Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА I Обзор литературы 10
ГЛАВА II Организация эксперимента, материал и методы исследования
2.1. Организация эксперимента и характеристика объекта исследования 31
2.2. Методы исследования
2.2.1. Определение общего содержания белка и белковых фракций плазмы крови 32
2.2.2. Определение концентрации глюкозы в плазме крови 34
2.2.3. Методы макро- и микрогемореологических исследований 34
2.2.4. Статистические методы обработки цифрового материала... 41
ГЛАВА III Результаты собственных исследований
3.1. Анализ влияния внеклеточных факторов на агрегацию эритроцитов
3.1.1. Характеристика реологических свойств крови 42
3.1.2. Микрореологические свойства эритроцитов при разных состояниях гемодинамики (сниженное, нормальное и повышенное артериальное давление) 43
3.1.3. Изменение агрегации эритроцитов при воздействии на них катехоламинов (адреналина, норадреналина) и фенилэфина ... 45
3.1.4. Сравнительный анализ действия катехоламинов и фенилэфрина на агрегацию эритроцитов 52
3.1.5. Изменение агрегации эритроцитов при воздействии на них энзапрстом 54
Резюме 55
3.2. Анализ роли Са2+ в агрегационном поведении эритроцитов
3.2.1. Характеристика реологических свойств крови 56
3.2.2. Состояние агрегации эритроцитов при инкубации их с верапамилом 58
3.2.3. Изменение агрегации эритроцитов при снижении уровня Са + в плазме с помощью ЭДТА 59
Резюме 61
3.3. Влияние на агрегацию эритроцитов ингибиторов фосфодиэстераз (папаверина, эуфиллина, дротаверина) и проникающего стабильного аналога циклического аденозинмонофосфата (дБ-цАМФ)
3.3.1. Характеристика реологических свойств крови 62
3.3.2. Изменение агрегации эритроцитов при воздействии на них ингибиторами фосфодиэстераз (папаверином, эуфилином, дротаверином) 63
3.3.3. Изменение агрегации эритроцитов при применении проникающего аналога цАМФ (дБ-цАМФ) 68
Резюме 70
3.4. Влияние блокирования ионного транспорта в эритроцитах на их агрегационные свойства
3.4.1. Характеристика реологических свойств крови 72
3.4.2. Изменение агрегации эритроцитов при действии веществ, влияющих на состояние ионного транспорта в мембранах клеток 73
Резюме 78
ГЛАВА IV Заключение 80
Выводы 95
Литература 96
- Определение общего содержания белка и белковых фракций плазмы крови
- Методы макро- и микрогемореологических исследований
- Изменение агрегации эритроцитов при воздействии на них катехоламинов (адреналина, норадреналина) и фенилэфина
- Изменение агрегации эритроцитов при воздействии на них ингибиторами фосфодиэстераз (папаверином, эуфилином, дротаверином)
Введение к работе
Около 70 лет прошло со времени публикации классической работы Уиттейкера и Уинтона, в которой было указано на разницу вязкости, измеренной in vivo и in vitro. Существует несколько исследований, где приводятся данные о корреляции между реологией крови in vitro и in vivo (В. Neu, J.K. Armstrong et al., 2003). Наиболее существенным микрореологическим свойством эритроцитов, которое проявляется как в условиях естественного кровотока, так и при его моделировании in vitro, является обратимая агрегация (P. Gaehtgens, 1995; P. Johnson, 1995). Однако результаты исследования влияния агрегации эритроцитов на сопротивление кровотоку in vivo и in vitro не всегда совпадают (W. Renke et al., 1987; P. Gaehtgens, 1993). Методом интра-витальной микроскопии было показано, что повышенная агрегация эритроцитов увеличивала сопротивление микрокровотоку в отдельных сосудах (G. Mchedlishvili et al., 1997). Тогда как при исследовании перфузии целого органа было найдено, что повышенная агрегация эритроцитов либо не влияла, либо оказывала разнонаправленное воздействие на сопротивление кровотоку (Е. Vicaut, 1995). Во многих последующих работах было показано, что высокомолекулярные полимеры стимулировали агрегацию эритроцитов. Однако авторы не учитывали значительный вклад в создание сопротивления потоку высокой вязкости самих декстранов.
P. Johnson et al. (1995) определили вклад агрегации эритроцитов в венозное сопротивление и продемонстрировали обратное соотношение между венозным сопротивлением и скоростью кровотока; это соотношение отсутствовало как в неагрегирующей, так и высокоагрегирующей суспензиях. Исходя из этого, было высказано предположение о том, что существует некий оптимальный уровень агрегации эритроцитов для поддержания сосудистого гомеостаза (В. Neu, J.K. Armstrong et al., 2003).
По мнению О. Baskurt (1999), агрегация эритроцитов повышает вязкость крови, но только в том случае, когда она измерена на ротационном вискозиметре. В 1995 году на это указывал P. Gaehtgens.
Анализ большого числа исследований позволил J. Stoltz (1991) заключить, что повышенная агрегация эритроцитов может увеличивать сопротивление кровотоку в основном в зонах с низкими сдвиговыми скоростями. С другой стороны имеются данные о том, что выраженная агрегация может давать в результате снижение сопротивления кровотоку в сосудах, фиксированных глютеральдегидом у экспериментальных животных. Это снижение сопротивления должно быть связано с уменьшением напряжения сдвига на стенке из-за аккумулирования эритроцитов на осевой позиции в сосуде. Однако уменьшение сдвигового напряжения на сосудистом эндотелии может повлиять на механизмы регуляции сосудов и оказывать влияние на сопротивление кровотоку в интактных сосудах. Наиболее важный механизм регуляции сосудистого тонуса связан с продукцией NO эндотелиальными клетками (Н.Н. Петрищев и др., 2004). Сниженное напряжение сдвига на стенке приводит к нарушению регуляции экспрессии e-NOS и ее активности, что ведет к повышению сосудистого тонуса и снижению синтеза NO (A. Blann, 1997). Следовательно, повышенная агрегация эритроцитов может привести к изменению вазомоторной активности, ведущей, в свою очередь, к повышению сосудистого сопротивления в интактной сосудистой сети.
Агрегация эритроцитов в нормальных физиологических условиях является очень сложным и обратимым феноменом (В.А. Левтов и др., 1982; S. СЫеп, 1986; Н. Meiselman, 1993; R.S. Ajmani, 1997; S. Bertoluzzo et al., 1999). Физико-химические процессы, лежащие в основе формирования «монетных» столбиков из эритроцитов, многофакторны. К ним относятся концентрация фибриногена, состояние липидного бислоя, поверхностный мембранный потенциал (С.А. Селезнев и др., 1975; В.А. Галенок и др., 1987; М. Rampling, 2001;W. Reinhart, 2002). При ряде патологических процессов наблюдается не
только увеличение концентрации фибриногена, но и изменение величины зарядов на мембране клеток (В.А. Галенок и др., 1987; J. Stoltz et al., 1999; О. Baskurt,2001).
Итак, многочисленные данные свидетельствуют о том, что агрегация эритроцитов проявляет разную степень интенсивности при разных состояниях организма и имеет компенсаторное и адаптивное значение для системы кровообращения и для организма в целом. Следовательно, можно полагать, что агрегатообразование является не только результатом критического сближения соседних эритроцитов и формирования межклеточного макромолеку-лярного мостика, но и регуляторным процессом с включением вне- и внутриклеточных сигнальных путей.
В качестве внеклеточных сигнальных молекул для инициации процесса агрегации эритроцитов можно рассматривать катехоламины. Последние, при активации адренорецепторов, изменяют микрореологическое поведение эритроцитов (Т. Oonishi et al., 1997; S. Hilario et al., 1999).
На эритроцитах человека обнаружены функционально активные адре-норецепторы обоих типов- альфа- и бета-адренорецепторы (R. Lefkowitz, 1972; G. Sager, S. Jacobsen, 1985; J. Sundquist et al., 1992; J. Horga et al., 2000).
Внутриклеточные сигнальные пути при агрегации эритроцитов могут быть представлны системой Са *-калъмодулин и/или аденылатциклаза— цАМФ (В.А. Ткачук, 1998). Исследование влияния ионизированного Са на активность аденилатциклазной системы в эритроцитах показало, что Са2+ ин-гибирует накопление цАМФ, стимулированное изопротеренолом (1 мкМ) или форсколином (10-20 мкМ). Вместе с тем Са не влиял на связывание
изопротеренола бета-адренорецепторами. Повышение концентрации Са не создавало наблюдаемой (заметной) активации фосфодиэстеразы циклических нуклеотидов в данных экспериментальных условиях. Полученные данные можно объяснить наличием изоформы аденилатциклазы, которая может быть напрямую ингибирована Са или Gi-белками. Кроме того, полученные дан-
ные свидетельствуют в пользу взаимосвязи между внутриклеточными сигнальными системами: Са2+ и аденилатциклаза-цАМФ (Е. Demirel et al., 2000).
Данные биомикроскопических методов исследования кровотока способствовали формированию точки зрения о том, что в системе кровообращения, особенно в ее емкостном отделе, происходит обратимое образование эритроцитарных агрегатов (М. Knisely et al., 1958; P. Johnson, 1994). При искусственном моделировании кровотока в вискозиметрах различного типа, в основном на ротационных приборах, было показано, что при низкой скорости сдвигового течения (ниже 10с"1) наблюдалось увеличение вязкости крови по сравнению с течением при относительно высоких скоростях сдвига. Этот прирост вязкости связывали в основном с агрегацией эритроцитов (J. Goldstone et al., 1970; Н. Schmid-Schoenbein, 1976; L. Dintenfass, 1981).
О широкой распространенности феномена обратимой агрегации эритроцитов свидетельствует то, что объединение красных клеток крови в единые структуры в условиях in vitro происходит в разной степени у большинства млекопитающих (М. Rampling, 2001; Н. Meiselman, 2001).
В настоящее время предложены две основные модели агрегатообразо-вания эритроцитов: 1) мостиковая и 2) модель осмотического «истощения» перимембранного слоя (О. Baskurt, Н. Meiselman, 1997). Однако обе модели не включают в объяснение агрегации эритроцитов роль вне- и внутриклеточных сигнальных молекул, способных существенно изменять клеточный ответ на действие какого-либо сигнального фактора (А.В. Муравьев и др., 2003).
Таким образом, имеется группа фактов, которая заставляет предполагать возможность активного изменения механического поведения эритроцитов в условиях кровообращения in vivo. В первую очередь, это наличие на их мембранах адренорецепторов обоих типов. Кроме того известно, что под действием катехоламинов эритроциты изменяют свою деформируемость и агрегацию. Вместе с тем остается не ясным, какие внутриклеточные сигналь-
ные пути реализуются при стимулировании катехоламинами клеточной активности эритроцитов. Как сказывается состояние ионного обмена и метаболизма эритроцитов в реализации агрегационного поведения клеток. Как взаимодействуют внутриклеточные посредники при этом. Все это мотивирует формулирование цели исследования и постановку его основных задач.
Цель: Исследование внеклеточных и внутриклеточных механизмов агрегации эритроцитов.
Задачи:
Определить величину агрегации эритроцитов у лиц с разным функциональным состоянием системы кровообращения.
Изучить влияние природных и синтетических катехоламинов, а также синтетического аналога простагландина Фг« на агрегацию эритроцитов.
Исследовать влияние блокады кальциевых каналов и связывания кальция в плазме крови на агрегацию эритроцитов.
Исследовать состояние агрегации эритроцитов при изменении уровня циклического аденозинмонофосфата (цАМФ) путем применения проникающего аналога цАМФ и ингибированием фосфодиэстераз в клетках.
Изучить агрегацию эритроцитов при действии веществ, изменяющих ионный клеточный транспорт.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
Величина агрегации эритроцитов крови, взятой у лиц с разным функциональным состоянием сердечно-сосудистой системы (сниженное, нормальное и повышенное артериальное давление) достоверно различается.
Природные и синтетические катехоламины (адреналин, норадреналин, фе-нилэфрин), а также синтетический аналог простагландина Фга- энзапрост, выражение стимулируют агрегацию эритроцитов.
Блокада кальциевых каналов мембраны эритроцитов верапамилом и связывание кальция в плазме крови при помощи ЭДТА снижают агрегацию эритроцитов.
Ингибиторы фосфодиэстераз (папаверин, эуфиллин, дротаверин) и проникающий аналог циклического аденозинмонофосфата (дибутирил-цАМФ) снижают степень агрегации эритроцитов.
Действие препаратов, влияющих на состояние ионного транспорта в мембранах эритроцитов, сопровождается повышением степени их агрегации.
Определение общего содержания белка и белковых фракций плазмы крови
Исследование вне- и внутриклеточных механизмов агрегации эритроцитов проводили на клетках, полученных из крови здоровых доноров. Исследование общего реологического профиля этой крови показало, что при высоком среднем гематокрите (Hct), равном 47,16% вязкость цельной крови (BKi) при относительно большой скорости сдвига (скорость сдвига- 350-400 сЛ) составила у лиц данной группы 4,5- 4,7 мПа.с. При этом вязкость плазмы (ВП) была равной 1,80 мПах. Относительно невысокие величины вязкости суспензии (ВСі) эритроцитов в буфере, средней концентрации гемоглобина в них (МСНС) и индекса ригидности (Тк) свидетельствовали об оптимальной деформируемости эритроцитов (табл. 3).
Сравнительный анализ показал, что величины концентрации белка плазмы, альбуминов и глобулинов находились на уровне нормальных значений. Концентрация глюкозы в плазме крови составляла 5,36±0,174 мМ (табл. 3), что несколько превышало среднюю норму (5,0 мМ).Уменьшение напряжения сдвига в системе кровообращения при сниженном артериальном давлении (АД среднее менее 75 мм рт. ст.) может способствовать усилению агрегатообразования, в основе которого лежит взаимодействие межклеточной адгезии и гидродинамической силы, вызывающей дисперсию клеток. Способность эритроцитов к агрегации была оценена комплексно. При регистрации агрегатообразования выявлено, что показатель агрегации (ПА) и число эритроцитов, приходящихся на один агрегат были несколько выше у лиц со сниженным артериальным давлением (табл. 4). Следовательно, имелась тенденция к более высоким величинам указанных характеристик. Так показатель агрегации (ПА, отн. ед.) превышал данные группы лиц с нормальным АД на 13%, а число эритроцитов/агрегат было на 5% больше.
Несколько увеличенная агрегабельность эритроцитов у лиц со сниженным давлением могла быть связана с динамикой артериального давления. На артериальное давление и, следовательно, на величину сопротивления кровотоку, агрегация эритроцитов могла влиять через вязкость крови, характерную для низких скоростей сдвига.
При исследовании агрегации эритроцитов у лиц с повышенным артериальным давлением (среднее АД выше 105 мм рт. ст.) было установлено, что показатель агрегации эритроцитов был на 103% больше, чем у испытуемых с нормальными показателями АД (табл. 4). Однонаправлено изменялись и другие характеристики агрегации эритроцитов. Так, число эритроцитов, приходящихся на один агрегат достигало в среднем 7,89±0,22, что на 52% (Р 0,05) больше аналогичного показателя у лиц с нормальным АД (табл. 4).
Таким образом, установлено, что высокая агрегация сказывается на величине артериального давления. Следовательно, можно заключить, что более интенсивная агрегация эритроцитов у лиц с измененным артериальным давлением влияет на величину сосудистого сопротивления.
Полученные факты, свидетельствующие о разных величинах агрегации эритроцитов у лиц с нормальным, сниженным и повышенным артериальным давлением и наличие взаимосвязи агрегации с параметрами гемодинамики, обозначили задачи изучения механизмов изменения этой клеточной функции. Регулирующими сигнальными молекулами могут быть катехоламины.
Инкубация эритроцитов в среде, содержащей 0,45.10"8 М адреналина гидрохлорида, приводила к выраженному приросту агрегации клеток (табл. 5). На это указывало увеличение показателя агрегации на 87%. Если в контрольных пробах (при инкубации с буферным раствором) агрегировало около 10% клеточной популяции, то после инкубации в течение 15 минут с адреналином уже 19% клеток объединялись в агрегаты. Инкубация клеток с адреналином приводила к достоверному увеличению размеров агрегатов. Так, в контрольных пробах с буферным раствором на один агрегат приходилось в среднем 5,2 клетки. После инкубации с катехоламином произошло увеличение этого показателя на 30% (рис.3; табл. 5).
Методы макро- и микрогемореологических исследований
В эксперименте было отмечено значительное, на 41% (Р 0,05), и достоверное снижение показателя агрегации эритроцитов. Изменение числа клеток в агрегате было незначительным. Как видно из данных, приведенных в таблице 18, не было достоверных различий этого показателя до и после применения фактора агрегации. Большее влияние (по сравнению с воздействием папаверина) дБ-цАМФ оказывал на изменение скорости образования эритро-цитарных агрегатов. При этом эритроциты значительно медленнее собирались в агрегаты. Снижение составило 29% (Р 0,05) по сравнению с контрольными пробами. В этой связи необходимо отметить, что снижение всех аспектов агрегационного процесса указывало на усиление клеточного ответа при воздействии дБ-цАМФ на эритроциты по сравнению с папаверином.
В результате проведенного исследования было выявлено достоверное снижение показателя агрегации и числа клеток в агрегате при воздействии папаверина на эритроциты. При регистрации скорости агрегатообразования также отмечали её снижение в исследуемых пробах, но достоверных различий изменения этого показателя не было.
Оценивая влияние на эритроциты эуфиллина, также регистрировали изменение агрегационной способности эритроцитов. При этом достоверное снижение агрегационных свойств эритроцитов отмечали по показателю агрегации и числу клеток в агрегате. Вместе с тем, скорость образования эритро-цитарных агрегатов значительно и достоверно увеличилась (164%; Р 0,05).
Выявленный характер изменения агрегационного поведения эритроцитов при инкубации их с папаверином и эуфиллином свидетельствовал о чувствительности клеток к действию ингибиторов фосфодиэстераз.
Добавление к среде инкубации проникающего аналога цАМФ (дБ-цАМФ) приводило к угнетению процесса агрегации. При этом наибольшее снижение выявлено по показателю агрегации эритроцитов и скорости образования агрегатов. Оценивая такой показатель, как число клеток на агрегат, также зарегистрировано его снижение в исследуемых пробах. Статистически достоверных различий этого показателя не обнаружено.
Резюмируя вышеизложенное, можем констатировать, что в результате воздействия на эритроциты ингибитора активности фосфодиэстеразы- папаверина и при применении проникающего аналога цАМФ- дБ-цАМФ, наблюдалось снижение агрегации эритроцитов. Сравнительно низкие показатели агрегационной способности эритроцитов зарегистрированы при применении проникающего аналога цАМФ (табл. 18). Результаты, полученные при исследовании действия эуфиллина, свидетельствовали также об угнетении процесса агрегации. Анализ изменения агрегационных свойств эритроцитов при воздействии на них дротаверина выявил стойкое снижение способности эритроцитов к агрегации по показателю агрегации и числу клеток на агрегат. Кроме того, значительно снизилась скорость нарастания агрегационного процесса во времени (34%; Р=0,025). При этом отмечали, что дротаверин оказывал значительное ингибирующее влияние на агрегацию эритроцитов по сравнению с папаверином и эуфиллином. Сравнение ингибирующего действия папаверина, дротаверина и проникающего аналога цАМФ на агрегацию эритроцитов в заданных концентрациях представлено на рисунке 18.
Исследование общего реологического профиля крови, полученной от здоровых доноров, показало, что при среднем гематокрите, равном 43,55%, вязкость цельной крови при относительно большой скорости сдвига (скорость сдвига- 350- 400 1) составила 4,41±0,154 мПа.с (нормальные значения вязкости при высоких скоростях сдвига от 4 до 5 мПа.с, L. Dintenfass, 1981). При этом вязкость плазмы была равной 1,72 мПа.с. Относительно невысокие величины вязкости суспензии эритроцитов в буфере, средней концентрации гемоглобина в них (МСНС) и индекса ригидности (Tk) свидетельствовали об оптимальной деформируемости эритроцитов (табл. 19).
Значение концентрации общего белка плазмы крови находилось в пределах нормы и составляло 75,39+1,37 г/л. Содержание альбуминов и глобулинов в плазме соответствовало средним значениям. Таким образом, значе ниє альбумин-глобулинового коэффициента составило 1,61±0,154, что соответствовало норме. Концентрация глюкозы в плазме составляла 5,80110,249 мМ. Вышеперечисленные значения реологических характеристик крови обеспечивали поддержание оптимального уровня агрегации эритроцитов в данной серии исследования (табл. 19).
Изменение агрегации эритроцитов при воздействии на них катехоламинов (адреналина, норадреналина) и фенилэфина
Следует заметить, что современные представления о клеточной адгезии в значительной степени базируются на данных коллоидной химии о взаимодействии заряженных поверхностей в ионной среде. Конечный результат «игры» электростатических сил отталкивания и Ван-дер-ваальсовых сил притяжения зависит от содержания в перимембранном слое некоторых дива-лентных катионов, в частности Са и Mg . Они обладают способностью уменьшать электростатический потенциал, то есть плотность распределения отрицательных зарядов на локальных участках поверхностей контактирующих клеток. Известно, что концентрация двухвалентных катионов всего 2,5% уменьшает электростатические силы отталкивания на 25%. В связи с этим силы притяжения Ван-дер-Ваальса увеличиваются и обеспечивают слипание соседних клеток. Величина концентрации кальция в межклеточном окружении определяет плотность интерцеллюлярных связей. В свою очередь удаление кальция из жидкой среды приводит к разъединению эндотелиальных клеток в культуре тканей. Важная роль ионов кальция заключается в том, что он не только меняет заряды клеточной поверхности, но и участвует в стабилизации микроокружения клеток, представленного параплазмалеммальным слоем (В.В. Куприянов и др., 1975).
В ряде исследований (Э.Г. Гурман, 1990; A. Fleckenstein, 1983) отмечалось, что верапамил - один из антагонистов кальция в концентрации 10"5 М, полностью блокировал потенциалзависимые каналы клеточных мембран электрически возбудимых тканей. Кроме этого, инкубация тромбоцитов с ве-рапамилом в концентрации 10"4 М приводила к изменению их агрегации и интенсивности флуоресценции (П.В. Авдонин, М.Ю. Меньшиков, 1985).
На основании полученных нами результатов следует заключить, что снижение уровня внутриклеточного Са либо блокированием кальциевых каналов, либо снижением его концентрации в плазме сопровождается изменением агрегации эритроцитов. Стимулирование кальцием клеточной агрегации, возможно, связано с его кооперативным эффектом. Вместе с кальмо-дулином кальций влияет на состояние спектрина цитоскелета мембраны эритроцитов. Это приводит к повышению эластичности мембран и деформируемости клеток в целом (Т. Oonishi et al., 1997). Уменьшение концентрации кальция в среде инкубации за счет введения ЭДТА переводит кальмодулин в свободное от кальция состояние, при этом нарушаются гидрофобные взаимодействия этого белка с неполярными белками мембраны. В этих условиях содержание кальмодулина заметно уменьшается. На основе данных о Са2+-зависимом взаимодействии кальмодулина со спектрином, можно заключить, что уменьшение содержания кальмодулина нарушает состояние белков под-мембранного матрикса (Ю.В. Постнов, С.Н. Орлов, 1987).
С другой стороны, повышение уровня цАМФ (например, при инкубации эритроцитов с проникающим аналогом цАМФ) приводит к активации кальциевой АТФ-азы. Активаторы аденилатциклазы могут полностью блокировать вход Са2+ снаружи через плазматическую мембрану, а также подавлять мобилизацию кальция из внутриклеточных депо (П.В. Авдонин, Е.М. Бугрий, 1989).
Таким образом, в процессе агрегации два внутриклеточных посредни-ка: циклический АМФ и Са вступают в антагонистические отношения. Возможно, катехоламины через альфа-2-адренорецепторы ингибируют активность аденилатциклазы, что приводит к снижению уровня цАМФ и сти-мулированию входа Са внутрь клетки. Это сопровождается повышением агрегации эритроцитов (рис. 27.).
Как упоминалось, Са обладает стимулирующим действием на фосфо-диэстеразу цАМФ, поэтому он выполняет функцию регулятора цАМФ-опосредованных реакций, уменьшая накопление цАМФ. В некоторых клетках (например, кардиомиоцитах, гепатоцитах, клетках мозга) комплекс Са2+-калъмодулин стимулирует аденилатциклазу, что потенцирует цАМФ-опосредованные реакции (В.А. Ткачук, 1998). В других клетках этот комплекс ингибирует аденилатциклазу, что приводит к противоположному результату. Так в гладкомышечных клетках, лимфоцитах, лейкоцитах, тромбоцитах и, вероятно, эритроцитах существует антагонизм в действии факторов, активирующих аденилатциклазную и калъций-кальмодулиновую системы.
Стимулирующий агрегацию эффект проявился не только у катехола-минов, но и у синтетического аналога простагландина Фга— энзапроста. Было найдено, что инкубация эритроцитов с этим препаратом значительно повышала их агрегацию.
Сравнительный анализ показал, что агрегационный эффект энзапроста сопоставим с действием катехоламинов (рис. 24). Механизм стимулирующего действия энзапроста может быть связан с ингибированием активности аденилатциклазы и снижением уровня цАМФ в эритроцитах. Известно, что простагландин Ф2« ингибирует активность аденилатциклазы и стимулирует подъем концентрации цГМФ (И.С. Ажгихин, 1978). Однако вряд ли энза-прост оказывал прямое ингибирующее действие на внутриклеточную адени-латциклазу эритроцитов, поскольку простагландины распределяются в ли-пидном слое мембран и не проникают внутрь клеток (И.С. Ажгихин, 1978). Более вероятно то, что энзапрост стимулирует вход Са внутрь эритроцитов и через воздействие на кальмодулин и белки цитоскелета клетки изменяет мембранную вязкоэластичность (И.С. Ажгихин, 1978). Тем более наличие значительного вне- и внутриклеточного градиента ионов кальция создает простагландинам необходимые условия для проявления их специфической активности (Р. Эккерт и др., 1991).
Изменение агрегации эритроцитов при воздействии на них ингибиторами фосфодиэстераз (папаверином, эуфилином, дротаверином)
Корреляционный анализ показал, что практически отсутствовала достоверная взаимосвязь между скоростью агрегатообразования и уровнем глюкозы в плазме при исследовании интактных эритроцитов и инкубированных с энзапростом.
При анализе изменений параметров агрегации эритроцитов в условиях воздействия на них верапамилом было установлено снижение всех показателей этого процесса и наличие достоверных корреляций между показателем агрегации и размером одиночных агрегатов, а также между концентрацией глюкозы в плазме крови и скоростью агрегатообразования (табл. 25). Интересно отметить, что между размером агрегатов и концентрацией глюкозы в окружающей клетку среде (в плазме) имелась достоверная обратная корреляция (г=-0,595; Р=0,048). Имеются данные о важной роли в процессе клеточного взаимодействия олигосахаров, расположенных на внешних доменах трансмембранных белков. Олигосахариды являются носителями отрицательных зарядов (S. Humphreys, Т. Humphreys et al., 1977). Отрицательные заряды, экспонированные на наружной части мембраны эритроцитов, ответственны за поддержание клеток в дезагрегированном состоянии (G. Nash et al., 1987 and 1990). Имеются данные о том, что снижение величины этих зарядов путем химического удаления сиаловых кислот трипсином или нейраминидазой ведет к выраженному приросту агрегации эритроцитов (Н. Meiselman et al., 1993).
Таким образом, проведенное исследование показало, что агрегацию эритроцитов следует рассматривать как управляемый физиологический процесс, имеющий определенную адаптивную направленность. Среди гуморальных агентов можно выделить регулирующую роль адреналина, норадренали-на и фенилэфрина, а также сигнальную роль простагландина Ф2а, поскольку получен выраженный агрегационный ответ при воздействии на эритроциты энзапростом— синтетическим аналогом простагландина Ф2«.
Опыты с проникающим аналогом цАМФ и ингибиторами фосфодиэ-стераз ясно показали, что активность аденилатцтклазы и концентрация цАМФ существенным образом сказываются на агрегационном поведении эритроцитов. Наблюдения, сделанные при блокировании кальциевых каналов верапамилом или при связывании ионизированного кальция в плазме с помощью ЭДТА, свидетельствовали о сложных взаимоотношениях вторых внутриклеточных посредников (цАМФ и Са2+ ) при агрегации эритроцитов.
Нарушения в работе мембранных ионных каналов при действии фуро-семида и дигоксина сопровождались повышением агрегации эритроцитов. Это, вместе с ингибированием гликолиза инозином, свидетельствует о вкладе метаболического компонента в механизмы агрегационного поведения эритроцитов. 1. При разных функциональных состояниях сердечно-сосудистой системы в условиях сниженного и повышенного артериального давления величина агрегации эритроцитов достоверно отличается от данных лиц с нормальным уровнем артериального давления. Величина агрегации умеренно и положительно коррелирует с параметрами артериального давления. 2. Природные и синтетические катехоламины в микромолярных концентрациях стимулируют агрегацию эритроцитов, увеличивают размер агрегатов и скорость их формирования. Таким же стимулирующим эффектом обладает энзапрост - синтетический аналог простагландина Ф2а 3. Блокирование поступления кальция в эритроциты с помощью верапа-мила или связывание Са в суспензионной среде путем добавления в нее ЭДТА приводит к снижению интенсивности агрегатообразования эритроцитов и уменьшению размеров агрегатов. 4. Агрегация эритроцитов снижается при увеличении уровня циклического АМФ в их цитоплазме под действием ингибиторов фосфодиэстераз (папаверин, эуфиллин и дротаверин), а также при введении проникающего стабильного аналога цАМФ. Это свидетельствует о существенной роли внутриклеточной системы аденилатциклаза-цАМФ в регуляции процесса агрегации эритроцитов. 5. Ингибирование гликолиза в эритроцитах инозином и нарушение баланса ионного обмена в них при воздействии фуросемида и дигоксина, выраженно стимулируют их агрегацию. Это свидетельствует о роли мембранного транспорта и внутриклеточного метаболизма глюкозы в агрега-тообразовании.
