Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы
1.1. Феномен внутрисосудистой агрегации эритроцитов и реологические свойства крови 11
1.2. Механизмы процесса агрегатообразования 23
1.3. Экстрацеллюлярные факторы агрегации эритроцитов 26
1.4. Мембранные свойства эритроцитов 39
1.5. Трансдукция сигнала и внутриклеточные процессы 62
Глава 2. Организация, материалы и методы исследования 85
Глава 3. Оценка вклада процесса агрегатообразования в повышение вязкости крови при низких скоростях сдвига и сравнительный анализ методов оценки агрегации эритроцитов 104
Глава 4. Влияние плазменных факторов на межэритроцитарные взаимодействия 120
4.1. Изменение уровня рН среды 120
4.2. Изменение уровня свободного экстрацеллюлярного кальция 130
4.3. Влияние белков свертывающей системы крови на объединение эритроцитов в агрегаты 134
Глава 5. Влияние регуляторных молекул на агрегацию эритроцитов ... 141
Глава 6. Оценка адренореактивности организма и агрегации эритроцитов под действием адренергических соединений 154
Глава 7. Анализ механизмов трансдукции сигнала при адренергических воздействиях на эритроциты 169
Глава 8. Влияние групповой (АВО) принадлежности эритроцитов на их агрегатные свойства 191
Глава 9. Оценка взаимосвязи агрегатных свойств эритроцитов с их мембранными свойствами 200
Глава 10. Оценка роли внутриклеточного ионизированного кальция в процессе агрегации эритроцитов 216
Глава 11. Оценка взаимодействия эритроцитов в условиях энергоде фицита и при изменениях ионного гомеостаза 226
Выводы 236
Список литературы 239
Приложение 298
- Феномен внутрисосудистой агрегации эритроцитов и реологические свойства крови
- Изменение уровня свободного экстрацеллюлярного кальция
- Оценка адренореактивности организма и агрегации эритроцитов под действием адренергических соединений
- Влияние групповой (АВО) принадлежности эритроцитов на их агрегатные свойства
Введение к работе
Актуальность темы. Обеспечение газообмена является основной функцией эритроцитов. Оксигенация клеток и тканей организма в значительной степени зависит не только от способности гемоглобина связывать и высвобождать кислород, но также и от реологических свойств эритроцитов - их способности к деформации и объединению в агрегаты, поскольку клеточные функции осуществляются, в основном, через свободную поверхность их мембран. Эти свойства во многом определяют эффективность перфузии на уровне микроциркуляции (Куприянов В.В. и соавт., 1975; Левтов В.А. и соавт., 1982).
Эритроциты человека в физиологических условиях объединяются в агрегаты при снижении скоростей сдвига до критического уровня. Формирование таких агрегатов обуславливает до 60% венозного сопротивления (Cabel М. et al., 1997), и степень агрегации эритроцитов считается одной из важнейших детерминант неньтоновских свойств крови, в том числе и в условиях течения in vivo (Левтов В.А. и соавт., 1982; Фирсов Н.Н., Джанашия П.Х., 2004).
Обратимая агрегация красных клеток крови необходима для нормального кислородного питания тканей и удаления из них продуктов метаболизма. При пониженной склонности эритроцитов к агрегации наблюдаются диффузионные расстройства дыхания. Образование агрегатов по типу монетных столбиков способствует обмену кислородом между эритроцитами (Фок М.В., 1999).
Агрегация эритроцитов in vivo оказывает многофакторное комплексное влияние на сопротивление кровотоку и оно может реализо-вываться посредством следующих механизмов: 1) за счет уменьшения упорядоченности линейного течения при увеличении размера движущихся частиц (Baskurt O.K. et al., 1997); 2) повышением затрат энергии на разобщение клеток в условиях микроциркуляции (Vicaut Е., 1995); 3) агрегация способствует аксиальному дрейфу эритроцитов и образованию краевого плазменного слоя (Goldsmith H.L. et al., 1989; Cokelet G.R. et al., 1991). Повышенное аксиальное скопление эритроцитов способствует снижению локальной вязкости в пристеночной зоне сосуда (Reinke W. et al., 1987; Alonso С. et al., 1993; Suzuki Y. et al., 1996), тем самым модулируя активность сосудистых регуляторных механизмов, активируемых механическим стрессом. Это выражается в ингибирова-нии генерации N0 эндотелием (Baskurt O.K. et al., 2004), затруднении процесса деоксигенации и снижении отдачи кислорода тканям при существенном увеличения пристеночного слоя плазмы, выступающего в качестве барьера для диффузии кислорода (Tateishi N. et al., 2001, 2002).
Значение агрегации эритроцитов особенно возрастает в условиях патологии, поскольку при этом изменяются степень агрегации, скорость агрегатообразования, устойчивость образующихся агрегатов, их размеры и морфология (Галенок В.А. и соавт., 1987; Селезнев С.А. и соавт., 1985). Повышенная степень агрегации ведет к ухудшению окси-генации тканей, способствует развитию ишемии и тромбоза, приводит к нарушению микроциркуляции органов и тканей (Чернух A.M., 1984; Koenig W. et al., 1988; Mchedlishvili G., Maeda N., 2001; Meiselman H.J., 2002).
Несмотря на то, что исследования процесса объединения эритроцитов в агрегаты ведутся уже достаточно давно, механизмы этого явления остаются предметом предположений и гипотез (Fabry T.L., 1987; Brooks D., 1988;Baumler I. et al., 1999; Neu В., Meiselman H.J., 2002).
В более ранних экспериментальных работах по изучению агрегации эритроцитов основное внимание уделялось влиянию суспензионной среды (плазмы или растворов высокомолекулярных соединений) на межклеточные взаимодействия (Maeda N. et al., 1984; Donner M. et al., 1989). В последнее время внимание исследователей все больше фокусируется на клеточных факторах агрегации, т.е. на свойствах самих эритроцитов (Nash G.B. et al., 1987; Meiselman H., 1993; Neu В. et al., 2003).
Функциональное состояние эритроцитов в значительной степени зависит от физико-химических свойств и химического состава плазмы крови, поскольку, являясь высокоспециализированной клеткой, эритроцит не способен к основным видам биосинтеза а, следовательно, внутриклеточной регенерации (Блохина Т.А. и соавт., 2001).
Мембрана эритроцита, как и любой другой клетки, выполняет барьерную функцию, в то же время через нее осуществляется как активный, так и пассивный транспорт веществ. Мембрана является местом протекания важнейших ферментативных процессов и осуществления иммунных реакций. На своей поверхности она несет информацию о группе крови, на мембране имеется поверхностный электрический заряд, который играет важную роль во многих процессах, обеспечивающих жизнедеятельность клетки.
При передаче сигнала гормонами, простагландинами и другими биологически активными веществами основные молекулярные компоненты, участвующие в регуляции, локализованы в клеточных мембранах (Черницкий Е.А., Воробей А.В., 1981).
Традиционно эритроциты считались достаточно редуцированными клетками и рассматривались лишь в качестве простых резервуаров для транспорта кислорода. Однако впоследствии было установлено, что
эти клетки обладают значительным набором сигнальных молекул (Minetti G., Low P.S., 1997; Tuvia S. et al., 1999; Bhattacharaya S. et al., 2001; Hines P.S. et al., 2003), что свидетельствует об участии красных клеток крови в регуляторных процессах, направленных на интеграцию функций организма.
Таким образом, процесс объединения эритроцитов в агрегаты является сложным, многофакторным и оказывает существенное влияние на выполнение кровью ее основной кислородтранспортной функции. Недостаточная изученность механизмов агрегатообразования как в физиологических условиях, так и, особенно, при патологии затрудняет возможность управления этим процессом и коррекцию возможных негативных последствий.
Кроме того, процесс объединения эритроцитов в агрегаты представляет собой удобную модель для выявления общих закономерностей межклеточных взаимодействий.
Все вышеизложенное предопределило тему настоящего исследования.
Цель работы: комплексное изучение влияния физико-химических свойств плазмы, мембранных и внутриклеточных факторов на процесс объединения в агрегаты эритроцитов человека.
Задачи исследования.
Оценить вклад агрегации эритроцитов в проявление неньютоновских свойств крови в условиях низкосдвигового течения и провести сравнительный анализ методов оценки агрегатного состояния крови in vitro.
Определить роль изменений основных физико-химических констант плазмы (уровня кислотности, содержания ионизированного кальция, белков свертывающей системы крови) в агрегатообразовании эритроцитов.
Изучить влияние регуляторных молекул (гормонов, нейроме-диаторов, паракринных факторов) на процесс объединения в агрегаты красных клеток крови.
Исследовать взаимосвязь адренореактивности организма и агрегации эритроцитов под действием адренергических соединений в норме и при патологии.
С учетом возможной рецепторной инициации провести анализ механизмов трансдукции сигнала при гормональных воздействиях на эритроциты.
Выяснить, влияют ли антигенные детерминанты мембран эритроцитов на процесс их объединения в агрегаты под действием адренергических соединений.
Оценить взаимосвязь агрегации эритроцитов с их мембранными свойствами: электрофизиологическими характеристиками, проницаемостью и сорбционной способностью.
Изучить роль внутриклеточного ионизированного кальция в процессе агрегации эритроцитов.
Оценить взаимодействие эритроцитов при изменениях их ионного гомеостаза и в условиях энергодефицита.
Научная новизна проведенного исследования заключается в том, что впервые проведено комплексное исследование эндогенных факторов, определяющих процесс агрегатообразования эритроцитов человека в норме и при патологии.
Продемонстрировано влияние изменений уровня кислотности плазмы в физиологических пределах на агрегацию эритроцитов. Получены новые данные о влиянии катехоламинов, простагландинов и белков свертывающей системы крови на процесс агрегатообразования.
Впервые показана стимулирующая роль ионизированного кальция (как экстрацеллюлярного, так и внутриклеточного) в процессе объединения красных клеток крови в агрегаты. Показан дозозависимый характер изменения степени агрегации при повышении уровня свободного кальция плазмы. Установлены новые факты особенностей агрегатного поведения эритроцитов при открытии Гардош-каналов.
Выявлены механизмы адренергических воздействий на эритроциты: показано, что при высоких концентрациях катехоламинов их влияние на процесс агрегатообразования эритроцитов опосредуется активацией а-адренергических рецепторов. Получены новые данные об особенностях проагрегантного действия р-адренергических соединений на эритроциты человека.
Впервые показана взаимосвязь адренореактивности организма и изменения агрегатного поведения красных клеток крови под действием катехоламинов. Установлены новые факты особенностей адренореактивности и агрегатных свойств эритроцитов под действием адренергических соединений в норме и при разных формах патологии.
Впервые зафиксировано влияние АВО групповой принадлежности эритроцитов на их агрегатные свойства под действием адренергических соединений. Показано, что степень выраженности влияния этих соединений зависит от мембранных антигенных детерминант. Выявлены особенности катехоламинового ответа клеток в зависимости от присутствия антигенов на эритроцитарной мембране.
Продемонстрировано отсутствие жесткой детерминированности агрегатных свойств эритроцитов величиной их поверхностного заряда, сорбционной способности и проницаемости мембран.
Впервые показано влияние изменений ионного гомеостаза красных клеток крови и их энергетического баланса на агрегатные свойства.
Экспериментально подтвержден существенный вклад процесса аг-регатообразования эритроцитов в проявление неньютоновских свойств крови при низкосдвиговом течении. Произведен сравнительный анализ ряда методов изучения процесса агрегатообразования in vitro с оценкой их информативности и адекватности. Усовершенствован комплекс методов исследования с целью повышения их точности и чувствительности.
Теоретическая и практическая значимость работы.
Полученные данные о вкладе процесса агрегатообразования в повышение вязкости крови при низких скоростях сдвига, о взаимосвязи агрегатных свойств и коагуляционного потенциала крови, обусловленности адренореактивности организма изменением мембранных свойств эритроцитов убедительно показывают важность процесса агрегатообразования эритроцитов в обеспечении кислородтранспортной функции крови и интеграции функций организма.
Получены новые данные о межклеточных взаимодействиях форменных элементов крови, механизмах их активации и ингибирования под действием физиологически активных соединений, ионного и энергетического баланса клетки, которые в существенной мере пополняют существующее научное знание в этой области.
Установленное влияние гуморальных факторов с участием различных сигнальных молекул и активацией рецепторного аппарата клетки, ее транспортных систем на объединение эритроцитов в агрегаты позволяет выработать подходы к управлению процессом межэрит-роцитарных взаимодействий с целью предупреждения или коррекции возможных негативных последствий этого явления при стрессе или патологии.
Выявленные особенности агрегатного поведения эритроцитов разной АВО групповой принадлежности под действием катехоламинов, адренореактивности организма и степени агрегации при разных видах патологии могут послужить основой для разработки индивидуальных корригирующих воздействий.
Материалы диссертации расширяют представления о факторах и механизмах регуляции вязкости крови, создают новые направления в
гемореологии, важнейшем разделе физиологии крови. Они могут быть использованы при чтении соответствующих разделов физиологии в вузах, а также для совершенствования методов регуляции кровотока в сердечно-сосудистой системе человека.
Апробированные методики можно рекомендовать исследователям и медицинским работникам для оценки агрегатных свойств крови.
Основные положения, выносимые на защиту.
Физико-химические свойства и биологически активные вещества плазмы оказывают выраженное влияние на процесс агрегатообра-зования эритроцитов человека. Эти эффекты обусловлены модификацией клеточных свойств.
Адренореактивность организма человека в норме и при патологии различна. Изменения адренореактивности отражаются во влиянии адренергических соединений на процесс объединения эритроцитов в агрегаты.
Проагрегантное действие катехоламинов обусловлено активацией адренорецепторов и сопровождается изменением ионного баланса клетки.
Антигенные детерминанты (АВО групповая принадлежность красных клеток крови) влияют на межэритроцитарные взаимодействия в присутствии адренергических соединений.
Изменения электрофизиологических характеристик, сорбци-онной способности и неспецифической проницаемости мембран эритроцитов не детерминируют процесс их агрегации.
Повышение уровня внутриклеточного ионизированного кальция в эритроцитах способствует их объединению в агрегаты.
Изменения ионного гомеостаза эритроцитов влияют на их способность к агрегатообразованию. В условиях энергодефицита клеток их агрегация интенсифицируется.
Апробация результатов работы.
Материалы, изложенные в диссертации, доложены и обсуждены на международных конференциях «Микроциркуляция и гемореология» (Ярославль 1997, 1999, 2001, 2003, 2005 гг.), конференции молодых ученых России с международным участием, посвящ. 240-летию ММА им. И.М. Сеченова «Фундаментальные науки и прогресс клинической медицины» (Москва, 1998), на II международном конгрессе «Central European Vascular Forum» (Италия, Рим, 2000), на XI Европейской конференции по клинической гемореологии (Франция, Руан, 2000), на II Всероссийском конгрессе по патофизиологии (Москва, 2000), на ме-
ждународной конференции, посвящ. 75-летию со дня рождения A.M. Уголева «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2001), на XYIII съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Казань, 2001), на XI международном конгрессе по биореологии и IY международной конференции по клинической гемореологии (Турция, Анталья, 2002), на научно-практических конференциях «Методы исследования регионарного кровообращения и микроциркуляции в клинике» (Санкт-Петербург, 2003, 2004, 2005), на XII Европейской конференции по гемореологии и европейской летней школе по биореологии (Болгария, София, 2003), на Третьей Всероссийской с международным участием школе-конференции по физиологии кровообращения (Москва, 2004), на XIX съезде физиологического общества им. И.П. Павлова (Екатеринбург, 2004), на I и II Всероссийских научных конференциях с международным участием «Микроциркуляция в клинической практике» (Москва, 2004, 2006), на III Российском конгрессе по патофизиологии с международным участием (Москва, 2004), на II Всероссийской научной конференции с международным участием «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии» (Москва, 2005), на XIII Европейской конференции по клинической гемореологии (Италия, Сиена, 2005), на I съезде физиологов СНГ (Сочи, Дагомыс, 2005).
По теме диссертации опубликованы 53 печатные работы.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 297 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием организации, материалов и методов исследования, 9 глав с изложением полученных результатов и их обсуждения, выводов, списка литературы. Работа иллюстрирована 23 таблицами и 47 рисунками. Библиографический указатель включает в себя 597 наименований: 124 отечественных и 473 иностранных источника.
Феномен внутрисосудистой агрегации эритроцитов и реологические свойства крови
Выполнение кровью присущих ей физиологических функций, особенно на уровне микроциркуляции, где диаметр сосудов соизмерим с размерами клеток, и непосредственно осуществляется перфузия тканей и транскапиллярный обмен, во многом определяется способностью клеток крови к взаимодействию между собой (агрегация эритроцитов, агглютинация, агрегация тромбоцитов и лейкоцитов), друг с другом и с клетками сосудистого эндотелия.
Известно, что если в любом локальном регионе кровоток замедлится или прекратится, может наступить повреждение тканей, в ряде случаев необратимое (Chien S., Lung L., 1987, Warnke К., Skalak Th., 1992, Bohler T.et al., 1995).
Изучение механизмов взаимодействия клетка-клетка было признано магистральным направлением в гемореологии (Stoltz J., 1995). Гемореология - это раздел реологии, который имеет дело с деформацией и течением крови. Макрореология рассматривает изучаемый материал как однородный и лишенный структуры, микрореология рассматривает реологическое поведение двух или многофазных систем в зависимости от деформационных и текучих свойств их компонентов и устанавливает взаимосвязи между реологическими свойствами сложной системы и ее составных частей (Фирсов Н.Н., Джана-шия П. X., 2004).
Общей причиной изменений кажущейся вязкости со скоростью сдвига является изменение внутренней структуры изучаемого объекта, поэтому такая вязкость называется структурной. Кажущаяся вязкость, регистрируемая в эксперименте, является не только характеристикой самого материала, но и зависит от характера движения жидкости в конкретном вискозиметре.
Характерной особенностью крови как ткани является отсутствие специальных межклеточных структур, объединяющих ее форменные элементы в единое целое, - они находятся во взвешенном состоянии в окружающей их жидкой среде - плазме. Плазма представляет собой весьма сложную биологическую среду, в состав которой входят белки, различные соли (электролиты), углеводы, липиды, промежуточные продукты обмена веществ, гормоны, витамины и другие биологически активные соединения, растворенные газы (Андрианова И.Г., 1968).
Эритроциты - наиболее многочисленная категория клеток крови, их содержание в крови на порядок выше, чем тромбоцитов и на 2-3 порядка превышает количество лейкоцитов, среднее расстояние между эритроцитами при нормальном гематокрите составляет 1,5 мкм. Суммарная поверхность эритроцитов во всем объеме крови человека составляет около 2700 м (Чижевский А.Л., 1980). Это предопределяет зависимость механических свойств крови от объемных свойств эритроцитов и от характера поверхностного ,/ межклеточного взаимодействия.
Характер микрореологических процессов при течении крови был исследован Н. Schmid-Schonbein et al. (1973, 1976, 1990, 1994). Было показано, что в области кессоновского течения происходит сначала разрушение больших агрегатов на отдельные монетные столбики, ориентирующиеся вдоль потока, длина которых уменьшается с ростом скорости сдвига. В зоне ньютоновского течения эритроциты полностью дезагрегированы, в этой зоне начинается деформация красных клеток крови, придающая им форму эллипсоидов. При сравнении кривых течения крови человека и быка показано, что слабое проявление неньютоновских свойств бычьей крови связано только с деформацией эритроцитов и их ориентацией вдоль потока, поскольку эритроциты быка не агрегируют. Кривые течения бычьей крови в кессоновских координатах не имеют предела текучести и слабо изгибаются (Фирсов Н.Н., Джанашия П. X, 2004).
Вязкость крови зависит и от диаметра сосудов. В соответствии с эффектом Фареуса-Линдквиста, кажущаяся вязкость крови снижается при уменьшении диаметра сосуда менее 0,3 мм. При этом, чем мельче сосуд, тем значительнее снижение вязкости крови и, в конечном счете, она приближается к вязкости плазмы (за счет образования пристеночного слоя плазмы, аксиального дрейфа эритроцитов и снижения гематокрита).
Однако при значениях диаметра ниже критического уровня наблюдается обратный эффект - сопротивление кровотку значительно возрастает (Эккерт Р. и соавт., 1992). Величина критического диаметра в значительной степени определяется внутренней вязкостью эритроцитов и степенью их агрегации. Внезапный и кратковременный рост вязкости крови может быть обусловлен резким изменением агрегируемости эритроцитов или тромбоцитов, изменением уровня рН. Даже начальные стадии процесса свертывания крови способствуют повышению степени агрегации эритроцитов. Небольшие изменения двух или более факторов, влияющих на реологию крови, вызовут J( усиленное синергичное повышение вязкости и увеличение критического диаметра, при котором проявится обратный эффект Фареуса-Линдквиста (Dintenfass L., 1974; Schmid-Schonbein Н., 1988). Такие многократно усиленные по механизму положительной обратной связи даже локальные нарушения могут спровоцировать остановку кровотока.
Феномен внутрисосудистой агрегации эритроцитов известен достаточно давно. Еще в 1852 году A. Coccius впервые наблюдал глобулярный характер течения крови в сосудах конъюнктивы. Патофизиологическая роль агрегации красных клеток крови было отмечена R. Fahraeus в 1929 году (Fahraeus R., 1931, 1958). С тех пор в течение нескольких десятилетий агрегация считалась характерным признаком патологического состояния. Заслуга детального изучения этого феномена принадлежит M.Knisely (1947, 1965), который утверждал, что в норме ни у людей, ни у животных этот феномен практически не обнаруживается. В настоящее время установлен факт объединения красных клеток крови в единые структуры в условиях in vitro у большинства млекопитающих - кошек, собак, крыс и т.д. (Левтов В.А.и соавт., 1982, Галенок В.А. и соавт., 1987, Бычков СМ., Кузьмина С.А., 1993, Weng X. et al., 1996). Разные виды животных характеризуются различной агрегируемостью эритроцитов. По степени агрегации эритроциты человека занимают промежуточное положение между красными клетками крови таких видов, как лошадь, собака и практически не образующими агрегаты эритроцитами крысы, буйвола (Popel A.S. et al, 1994; Kumaravel M., Singh M., 1995; Baskurt O.K. et al, 1997, Spengler M.I., Rasia M., 1999). Для крови коровы, козы и кролика отмечена высокая суспензионная стабильность и практически полное отсутствие агрегации (Левтов В.А.и соавт., 1982, Галенок В.А.и соавт., 1987).
В исследованиях Р. Тухватулина и соавт. (1986, 2000) было показано, что в крови пресмыкающихся, амфибий, пресноводных рыб фотометрических признаков агрегации почти не обнаруживается. Ими же впервые была исследована агрегация ядерных эритроцитов на примере некоторых видов птиц. Форма агрегатов ядерных эритроцитов специфическая, при этом сохраняется общее правило: площадь контакта между клетками должна быть максимальной.
Изменение уровня свободного экстрацеллюлярного кальция
При использовании стандартных растворов на основе реофортана с фиксированными уровнями рН изменения степени агрегации эритроцитов по направленности соответствовали таковым при закислении или защелачива-нии плазмы, что еще раз подтвердило предположение о том, что наблюдаемые эффекты обусловлены модификацией клеточного рН, а не уровня кислотности суспензионной среды (плазмы или раствора полимеров).
Ранее высказывалось мнение о том, что влияние колебаний уровня рН на взаимодействие эритроцитов опосредуется главным образом изменением электрофизиологических характеристик красных клеток крови. При ацидозе, накоплении лактата, истощении щелочных резервов крови -потенциал эритроцита уменьшается, а способность клеток к объединению увеличивается (La CourG.etal., 1970).
Полученные нами результаты согласуются с опубликованными экспериментальными данными по влиянию уровня рН на агрегатообразование эритроцитов человека (Shiga Т. et al.„ 1983, Chica I. et al., 2003), которые показали, что скорость объединения эритроцитов в агрегаты возрастает при повышении рН плазмы. Влияние уровня кислотности среды на процесс агрега-тообразования, по мнению авторов, обусловлено скорее увеличением среднего корпускулярного объема клеток при низких значениях рН, чем изменением их поверхностного заряда или способности к связыванию белков.
Кроме того, по мнению I. Chica et al. (2003), существенное влияние уровня кислотности на процесс агрегатообразования эритроцитов опосредуется морфологическими изменениями при сдвиге рН в кислую (эхиноцитоз) или щелочную область (уплощение клеток). Шиловидная форма клеток не способствует образованию прочных контактов, а уплощение (увеличение поверхности) повышает силу сцепления. В дополнение к этому, сдвиг рН в кислую сторону приводит к снижению деформируемости эритроцитов за счет изменения мембранной эластичности (Kuzman D. et al., 2000).
По мнению других авторов, при снижении рН наблюдаются сжатие и инвагинационные изменения формы клеток (эхиноцитоз) и обратный эффект (стоматоцитоз) вызывается сдвигом рН в щелочную область (Bobrowska-ffigerstrand М. et al., 1998, Rasia M. et al, 1998).
В целом, N. Maed aet al. (1988), I. Cicha et al. (2003) пришли к выводу, что агрегатообразованию эритроцитов способствуют следующие факторы: повышение рН, увеличение МСНС и снижение РС02 и наоборот, агрегация замедляется в кислых областях рН, в присутствии СОг и при снижении МСНС.
Таким образом, при прохождении через капилляры легких высоко ок-сигенированные эритроциты испытывают влияние проагрегантных факторов, а при перфузии тканей, наоборот, действуют факторы, снижающие интенсивность агрегации, что является важным физиологическим механизмом, обеспечивающим эффективность газообмена.
Направленность изменений агрегатных свойств эритроцитов при варьировании рН в среде с протамин сульфатом и особенности морфологии наблюдаемых при этом агрегатов позволили заключить, что процесс агрегато-образования под действием протамин сульфата может рассматриваться в качестве модели патологической агрегации. Полученные нами результаты согласуются с известными литературными данными об особенностях изменений реологических свойств крови при патологии с изменением уровня рН.
Известно, что в патологических условиях независимо от направления изменения рН отмечается возрастание вязкости крови. Принято считать, что увеличение вязкости крови при ацидозе и алкалозе обусловлено изменением формы и объема эритроцитов (сморщиванием или набуханием) (Dintenfass L., 1962, 1965; Селезнев С.А. и соавт., 1985).
Среди возможных причин изменения степени агрегации при исследуемых нами сдвигах рН можно рассматривать следующие: известно, что при изменении рН в мембранах эритроцитов происходят различные изменения в структуре (нарушения связи между белковыми и липидными компонентами, между компонентами и ионами кальция и т.д.) (Черницкий Е.А., Воробей А.В., 1981). Роль ионов кальция в межклеточных взаимодействиях хорошо известна (Oberleithner Н. et al, 1982; Ткачук В.А., 1983, 1994), в бескальциевой среде нарушаются любые клеточные контакты. При снижении рН плазмы усиливается конкуренция между ионами водорода и кальция за места адсорбции, что приводит к уменьшению количества мембраносвязанного кальция и, как следствие, к уменьшению агрегации (Левин СВ., 1976). При алкалозе концентрация ионов водорода снижается, что обеспечивает увеличение количества мест связывания кальция с мембраной эритроцитов и рост степени агрегации. При алкалинизации (рН=7,5) заметно повышается мембранная проницаемость для катионов деоксигенированных эритроцитов (Joiner С.Н. et al., 1993).
Концентрация ионизированного (физиологически активного) кальция в плазме крови в значительной степени зависит от рН. Действие рН проявляется мгновенно, полностью обратимо и может изменять концентрацию Са в пределах 100% в диапазоне 6,8 - 7,6. В экспериментах in vivo и in vitro была установлена отрицательная корреляция между изменением концентрации низированного кальция (АСа ) и рН (А рН) крови (Oberleithner Н. et al., 1982). Эта корреляция была значительно меньше при респираторных сдвигах рН, чем при метаболических. Авторы пришли к выводу, что эффекты взаимодействия кальция с альбумином и образования комплексов кальция и бикарбоната при метаболических сдвигах рН аддитивны, а при респираторных - противоположны.
Кроме того, было показано, что при повышении рН происходит инги-бирование кальциевого насоса, который в эритроцитах является единственным механизмом удаления кальция из клетки (Нао L. et al., 1994).
Деоксигенация приводит к заметному щелочному сдвигу рН (на 0,2 -0,4 ед.), в оксигенированных эритроцитах заметного сдвига рН не наблюдается в интервале от 7 до 7,7. При деоксигенации концентрация Са in возрастает на 34-74%, a Vmax Са насоса снижается на 19-32% (Tiffert Т. et al., 2003).
В деоксигенированных эритроцитах рН цитоплазмы выше, чем в окси-генированных. Поэтому там ионные насосы работают медленнее, в результате концентрация ионов натрия в цитоплазме возрастает, а калия - уменьшается. При более высоких рН синтез АТФ идет интенсивнее, а расход уменьшается. В оксигенированнх эритроцитах все эти процессы изменяются в обратном направлении (Фок М.В., 1999).
Оценка адренореактивности организма и агрегации эритроцитов под действием адренергических соединений
Выявленные изменения агрегационных характеристик эритроцитов под влиянием гормонов свидетельствуют о том, что повышенный уровень гормонов стресса (катехоламинов) приводит к изменению мембранных характеристик красных клеток крови и повышению их агрегабельности под влиянием и адреналина, и норадреналина. Однако полученные данные о сочетанном действии катехоламинов и инсулина позволяют предположить, что механизмы проагрегантного действия адренергических соединений различны. Хотя инсулин сам по себе не влияет на способность эритроцитов к агрегатообразованию, но он может модифицировать эффект катехоламинов. Если снижение степени агрегации, стимулированной норадреналином, при введении в среду инсулина было незначительным, то эффект адреналина практически нивелировался в присутствии инсулина.
Инсулиновая сигнализация затрагивает две важнейших стороны жизнедеятельности клетки: митогенез и регуляцию метаболизма. Эти эффекты инсулина реализуются главным образом на уровне скелетной мускулатуры, печени и жировой ткани, но в определенной степени имеют место во всех клетках организма (Satiel A.R.et al., 2001).
Было показано, что постишемическое введение препарата, содержащего глюкозу, инсулин и калий оказывает положительное воздействие не только на микроциркуляцию, но и оказывает протективный эффект в отношении клеточных мембран (van der Horst I. et al., 2005). Известно, что инсулин в физиологических концентрациях значительно улучшает реологические свойства эритроцитов (Зинчук В.В., 2001).
Действие катехоламинов, опосредованное активацией (3-адренорецепторов, как правило, противоположно влиянию инсулина. Так, катехоламины стимулируют распад гликогена, деградацию белков, липолиз, в то время как инсулин активирует обратные метаболические процессы. Способность инсулина выступать в роли антагониста действия катехоламинов достаточно изучена (Shumay Е. et al, 2004).
Основная функция трансдукции сигнала через инсулиновые рецепторы состоит в регуляции как внутриклеточного содержания глюкозы, так и ее уровня в крови. Связывание инсулина с соответствующим рецептором ведет к аутофосфорилированию Р-субъединиц инсулинового рецептора и фосфорилированию тирозина. В конечном счете, в безъядерных клетках, каковыми являются зрелые эритроциты, активация инсулинового рецептора ведет к активации фосфоинозитид-3-киназы, которая обеспечивает транслокацию транспортера глюкозы из цитоплазматических везикул к клеточной мембране (Bevan Р., 2001; Kido Y. et al., 2001). Основная биологическая роль инсулина, по всей видимости, заключается в обеспечении функции локомоции (т. е. длительной интенсивной физической нагрузки). Не до конца определены функциональные отношения в системе гормональной регуляции, о чем свидетельствует термин «контринсулярные» гормоны и функциональное противопоставление гормонов. Все гормоны функционально являются синергистами, так как адреналин может обеспечить энергетические потребности стресса только после того, как инсулин сформирует депо гликогена в миоцитах и адипоцитах (Титов В.Н., 2005).
Адреналин и инсулин принято считать физиологическими антагонистами. Выдвигались предположения, объясняющие такой антагонизм действием инсулина на пострецепторные события (активация фосфодиэстеразы, ингибирование аденилатциклазы), однако они не получили своего подтверждения. В то же время экспериментально было показано, что инсулин через свой рецептор может контролировать свойства молекулы Р-адренорецептора, модифицируя ее конформацию и/или реактивность функциональных SH-групп. Для реализации такого межрецепторного взаимодействия фосфолипидный состав и физические свойства липидного бислоя не имеют решающего значения, что указывает на роль мембранных белков в передаче сигнала от инсулинового к адренергическому рецептору (Аксенцев С.Л., 1983).
При обработке клеток инсулином происходит фосфорилирование (32-адренорецепторов, что нарушает передачу сигнала на соответствующий Gs протеин (Doronin S. et al., 2000, 2002). Инсулин катализирует жесткую интернализацию 32-адренорецепторов, предотвращая взаимодействие агониста с рецептором и тем самым подавляя (3-адренергическую сигнализацию. адренорецепторы принадлежат к суперсемейству G-протеин-сопряженных рецепторов. Для них характерна десенситизация в ответ на действие соответствующих агонистов и контррегуляция некоторыми рецепторами ростовых факторов с внутренней тирозинкиназной активностью, включая инсулиновые (Morris A.J. et al., 1999).
Известно, что инсулин увеличивает проницаемость наружных мембран ряда тканей для ионов, глюкозы и других метаболитов. Инсулин, как и многие другие гормоны, переносится кровью не в свободном состоянии, а в связанном с белками плазмы (в основном (3-глобулинами) (Ткачук В.А., 1983).
Наиболее важным эффектом инсулина является ускорение транспорта глюкозы в клетку. Препятствуя активации аденилатциклазы другими гормонами (адреналином, глюкагоном), инсулин может понижать концентрацию цАМФ в клетке, замедляя тем самым процессы цАМФ-зависимого фосфорилирования белков (Ткачук В.А., 1983). Инсулин сам по себе, независимо от глюкозы, может оказывать прямое влияние на ионный гомеостаз клеток: например, известно, что в физиологических условиях он повышает уровень Са -т и Mg ;п в эритроцитах и тромбоцитах, предположительно за счет увеличения входа этих ионов из экстрацеллюлярного пространства (Barbagallo М. et al., 1993; 1997).
Влияние групповой (АВО) принадлежности эритроцитов на их агрегатные свойства
Существенные отличия проагрегантного эффекта адренергических соединений для эритроцитов разной АВО групповой принадлежности демонстрируют, что степень выраженности влияния этих соединений зависит от присутствия антигенных детерминант на мембране - в присутствии антигенов А и В воздействие минимальное, в их отсутствие (группа О (I)) - максимальное.
В настоящий момент признается факт определенной связи частоты встречаемости ряда заболеваний и принадлежности к той или иной группе крови. Например, группы крови А (II) и АВ (IY) относят к основным риск-факторам тромбоэмболии и ишемий органов (Баркаган З.С. и соавт., 2004), язвенная болезнь желудка и двенадцатиперстной кишки чаще встречается у людей с 0 (I) группой крови и т.д. (Koscielak J., 1986).
Индивидуальные особенности реакции клеток крови на те или иные воздействия в последнее время все чаще становятся объектом внимания исследователей. Так, появляется все больше экспериментальных данных, свидетельствующих о частичной или полной неэффективности препаратов, предназначенных для уменьшения вязкости крови и снижения риска тромбо-образования. Так от 1/4 до 1/3 больных оказываются аспиринорезистентными (Баркаган З.С., 2004), полная реологическая неэффективность пентокси-филлина показана при лечении заболеваний периферических артерий (Dawson D.L., et al, 2002). Проблема резистентности к различным препаратам особенно требует внимания при лекарственной коррекции выявленных изменений гемореологии и гемостаза. Так, в НИИ неврологии РАМН разработана тест-система, позволяющая in vitro определять различные варианты реакций клеток крови на препараты (в том числе и антиагреганты), включая парадоксальную (Суслина З.А. и соавт., 2006).
Другие авторы сообщают о снижении деформируемости мембран эритроцитов человека под влиянием адреналина, причем указывают на значительную вариабельность этого эффекта (от позитивного, полного отсутствия эффекта и до негативного) в разных образцах крови (Johnston et al. С.С, 1977).
В экспериментах N. Maeda et al. (1986) было показано, что дериваты иммуноглобулинов, использующиеся в терапии иммунодефицитных состояний, способны интенсифицировать агрегацию эритроцитов. При этом было отмечено, что эффект этих препаратов имел различную выраженность в зависимости от АВО-групповой принадлежности крови пациентов: был максимальным в присутствии антигенов А и В и минимальным в их отсутствие (группа 0 (I)).
Основной функцией эритроцитов является обеспечение газообмена, и в процессе циркуляции в течение 120 дней они подвергаются многократным фильтрациям в ретикулоэндотелиальной системе, где находятся в тесном контакте с клетками, обладающими фагоцитарной активностью. Избежать повреждения и гибели им помогает способность к деформации и, возможно, защитные углеводные компоненты мембраны (Koscielak J., 1986). Углеводные структуры, обусловливающие групповую принадлежность клеток крови, в достаточно большом количестве присутствуют в мембранах циркулирующих эритроцитов, функциональные особенности которых не предполагают тесного контакта с соседними клетками или лигандами (например, эндогенными лектинами) и различными белками, способствующими процессам агрегации и адгезии клеток крови (Koscielak J., 1986; Бергельсон Л.Д., 1982). Поэтому одной из функций углеводов эритроцитарных мембран может быть защитная, а сами они представляют собой в значительной степени инертное наполнение цитоплазматической мембраны.
Высказывается мнение, что углеводные компоненты мембраны, кроме того, теоретически могут модулировать биологическую активность функциональных молекул (Koscielak J., 1986а).
Количество иммунологических рецепторов на мембране зависит от «возраста» эритроцита: обнаружено, что при старении эритроцитов имеет место значительное снижение связывания ими антител (Черницкий Е.А., Воробей А.В., 1981).
Влияние антигенных характеристик эритроцитов на реологические свойства крови и значение этих генетических факторов при сердечнососудистых заболеваниях отмечались в работах L. Dintenfass, который предположил, что выявленные различия могут быть обусловлены как мембранными, так и плазменными факторами групп крови. Экспериментально были показаны статистически достоверные различия между агрегатными свойствами эритроцитов групп О (I) и А (II) при инфаркте миокарда, злокачественной меланоме (Dintenfass L., 1973,1973а). Также в работах L. Dintenfass было зарегистрировано разнонаправленное действие препарата R 433 (производного дипиридамола) на агрегационное поведение эритроцитов разных групп крови - выраженный антиагрегационный ответ для эритроцитов с антигеном А (группы А и АВ) и проагрегантный эффект для групп 0 и В (Dintenfass L., 1970).
Также им было показано, что дезагрегантные свойства глюкозы и фруктозы в значительной степени более выражены для образцов крови с антигенами А и В, чем для группы 0 (Dintenfass L., 1972). Автором было высказано предположение, что, несмотря на различную этиологию заболеваний (гипертония, атеросклероз, диабет, почечная недостаточность, злокачественные новообразования), при которых имеет место значительная интенсификация процесса агрегатообразования, во всех случаях имеются группоспецифи-ческие особенности регуляции этого феномена. Данный факт может свидетельствовать о различных молекулярных механизмах, лежащих в основе этого явления, и возникает вопрос о необходимости учета особенностей действия препаратов в зависимости от групповой принадлежности крови.
Таким образом, в результате проведенного нами исследования было показано, что агрегатные свойства эритроцитов в присутствии катехолами-нов отличаются для клеток разной АВО групповой принадлежности. Выявлены особенности влияния а- и (3-адреномиметиков на процесс агрегатообразования в зависимости от присутствия тех или иных антигенных детерминант на мембранах эритроцитов.
