финише полумарафонского забега
Достоверные различия зафиксированы по количеству низко- и высокостойких клеток у спортсменов после соревнований (р = 0,015 и р = 0,023, соответственно) и после длительных тренировок (р = 0,018 и р = 0,028, соответственно) по отношению к состоянию покоя (без длительных тренировок). Содержание среднестойких форм тслеток в исследуемых состояниях статистически достоверно не различалось.
Резистентность клеток к внешним воздействиям определяется параметрами цитоплазматической мембраны, цитоскелета, липидным составом мембраны и т.д. В зависимости от вида воздействия ведущими могут быть отдельные факторы. Поскольку осмотические воздействия предполагают наличие разницы концентраций ионов снаружи и внутри клетки, можно предполагать, что количество ионтранспортных структур в мембране будет влиять на способность клетки противостоять гемолизу. Для выяснения данного влияния была выполнена серия модельных экспериментов с образцами крови, подвергавшимися осмотическому гемолизу при ступенчатом снижении осмолярности.
Для изучения роли пассивного транспорта ионов через цитоплазма-тическую мембрану мы провели эксперименты на четырех образцах крови полученных от спортсменов в состоянии относительного покоя и, следовательно, не имеющих каких-либо изменений в возрастном спектре эритроцитов. Дополнительные ионные каналы в мембранах эритроцитов формировали с использованием грамицидина С, формирующего неселективные ионные каналы. При сравнительно малых ступенях изменения осмолярности наружной среды эритроциты с дополнительными ионными каналами практически не разрушались.
При участии ионных каналов в поддержании целостности эритроцитов при гипоосмотических воздействиях важным фактором является разность концентраций ионов внутри клетки и в суспензионной среде. Используемое нами в предыдущих измерениях снижение осмолярности было достаточным, чтобы при наличии грамицидиновых каналов обеспечивать выведение ионов из клеток при снижении осмолярности и, тем самым, прекращение потока воды внутрь клеток.
На следующем этапе мы проверили эффективность функционирова-ниия грамицидиновых каналов при достаточно резком изменении осмолярности суспензионной среды. К 2 мл суспензии клеток с осмолярностью 300 мосм/л добавляли 5 мл дистиллированной воды. Поскольку масса поступающей в клетки воды под действием сил осмоса была значительно выше, наблюдалось разрушение даже клеток с дополнительно сформированными грамицидиновыми каналами. При использовании эритроцитов, инкубированных в растворе грамицидина С с пониженной концентрацией также наблюдалось более интенсивное разрушение клеток. Результаты представлены в таблице 19.
Эти результаты позволяют рассматривать изменения осмотической резистентности эритроцитов с позиций содержания в их мембранах белковых структур, образующих пассивные ионные каналы. В соответствии с данными литературы содержание ионных каналов с возрастом снижается, вследствии фрагментации мембран. 3.6 Влияние мембранных белков и связанных с ними сиаловых кислот на процессы адсорбции макромолекул на эритроцитарных мембранах
В литературе указывается, что адсорбция к наружной поверхности клетки может осуществляться либо к мембранным белкам, либо к фосфо-липидам. Однако конкурентный характер адсорбции [118] белков плазмы свидетельствует о наличии ограниченного числа мест адсорбции. Количество молекул фосфолипидов значительно превышает количество молекул мембранных белков. Исходя из этого, мы предположили, что местом адсорбции для белков плазмы являются белковые структуры на наружной поверхности мембраны. Для выявления структурных компонентов клеточных мембран, ответственных за адсорбцию белков плазмы, мы провели исследования на суспензиях клеток (п=27), подвергнутых ферментативной обработке, в результате которой молекулы мембранных белков подвергаются частичному протеолизу. В работе мы использовали трипсин, который имеется в плазме крови и принимает участие в регуляции активности клеток in vivo [26].
Обработка эритроцитов протеолитическими ферментами позволяет разрывать связи в молекулах мембранных белков и, таким образом, может увеличивать число заряженных группировок на поверхности, поскольку при протеолизе каждой пептидной связи на поверхности мембраны может появляться одна или две заряженные аминокислотные группировки. Данные группировки оказывают влияние на измерение импеданса. Результаты измерений импеданса суспензий клеток после отмывки и после обработки трипсином представлены в таблице 20.
Ресуспендирование отмытых фосфатным буферным раствором клеток в собственной плазме с последующим приготовлением концентрированных суспензий приводит к восстановлению импеданса и вязкости этих суспензий до величин аналогичных зафиксированным у суспензий нативных клеток, поскольку плазменные белки вновь будут адсорбироваться на мембранах клеток. В данном случае результаты измерения вязкости концентрированных суспензий так же свидетельствуют о реадсорбции плазменных белков на поверхности эритроцитов.
Биохимические и гематологические показатели крови у спортсменов на финише марафона и через сутки после марафонского забега
На наружной поверхности клеток имеется значительное количество углеводов, связанных с мембранными структурами. Одним из представителей таких углеводов является сиаловая кислота, формирующая отрицательный поверхностный заряд эритроцитов. Молекулы сиаловой кислоты могут быть связаны как с фосфолипидами, так и с белками мембраны. При действии трипсина на гликопротеины с поверхности мембран удалялась часть сиаловых кислот, которые оказывались непосредственно связанными с мембранными белковыми молекулами. Согласно данным литературны таким образом можно удалить с поверхности эритроцитов около 50 % сиаловых кислот [252, 254]. Проведённая нами серия измерений (п=17) действительно позволила выявить удаление сиаловых кислот с поверхности эритроцитов при обработке трипсином, а так же позволила выявить взаимосвязь количества удаляемых сиаловых кислот с коэффициентом адсорбции (таблица 24).
Вопрос о взаимодействии плазменных макромолекул с мембранами эритроцитов представляет значительный интерес с нескольких точек зрения - это и транспорт различных веществ на поверхности клеток, и процессы взаимодействия между эритроцитами посредством адсорбированных макромолекул. Образованная цитоплазматической мембраной поверхность клеток представляет собой универсальный многоточечный гетерофункцио-нальный сорбент. Полярные «головки» липидов, образующие внешнюю поверхность двойного липидного слоя, содержат анионогенные и катионо-генные группировки, а также группировки, способные образовывать водородные связи. Макромолекулярные соединения могут сорбироваться также на мембранных белках выступающих за плоскость липидного бислоя, которые составляют значительную часть от общей поверхности цитоплазматической мембраны.
Адсорбцию высокомолекулярных биополимеров мы исследовали методом импедансной спектроскопии. При проведении измерений импеданса образца электролита результат определяется геометрическими размерами образца и его удельной электропроводностью. Величина импеданса тесно связана с расстоянием между электродами и площадью поперечного сечения проводящей среды. Оба параметра заданы конструкцией камеры и при измерениях на электролитах остаются неизменными. Однако при измерениях на суспензиях непроводящих включений в электролите площадь поперечного сечения будет определяться еще и объемной долей непроводящих включений.
При измерениях на образцах крови величина импеданса определяется проводимостью среды (плазмы) и величиной гематокритного показателя. Поскольку электропроводность плазмы намного выше таковой клеточных элементов, то при измерениях на образцах крови, то есть при больших объемах проводящей среды, импеданс определяется проводимостью самой плазмы. Для того чтобы выявить влияние белков, адсорбированных на клеточных мембранах, мы использовали высококонцентрированные суспензии с величиной гематокритного показателя, измеренного центрифугированием, 0,98-0,99. При оценке гематокритного показателя суспензий методом разведения красителя и по электропроводности он находился в диапазоне 0,920-0,930 для нативных клеток и 0,930-0,940 для клеток, трижды отмытых в фосфатном буферном растворе. В данном случае существенное влияние на электропроводность оказывают биополимеры, адсорбированные на поверхности и группировки, имеющие заряд и значительно выступающие за плоскость липидного бислоя. Расстояния между клетками при такой плотной упаковке незначительно превышают размеры крупных молекул белков плазмы, и их влияние на проводимость межклеточной среды становится достаточным для регистрации.
В области используемых нами частот белковые молекулы не участвуют в проведении переменного электрического тока. Об этом свидетельствуют результаты измерений импеданса растворов альбумина с разной концентрацией. Величина импеданса была прямопропорциональна концентрации раствора белка (рис. 1).
Молекулы белка образуются главным образом из одной или более полипептидных цепочек, которые состоят из аминокислотных остатков. В растворах амино- и карбоксильные группы, не участвующие в образовании пептидной связи, способны к ионизации с образованием заряженных группировок. Вокруг заряженной группы формируется гидратная оболочка из полярных молекул воды, которые связаны с заряженной группой электростатическими силами. Такая гидратная оболочка вокруг заряда существенно уменьшает объем свободного растворителя. В связи с этим, объем электролита, способного проводить электрический ток, значительно уменьшается и импеданс образца возрастает.
Динамика показателя адсорбции у спортсменов в разных состояниях. Мышечные нагрузки с достаточно высокой интенсивностью и продолжительностью первоначально приводили к повышению показателя адсорбции, регистрирующего в наших измерениях адсорбцию высокомолекулярных биополимеров. Данный показатель возрастал как после тяжелой тренировки на 23,6% (р=0,049), так и на финише полумарафона на 28,2% (р=0,038). Повышенный показатель адсорбции на 48,2% (р=0,002) мы регистрировали и на следующий день после 50 км лыжной гонки. Однако непосредственно на финише этой гонки величина показателя адсорбции оказалась на 38,6% ниже по сравнению с состоянием относительного покоя (р 0,001).
Изменение осмотической резистентности популяции эритроцитов при разных функциональных состояниях спортсменов
Причиной разрушения эритроцитов при осмотическом гемолизе является массированное поступление воды в клетки, обусловленное разностью концентраций ионов между внутренней и наружной средой. В литературе, как правило, рассматриваются механизмы изменений гемолитической стойкости, связанные с поступлением воды внутрь клетки. Это может быть как повреждение липидного бислоя, так и белкового составляющего мембраны. Повышение осмотической резистентности эритрона в целом обусловлено изменениями в возрастном составе [171]. При помещении клеток в гипоосмолярную среду разница концентраций ионов будет вызывать не только поступление воды внутрь клеток, но и выход ионов из клетки путем пассивного транспорта. Именно выход ионов из клетки и понижение их концентрации будет важным фактором, ограничивающим поступление воды в клетку. С этих позиций может быть объяснима более высокая стойкость молодых форм клеток по отношению к более зрелым.
Процесс фрагментации эритроцитов при нахождении в системе циркуляции приводит к изменению соотношения между площадью поверхности клетки и её объёмом. Снижение площади поверхности при фрагментации осуществляется более интенсивно по сравнению с объёмом. В свою очередь, уменьшение такого соотношения должно приводить к ограничению скорости суммарного транспорта через мембрану и, следовательно, к снижению скорости выравнивания концентраций ионов между внутренним содержимым клетки и наружной средой. Очевидно, что повышение скорости массированного выхода ионов из клетки будет приводить к меньшему поступлению воды и соответственно к более высокой осмотической стойкости. Проверка этого положения выполнена нами путем изменения количества пассивных канальных структур мембран эритроцитов с применением грамицидина. Данный низкомолекулярный полипептид может встраиваться в мембрану клетки и повышать проницаемость последней для неорганических катионов за счет формирования не селективных ионных каналов мембраны [42]. Подтверждением данного положения можно считать результаты измерений осмотической стойкости клеток, обработанных раствором грамицидина.
Необходимо отметить, что в условиях резкого изменения осмолярности среды количество ионных каналов, ответственных за транспорт ионов через мембрану, также будет влиять на осмотическую стойкость клеток. Подобные изменения наблюдались на образцах эритроцитов, обработанных растворами грамицидина с разной концентрацией. Повышение концентрации грамицидина приводило к увеличению количества ионных каналов в мембранах клеток, а, следовательно, и к повышению их стойкости при понижении тоничности окружающего раствора.
На основании этих результатов можно утверждать, что одним из важнейших факторов, определяющих осмотическую стойкость клеток, является наличие в их мембранах достаточного количества пассивных ион-транспортных систем.
Изменения в качественном составе эритрона при различных функциональных состояниях сопровождается изменением и структурного состава мембран эритроцитов. Эти изменения затрагивают содержание белковых ионтраспортных молекул. В свою очередь именно белковые молекулы, входящие в структуру мембраны эритроцита, могут быть местом адсорбции макромолекул. Эта их способность обусловлена наличием аминокислот имеющих радикальные заряженные группировки. Наличие таких группировок и изменения их числа будут определять количественную характеристику адсорбции. С целью изучения структурных элементов, отвечающих за процессы адсорбции, были проведены измерения на суспензиях клеток предварительно обработанных протеолитическим ферментом.
Причины такого увеличения импеданса, на наш взгляд, могут быть связаны с тем, что трипсин, разрушая пептидные связи, образованные карбоксильной группой лизина и аргинина, приводит к увеличению количества точечных зарядов на поверхности красных клеток крови, а, следовательно, и к повышению количества молекул воды, связанной с заряженными группами электростатическими силами.
Проверка влияния трипсина на молекулы белка в применяемых нами условиях выполнена путем добавления его в раствор альбумина. При измерениях импеданса растворов альбумина с одинаковой концентрацией, но в разной растворяющей среде (с трипсином и без него), мы не зарегистри 92
ровали достоверных различий. Однако по результатам фотоэлектроколо-риметрии выяснилось, что количество белка в растворе с трипсином было ниже на 3,1%, чем в растворе белка той же концентрации, но приготовленном в фосфатном буфере без трипсина.
Биуретовая реакция является качественной реакцией на наличие пептидных связей в белковых макромолекулах. При этом, чем больше пептидных связей, тем интенсивнее окраска раствора. При действии же трипсина количество пептидных связей уменьшается, что мы и регистрировали как снижение оптической плотности при колориметрии. При этом общая концентрация белка в растворе остается неизменной, поэтому мы не зафиксировали динамики импеданса на растворах белка с одинаковой концентрацией, но в разной растворяющей среде. Выявить влияние увеличившегося количества концевых аминокислотных карбокси- и аминогрупп примененный метод не мог вследствие малой концентрации молекул. Однако при увеличении концентрации белковых молекул, имеющих значительно больший объём, чем гидратная оболочка вокруг заряженной группировки, регистрируется выраженное повышение импеданса (таблица 23).
Обработка суспензии эритроцитов трипсином должна приводить к увеличению количества концевых карбокси- и аминогрупп вследствие протеолиза мембранных белков. Влияние таких группировок на процесс адсорбции должно проявляться увеличением числа адсорбированных молекул. Изменения формы клеток, способных свидетельствовать о повреждении мембраны после обработки трипсином при биомикроскопии клеток мы не выявили.
Результаты измерений на суспензиях клеток, ресуспендированных в собственной плазме (рис. 11), показали значительное повышение коэффициента адсорбции у клеток, обработанных трипсином по сравнению с просто отмытыми клетками и ресуспендированными в собственной плазме (р = 0,013). Таким образом, после обработки клеток трипсином, местом адсорбции на наружной поверхности эритроцитарных мембран могут служить заряженные группировки, формируемые как за счет диссоциации ионизируемых групп мембранных белков, так и карбоксильные и аминные группировки разорванных трипсином пептидных связей белковых макромолекул. Появление дополнительных мест, способных обеспечивать адсорбцию, может быть причиной повышенной адсорбции после обработки данным ферментом.
