Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Агрегация белков 8
1.2. Общая характеристика белков теплового шока 11
1.3. Малые белки теплового шока 13
1.4. а-Кристаллин: структура, свойства и шапероноподобная функция 13
1.4.1. Сравнение структуры а-кристаллина и малых белков теплового шока 15
1.4.2. Олигомерная структура а-кристаллина 18
1.4.3. Стабильность а-кристаллина 20
1.4.4. Шапероноподобная активность а-кристаллина. Подавление агрегации белков а-кристаллином 21
1.5. р-Кристаллин хрусталика глаза быка: структура, термостабилыюсть 25
1.5.1. Влияние УФ-облучения на структуру и агрегацию р-кристаллина 27
1.6. Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа из мьшщ кролика: структура, термостабильность 28
1.7. Транскетолаза из Saccharomyces cerevisiae: структура, термостабильность 30
1.8. Алкогольдегидрогеназа I из Saccharomyces cerevisiae: структура, термостабильность 32
Глава 2. Материалы и методы 38
2.1. Материалы 38
2.1.1.Вьщелениеиочисткаа-иР-кристаллинов 38
2.1.2. Глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа 38
2.1.3. Транскетолаза из Saccharomyces cerevisiae 39
2.1.4. Очистка алкогольдегидрогеназы I из Saccharomyces cerevisiae 39
2.1.5. Рекомбинантный шаперон GroEL 39
2.2. Методы , 40
2.2.1. Электрофоретический анализ в ПААГ 40
2.2.2. Дифференциальная сканирующая калориметрия (ДСК) 40
2.2.3. Динамическое лазерное светорассеяние (ДЛС) 41
2.2.4. Изучение кинетики тепловой агрегации и ассоциации белков методом ДЛС , 44
2.2.5. Аналитическое ультрацентрифугирование 45
2.2.6. Определение активности глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы 45
2.2.7. Термоинактивация глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы 46
2.2.8. Определение активности алкогольдегидрогеназы I из Saccharomyces cerevisiae 46
2.2.9. УФ-обдучение Р-кристаллина 47
Глава 3. Результаты и обсуждение 49
3.1. Исследование стабильности а-кристаллина в процессе нагревания 49
3.2. Тепловая денатурация и агрегация pL-кристаллина 55
3.2.1. Электрофррез препарата pL-кристаллина в ПААГ 55
3.2.2. Седиментационный анализ препарата Рь-кристаллина 55
3.2.3. Тепловая денатурация PL-кристалина в отсутствие и в присутствии а-кристаллина 56
3.2.4. Кинетика тепловой агрегации Рь-кристаллина .' 57
3.2.5. Влияние а-кристаллина на кинетику агрегации PL-кристаллина 65
3.2.6. Агрегация УФ-облученного Рь-кристаллина. Влияние а-кристаллина 73
3.3. Тепловая денатурация и агрегация глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы (ГАФД) 77
3.3.1. Тепловая денатурация ГАФД 77
3.3.2. Седиментационный анализ ГАФД 78
3.3.3. Исследование кинетики агрегации ГАФД при различных температурах 80
3.3.4. Зависимость кинетики агрегации ГАФД от концентрации белка при 55 С 83
3.3.5. Корреляция между тепловой агрегацией и инактивацией ГАФД 86
3.3.6. Корреляция между тепловой денатурацией и агрегацией ГАФД 87
3.3.7. Влияние а-кристаллина на тепловую денатурацию ГАФД 91
3.3.8. Седиментационный анализ ГАФД в присутствии а-кристаллина 92
3.3.9. Влияния а-кристаллина на процесс тепловой инактивации ГАФД 93
3.3.10. Влияние а-кристаллина на кинетику тепловой агрегации ГАФД при 45 и 55 С 95
3.3.11. Влияние а-кристаллина на тепловую агрегацию ГАФД при нагревании с постоянной скоростью 105
3.3.12 Влияние GroEL на кинетику тепловой агрегации ГАФД при 45 С 114
3.4. Тепловая агрегация транскетолазы из Saccharomyces cerevisiae 120
3.4.1. Кинетика агрегации магниевой и кальциевой форм холофермента ТК при нагревании с постоянной скоростью 120
3.4.2. Кинетика агрегации магниевой и кальциевой форм холофермента ТК при постоянной температуре 122
3.5. Тепловая денатурация и агрегация алкогольдегидрогеназы I из Saccharomyces cerevisiae 127
3.5.1. Тепловая денатурация алкогольдегидрогеназы 127
3.5.2. Тепловая денатурация алкогольдегидрогеназы в присутствии а-кристаллина 130
3.5.3. Кинетика тепловой агрегации алкогольдегидрогеназы 130
3.5.4. Влияние а-кристаллина на кинетику агрегации алкогольдегидрогеназы 138
3.5.5. Влияние а-кристаллина на тепловую агрегацию АДГ І в режиме нагревания с постоянной скоростью 142
3.5.6. Корреляция между тепловой денатурацией и агрегацией АДГ 1 145
3.5.7. Моделирование трехмерной структуры АДГ I из Saccharomyces cerevisiae 147
Заключение..., 150
Выводы 154
Список литературы 156
- Общая характеристика белков теплового шока
- Динамическое лазерное светорассеяние (ДЛС)
- Кинетика тепловой агрегации Рь-кристаллина .'
- Влияние а-кристаллина на кинетику агрегации PL-кристаллина
Введение к работе
Неправильный фолдинг и агрегация белков сопровождаются образованием нерастворимых внутриклеточных структур. В связи с тем, что в основе патогенеза значительной части дегенеративных и нейродегенеративных, так называемых «конформационных» заболеваний человека лежат изменения вторичной и/или третичной структуры белков, приводящие к формированию нерастворимых агрегатов с различной надмолекулярной организацией [Fink, 1998; Dobson, 1999; Kopito, 2000; Bucciantini et al., 2002; Bloemendal et al., 2004; Маркосян и Курганов, 2004; Wickner et al., 1999], изучению агрегации белков уделяется большое внимание. Проблему агрегации белков приходится учитывать не только в медицине, но и при решении биотехнологических задач, поскольку рекомбинантные белки также часто агрегируют. В физиологических условиях белковые агрегаты не накапливаются в клетках благодаря существованию внутриклеточного механизма «контроля качества» ("quality control") белков, который осуществляется в результате совместного действия шаперонов и протеиназ [Hammond and Helenius, 1995; Brodsky and McCracken, 1999]. а-Кристаллин, основной белок хрусталика глаза млекопитающих, являясь представителем семейства малых белков теплового шока, обладает шапероноподобной активностью, способен к образованию устойчивых растворимых комплексов с денатурированными белками и, таким образом, подавляет их агрегацию [Putilina, 2003]. В хрусталике а-кристаллин обеспечивает защиту Р- и у-кристаллинов от ультрафиолетового облучения и окислительного стресса, повреждающих эти кристаллины и приводящих к развитию катаракты [Lee, 1998]. Образование а/у и а/р комплексов в хрусталике глаза играет важную роль в поддержании его прозрачности и светопреломляющих свойств. Повышенная экспрессия а-кристаллина обнаруживается также во многих тканях в условиях стресса и при различных патологиях. В связи с обнаружением того, что а-кристаллин in vitro обладает шапероноподобной активностью, появились многочисленные работы по изучению его влияния на денатурацию и агрегацию различных белков и ферментов[Ноок and Harding, (1998); Boyle and Takemoto, 1994; Horwitz, 1992b; Abgar, 2001; Wang and Spector, 1994; Raman, 1995]. Было установлено, что шапероноподобная активность а-кристаллина зависит от многих факторов, включая температуру инкубации, скорость нагревания и концентрацию [Horwitz, 1992b]. Показано также, что подавление тепловой агрегации белков а-кристаллином является результатом гидрофобных взаимодействий [Wang and Spector 1994; Surewicz and Olesen 1995] и при повышении температуры шапероноподобная активность сс-кристаллина возрастает [Wang and Spector 1994; Surewicz and Olesen, 1995; Putilina, et. al., 2003; Raman et. al., 1995; Datta and Rao, 1999; Raman and Rao, 1997]. Тем не менее, несмотря на многочисленные исследования по взаимодействию а-кристаллина с белковыми субстратами при нагревании, механизм подавления тепловой агрегации белков а-кристаллином остается невыясненным.
Целью настоящей работы является изучение механизма тепловой денатурации и агрегации белков и изучение механизма подавления агрегации белков а-кристаллином. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
Изучить кинетику тепловой агрегации pL-кристаллина из хрусталика глаза быка при 60 С и агрегацию УФ-облученного Рь-кристаллина при 37 С.
Изучить кинетику тепловой агрегации глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы из мышц кролика.
Изучить кинетику агрегации алкогольдегидрогеназы I из Saccharomyces cerevisiae.
Изучить и провести сравнительный анализ влияния а-кристаллина на кинетику тепловой агрегации Рь-кристаллина, глицеральдегид-3-фосфат-дегидрогеназы и алкогольдегидрогеназы I.
Исследовать агрегацию магниевой и кальциевой холоформ транскетолазы из Saccharomyces cerevisiae в процессе нагревания.
Научная новизна и практическое значение.
При анализе данных по кинетике агрегации белков, полученных методом динамического лазерного светорассеяния (ДЛС) впервые проведено систематическое рассмотрение графиков зависимости интенсивности светорассеяния от гидродинамического радиуса (Rh). Установлен линейный характер начальных участков этих зависимостей, что обеспечивает простой способ оценки размера стартовых агрегатов. Разработан метод определения длительности лаг-периода, на протяжении которого происходит формирование стартовых агрегатов.
На основании изучения кинетики агрегации белков методом ДЛС сформулирован новый механизм агрегации белков, включающий стадии разворачивания белковой молекулы, формирования стартовых агрегатов и роста фрактального агрегата путем слипания стартовых агрегатов.
Установлен механизм подавления агрегации белков в присутствии а-кристаллина. Показано, что агрегация белков подавляется в результате уменьшения размера стартовых агрегатов. Вероятность слипания при соударении таких частиц становится меньше единицы.
Показано, что анализ зависимости гидродинамического радиуса от времени позволяет выявить белки, которые в развернутом состоянии проявляют шапероноподобную активность (то есть защищают себя от агрегации). Примером может служить алкогольдегидрогеназа I из Saccharomyces cerevisiae.
Результаты, полученные методами ДЛС и ДСК при нагревании ГАФД с постоянной скоростью, позволили установить корреляцию между тепловой агрегацией и денатурацией белков (ГАФД). Методом седиментационного анализа показана диссоциация тетрамерного фермента ГАФД при повышенных температурах.
Понимание процессов формирования белковых агрегатов в клетке открывает новые перспективы в исследовании и лечении так называемых "конформационных" заболеваний. Исследование шапероноподобной активности а-кристаллина может способствовать выяснению его разнообразных функций в различных тканях в норме, в условиях стресса и при различных патологических нарушениях. Результаты исследований механизма агрегации белков и механизма шапероноподобной активности а-кристаллина можно использовать в работах по поиску химических агентов, которые блокируют агрегацию и модулируют защитное действие а-кристаллина.
Общая характеристика белков теплового шока
В клетках прокариот и эукариот в ответ на стресс (тепловой, окислительный или токсический) синтезируются белки теплового шока «heat shock proteins (Hsps)» игрющие роль молекулярных шаперонов, которые взаимодействуют с развернутыми полипептидными цепями, предотвращают их необратимую агрегацию, участвуют в фолдинге и сборке белков и предохраняют клетки от вызываемых стрессом повреждений [Hendrick and Hartl, 1993; Becker and Craig, 1994; Fink, 1999; Frydman, 2001; Soti et al., 2005; Borges and Ramos, 2005]. Шапероны непосредственно участвуют в контроле структуры белка, его функции, локализации и транспорте. Шапероны участвуют также в таких процессах, как секреция белка, ядерный транспорт, пути передачи сигнала через стероидные рецепторы и рецепторы Т-клеток, в мультимерной сборке комплексов гистосовместимости и бактериальной вирулентности [Kelley and Georgopoulos, 1992].
По структурным и функциональным характеристикам молекулярные шапероны классифицируют на шесть основных семейств: HsplOO (ClpA/B/X, HslU), Hsp90 (HtpG), Hsp70 (DnaK), Hsp60 (GroEL), Hsp40 (в скобках приведены названия шаперонов соответствующих классов из Escherichia colt) и малые белки теплового шока (sHsps). В клетках млекопитающих преобладают белки теплового шока Hsp60, Hsp70 и Hsp90 -[Bukau and Horwich, 1998; Wegele et al., 2004; Mayer and Bukau, 2005]. Шаперон Hsp90 является основным компонентом цитозоля клеток эукариот [Smith et al., 1998], где он стабилизирует неправильно свернутые белки и регулирует активность сигнальных белков, включая рецепторы стероидных гормонов, тирозинкиназу, NO-синтазу и кальцинейрин [Young and Haiti, 2002]. Шапероны Hsp70 и Hsp60 обратимо взаимодействуют с развернутыми или частично свернутыми интермедиатами фолдинга, защищают их поверхности от «ошибочных» внутримолекулярных и межмолекулярных взаимодействий и спосбствуют фолдингу полипептидных цепей [Hartl, 1996; Bukau and Horwich, 1998]. Шаперон Hsp70 ((DnaK) с кошапероном Hsp40 (DnaJ) обнаруживаются во многих клеточных компартментах, где они способствуют стабилизации и фолдингу белков [Bukau and Horwich, 1998]. Hsp70 содержит консервативный N-терминальный АТФ-азный домен, который связывается с молекулой АТФ и гидролизует ее и С-терминальный субстрат-связывающий домен [Hartl, 1996; Minami et al., 1996]. Энергия, высвобождающаяся при гидролизе АТР с участием DnaK, используется для повторных циклов связывания и высвобождения полипептидов [Bukau and Horwich, 1998; Schiene-Fischer et al., 2002]. Шаперонин Hsp60 (GroEL) - белковый комплекс, состоящий из 14 идентичных 57 кДа-субъединиц, образующих два гептамерных кольца с большой полостью в центре, в которой подвергаются фолдингу развернутые полипептиды [Braig et al., 1994; Bukau and Horwich, 1998]. Каждая субъединица GroEL состоит из двух отдельных доменов (экваториального и верхушечного), соединенных промежуточным петлеобразным доменом [Braig et al., 1994]. Экваториальный домен GroEL содержит участок связывания АТР. Верхушечный домен содержит остатки гидрофобных аминокислот, экспонированные в полость цилиндра и связывающиеся путем гидрофобных взаимодействий с несвернутыми полипептидными субстратами [Chen and Sigler, 1999]. Субстрат-связывающие аминокислотные остатки верхушечного домена GroEL ответственны также за взаимодействие GroEL с кошапероном GroES, регулирующим АТР-азную активность GroEL, необходимую для опосредованного GroEL фолдинга белков [Haiti, 1996; Bukau and Horwich, 1998; Hartl and Hayer-Hartl, 2002].
Малые белки теплового шока (sHsps) - большая гетерогенная группа, объединяющая в своем составе белки с молекулярными массами от 12 до 40 кДа, экспрессируются практически во всех живых организмах и участвуют в стабилизации белков в условиях стресса [Haslbeck, 2002; Гусев, 2002; Панасенко, 2003; Карре et al., 2003]. Эти отличающиеся по структуре белки объединены в одну группу на основании содержащегося в их структуре высоко консервативного участка, впервые обнаруженного в а-кристаллине хрусталика глаза и названного а-кристаллиновым доменом [Ingolia and Craig, 1982]. а-Кристаллиновый домен, состоящий из 80-100 аминокислотных остатков, локализован на С-конце sHsps и участвует в формировании стабильных димеров [van Monfort et al., 2001; Lambert et al, 1999].
Вариабельный N-терминальный домен sHsps обеспечивает образование высокомолекулярных олигомеров [van Monfort et al., 2001; Lambert et al, 1999]. Все малые белки теплового шока образуют динамичные олигомерные структуры (300-800 кДа), содержащие от 9-й до 50-и субъединиц и большей частью не обладают определенной четвертичной структуры. Олигомеризация является необходимым условием для функционирования sHsps [MacRae, 2000; Clark and Muchowski, 2000; Giese and Vierling, 2002; Stromer et al., 2003].
Общим свойством большей части sHsps, включая а-кристаллин, является их способность к образованию растворимых комплексов с денатурированными белками и предотвращение преципитации белков. Это свойство названо шапероноподобной активностью. Hsps временно связываются с развернутыми белками, стабилизируют их и «передают» АТР-зависимым шаперонам Hsp70/Hsp40, которые обеспечивают рефолдинг [Horwitz, 1992; Smith et al., 1998; Clark and Muchowski, 2000]
Динамическое лазерное светорассеяние (ДЛС)
Динамическое лазерное светорассеяние широко используется для определения размера наночастиц в анализируемой суспензии по измерению динамики флуктуации (колебаний) интенсивности рассеянного света. Коллоидные частицы или макромолекулы, суспендированные в жидкости, находятся в хаотическом броуновском движении, которое вызывает флуктуации в локальном участке сконцентрированных частиц, приводящие к локальной неоднородности показателя преломления и соответственно - флуктуации интенсивности рассеянного света при прохождении лазерного луча через такую среду. Это, в свою очередь, приводит к, так называемому, рэлеевскому (или избирательному) рассеянию (рассеяние света частицами, имеющими размер намного меньше длины световой волны, называют рэлеевским).
Схематическое представление флуктуации интенсивности светорассеяния, регистрируемых в малом объеме в микросекундном временном интервале. (Б) Схематическое представление автокорреляционной функции С(т). Представленная зависимость автокорреляционной функции (7(т) флуктуации интенсивности рассеянного света (Рис. 8) - есть функция от времени т, которая может быть представлена в виде дифференциального уравнения первого порядка: G(T) = &[l+sexp(/Tc)], (1) где базовый ("случайный") уровень корреляции Ь пропорционален полной интенсивности /. Коэффициент є зависит от количества рассеянного света и от апертуры, и этот коэффициент всегда меньше единицы. Коэффициент диффузии D частиц, главным образом, связан со скоростью затухания тс корреляционной функции, зависящей от времени: где к - модуль волнового вектора рассеяния, к = sin—, п - показатель преломления растворителя, X - длина волны рассеиваемого излучения в вакууме, и 9 - угол регистрации рассеянного света. Уравнение (2) следует из преобразования Фурье, общего уравнения диффузии, описывающего перемещение частицы на величину 2п/к [Photon Correlation and Light Beating Spectroscopy, 1974; Клюева и др., 2002]. Для сферических частиц одинакового размера, находящихся в среде с известной динамической вязкостью ц, можно определить величину гидродинамического радиуса R, используя соотношение Стокса-Эйнштейна: где в - постоянная Больцмана, Т - абсолютная температура -вязкость растворителя при температуре Т. Размер частицы, вычисляемый из уравнения (3), назван гидродинамическим радиусом, так как его размер превышает размер простой частицы вследствие возможного образования слоев растворителя, молекул сурфактанта, или (для заряженных частиц) адсорбируемых ионов. В большинстве случаев эти слои прибавляют незначительную поправку к размеру, за исключением измерения частиц малых размеров. Уравнения (1) и (2) действительны для невзаимодействующих сферических частиц. Если частицы вовлечены в процесс агрегации, эти уравнения можно применять, для оценки изменения кажущегося ("эффективного") размера частицы, в том случае, если характерное время кинетики агрегации намного больше времени измерений.
Исследования проводили при помощи коммерческой установки фотометра рассеянного лазерного света Photocor (Photocor Instruments Inc., USA; www.photocor.com), с He - Ne лазером, мощностью 10 мВт и длиной волны падающего света 632.8 нм (Когерентный, США, модель 31-2082) (рис. 9). Особенность установки Photocor в том, что - это многофункциональное оборудование для изучения как статического (интенсивность) так и динамического (корреляционная функция, зависимая от времени) светорассеивания [Yudinetal., 1997]. Рис.9. Установка Photocor - прибор для измерения статического и динамического лазерного светорассеивания.
Оптическая платформа и точный гониометр (устройство поворота луча) размещаются на устойчивой основе. Не - Ne лазер и фокусирующая система установки -зафиксированы на оптической платформе. Термостат и кюветный держатель анализируемого образца - симметрично рассположены на гониометре. Температура контролируется с помощью ПИД (пропорционально-интегрально-дифференциального) регулятора PhotoCorC, с точностью до ± 0.1 С. Фотоприемник (счетчик фотонов модели "PhotoCor-РСЗ") находится на вращающемся рычаге гониометра и состоит из сменной системы отверстий, необходимой для подбора апертуры нужного диаметра, фотоэлектронного умножителя с низким уровнем шумов (ФЭУ) и усиливающего фотодетектора. Чтобы избежать последующих искажений поступающего сигнала, используется квазикорреляционная схема с двумя ФЭУ. Сигнал, идущий от фотоумножителя представлен в виде последовательности стандартных импульсов. Далее сигнал анализируется коррелятором Photocor-FC, помещенный в виде единичной платы в персональный компьютер. Коррелятор - это 288-канальное устройство, выполняющее обработку данных в реальном времени и накопление корреляционной функции интенсивности рассеянного света. Коррелятор Photocor-FC имеет два режима управления временной шкалы. Первый, линейный способ управления - с равноудаленными точками измеренной корреляционной функции. И второй, так называемый, "multipleau" способ - с логарифмическим расположением точек корреляции во времени. Управление коррелятора в режиме "multipleau" не нуждается ни в какой настройке шкалы времени и подходит для определения размеров частиц с полимодальным распределением. Линейная шкала коррелятора позволяет достигнуть максимальной точности определения размеров частиц, имеющих узкое мономодальное распределение. Кросскорреляционная система и быстрый коррелятор дают возможность измерять частицы в очень широком диапазоне от 1 нм до 5 мкм. Персональный компьютер выполняет анализ данных и контролирует работу прибора, с помощью установленной программы PhotoCor версии 5.3.3. Анализ корреляционных функций для полидиссперстных частиц выполнялся при помощи программного обеспечения DynaLS (Alango, Израиль), версии 2.5.2.
Кинетика тепловой агрегации Рь-кристаллина .'
Кинетика тепловой агрегации Рь-кристаллина была исследована методом ДЛС. Метод позволяет регистрировать размеры образующихся частиц в процессе нагревания. На рис. 19А показаны типичные автокорреляционные функции, измеренные в разные промежутки времени инкубации Рь-кристаллина (0.4 мг/мл) в 40 мМ Na-фосфатном буфере, рН 6.8, содержащем 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 3 мМ NaN3 при 60 С. Распределение белковых агрегатов по размерам, полученное из исходных автокорреляционных функций с помощью программы DynaLS, представлены на рис. 19Б. Следует отметить, что функция распределения для Рь-кристаллина остается унимодальной на протяжении всей агрегации.
В связи с тем, что метод ДЛС позволяет одновременно регистрировать и изменение интенсивности светорассеяния (Г), и значение гидродинамического радиуса (/?h) агрегатов, кинетику агрегации рь-кристаллина можно охарактеризовать в следующих координатах: время, гидродинамический радиус и интенсивность светорассеяния. На рис. 20 представлен график, полученный для агрегации рь-кристаллина при концентрации 0.4 мг/мл. При значениях времени выше 63 мин, происходит падение интенсивности светорассеяния (данные не показаны) вследствие преципитации агрегатов крупных размеров. Проекции кинетической кривой, на плоскость XY, XZ, и YZ дают зависимости i?h от t, I от t, и / от Rh, соответственно. Особый интерес вызывает проекция на плоскость YZ. Анализ характера зависимости интенсивности светорассеяния от гидродинамического радиуса для агрегации белков проведен нами впервые. График указывает на то, что в момент начального прироста интенсивности светорассеяния в системе присутствуют довольно крупные частицы, которые мы назвали стартовыми агрегатами. Их размер легко определяется по точке пересечения кривой с осью абсцисс.
Тепловая агрегация Рь-кристаллина (0.4 мг/мл) при 60 С (40 мМ Na-фосфатный буфер, рН 6.8, содержащий 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 3 мМ Naty). Автокорреляционные функции интенсивности g( \т) (А) и распределение частиц по размерам (Б), регистрируемые в разные промежутки времени инкубации: (1) 15, (2) 20, (3) 30 и (4) 50 мин.
Такой анализ был проведен для разных концентраций Рь-кристаллина в интервале от 0.025 до 0.4 мг/мл. Зависимость интенсивности светорассеяния (Г) от времени (рис. 21 А) и зависимость гидродинамического радиуса (Rh) от времени (рис. 21 Б) были получены при 60С в выбранном диапазоне концентраций Рь-кристаллина. Чем выше концентрация фермента, тем больше прирост интенсивности светорассеяния (рис. 21 А). Увеличение размеров Rh во времени (рис. 21 Б) становится более выраженным с увеличением концентрации рь-кристаллина. Рис. 20. Трехмерный график, демонстрирующий изменение интенсивности светорассеяния и гидродинамического радиуса (i?h) во времени на примере агрегации Рь-кристаллина (0.4 мг/мл) при 60 С. Ось X - время, ось Y - /?ь, и ось Z - интенсивность светорассеяния. Проекция графика на плоскость XY показьшает зависимость Ль от времени, на плоскость XZ - зависимость интенсивности светорассеяния от времени и на плоскость YZ - зависимость интенсивности светорассеяния от /?ь- Кривая на проекции XY рассчитана по уравнению (6).
На рис. 22А представлены зависимости / от R для указанных концентраций рь-кристаллина. Эти зависимости имеют линейные участки для выбранного диапазона значений Rh. Точка пересечения оси абсцисс (ось /?ь) с прямой линией соответствует размеру стартовых агрегатов, обнаруженных в момент начального прироста интенсивности светорассеяния. Гидродинамический радиус стартовых агрегатов был обозначен нами как /?h,o- Все зависимости / от Rh, полученные для разных концентраций Рь-кристаллина, отсекают одну и ту же величину на оси абсцисс (рис. 22А). Это указывает на то, что размер стартового агрегата /?ь,о не зависит от концентрации Рь-кристаллина и приближается к среднему значению 84 ± 4 нм.
Влияние а-кристаллина на кинетику агрегации PL-кристаллина
Влияние а-кристаллина на кинетику агрегации Рі.-кристаллина (0.4 мг/мл) при 60 С. Зависимости интенсивности светорассеяния (I) от времени (рис. А-Д) и зависимости гидродинамического радиуса (/?(,) от времени (рис. Е-К), полученные при различных концентрациях а-кристаллина: А и Е, 0.025 мг/мл; Б и Ж, 0.05 мг/мл; В и 3, 0.1 мг/мл; Г и И, 0.15 мг/мл; Д и К, 0.8 мг/мл. Пунктирные линии соответствуют агрегации Рь-кристаллина в отсутствие а-кристаллина. Вставки показывают зависимости / от / (рис. Г и Д) и /?h от / (рис. И и К) в растянутом интервале времени. (1) и (2) - базовые агрегаты и суперагрегаты, соответственно. Начальные участки зависимости R от t (рис. Е-И) описываются уравнением (8). С увеличением концентрации а-кристаллина (0.05 мг/мл; рис. 25Ж) унимодальный рост агрегатов в определенный момент времени (при / 25 мин) переходит в бимодальный и регистрируются два типа частиц. В дополнение к базовым агрегатам (кривая 1) в системе образуются агрегаты более крупного размера - суперагрегаты (кривая 2). Первые представляют собой стабильные агрегаты, размеры которых остаются постоянными во времени. Агрегаты другого типа (суперагрегаты) увеличиваются в процессе нагревания до крупных размеров, склонных к преципитации. Время, при котором функция распределения белковых агрегатов по размерам становится бимодальной, обозначено как 1 . Значение J?h для базовых агрегатов при f = /cnt обозначено как i?h,cnt- При концентрации а-кристаллина, равной 0.05 мг/мл, i?h,cntw 250 нм. Бимодальное распределение белковых агрегатов по размерам наблюдается также при повышении концентрации а-кристаллина до 0.1 мг/мл (рис. 253) и 0.15 мг/мл (рис. 25И). Увеличение концентрации а-кристаллина приводит к увеличению значения tan (/crit 65 и 80 мин при концентрациях а-кристаллина, равных 0.1 и 0.15 мг/мл, соответственно). Значения Rh,ait соответственно равны 250 и 35 нм (см. Таблицу 2). Суперагрегаты появляются при / tan- В присутствии двукратного избытка а-кристаллина (0.8 мг/мл) расщепления агрегатов на две популяции не происходит и гидродинамический радиус базовых агрегатов при длительной инкубации приближается к предельному значению 18.7 ± 0.1 нм (рис. 25К).
Для того, чтобы охарактеризовать влияние а-кристаллина на начальную стадию агрегации pL-кристаллнна, мы проанализировали начальные участки кинетической кривой агрегации. На трехмерном графике (рис. 26) показан начальный участок кинетической кривой агрегации pL-кристаллина (0.4 мг/мл), полученной в присутствии а-кристаллина с концентрацией, равной 0.1 мг/мл. Тот факт, что начальное значение интенсивности светорассеяния больше нуля, связан с присутствием в системе а-кристаллина. С помощью метода ДЛС были выполнены эксперименты, позволяющие оценить размер а-кристаллина и изменение его состояния в процессе нагревания (рис. 13). В начальный момент измерения значение Ru для а-кристаллина составляло 10.5 ± 0.2 нм (40 мМ Na-фосфатный буфер, рН 6.8, содержащий 100 мМ NaCl, 1 мМ ЭДТА и 3 мМ Naty). При 60 С величина i?h незначительно изменялась и достигала размера 11.5 ± 0.2 нм. Таким образом, нагревание а-кристаллина при определенных условиях не приводит к формированию агрегатов больших размеров. Анализ зависимости интенсивности светорассеяния от Rh (XZ проекция в трехмерном графике, рис. 26) для агрегации Рь-кристаллина в присутствии 0.1 мг/мл а-кристаллина показывает, что увеличение / становится заметным только при значениях /?h 25 нм. Таким образом, гидродинамический радиус стартовых агрегатов равен 25 нм. Как видно из проекции XY, увеличение R\, происходит во времени монотонно. Величина /?и достигает уровня R = 25 нм при t = 14 мин. Это время характеризует продолжительность латентной стадии (to = 14 мин). Точка перегиба на кривой зависимости интенсивности светорассеяния от времени (XZ проекция) наблюдается также при/= 14 мин.
Трехмерный график, демонстрирующий рост интенсивности светорассеяния и гидродинамического радиуса (/?(,) в ходе агрегации Рі.-кристаллина (0.4 мг/мл) при 60 С в присутствии а-кристаллина (0.1 мг/мл). Пунктирная линия на проекции XY соответствует значению Rh стартового агрегата (/?h 0 = 25 нм).
