Введение к работе
Актуальность проблемы. Неблагоприятные условия в клетках (например, тепловой шок) могут приводить к разворачиванию и агрегации белков. Накопление агрегированных белков сопровождается образованием нерастворимых внутриклеточных структур. Проблему агрегации белков необходимо учитывать при решении биотехнологических задач, в частности, при ренатурации рекомбинантных белков в нативную форму из телец включения.
Содержание таких белков, как аспартатаминотрансфераза (Ь-аспартат-2-
оксоглутаратаминотрасфераза, КФ 2.6.1.1, ААТ) и глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа
(ГАФД; КФ 1.2.1.12), в клетках животных очень высоко. ААТ, пиридоксальфосфат-
зависимый фермент, участвует в метаболизме азота в клетках, катализируя обратимый
перенос аминогруппы с L-аспарагиновой кислоты на 2-кетоглутаровую кислоту с
образованием щавелевоуксусной и L-глутаминовой кислот. Митохондриальная
аспартатаминотрансфераза (мААТ) - димер с молекулярной массой 90 кДа, образованный
двумя идентичными субъединицами. ГАФД, NAD -зависимый фермент, катализирует
один из ключевых этапов гликолиза: реакцию окислительного фосфорилирования
глицеральдегид-3-фофата в 1,3-дифосфоглицерат. ГАФД - тетрамерный фермент с
молекулярной массой 144 кДа, состоящий из идентичных субъединиц. Среди большого
ряда алкогольдегидрогеназ (АДГ) наиболее широко распространены цинк-содержащие
ферменты. Эта группа ферментов встречается в клетках прокариот и эукариот.
Алкогольдегидрогеназа I (АДГ I) из дрожжей Saccharomyces cerevisiae (алкоголь : NAD+
оксидоредуктаза, КФ 1.1.1.1) - тетрамерный фермент (150 кДа), состоящий из идентичных
субъединиц, каждая из которых содержит по два иона Zn . Изучение механизмов
агрегации этих белков, различающихся функцией, структурой, тканевой и
внутриклеточной локализацией, представляется очень важным.
В ответ на стресс (тепловой, окислительный или токсический) в клетках прокариот и эукариот синтезируются белки теплового шока «heat shock proteins (Hsps)», играющие роль молекулярных шаперонов. Функции шаперонов состоят в том что они взаимодействуют с развернутыми полипептидными цепями, предотвращая их необратимую агрегацию, участвуют в фолдинге и сборке белков и предохраняют клетки от вызываемых стрессом повреждений. а-Кристаллин, основной белок хрусталика глаза млекопитающих, являясь представителем семейства малых белков теплового шока (shsps), обладает антиагрегационной активностью, способен к образованию устойчивых растворимых комплексов с денатурированными белками и, таким образом, подавляет агрегацию развернутых форм белков. В работах Е.А. Хановой с соавторами (Khanova et
al., 2005) и A.B. Меремьянина с соавторами (Meremyanin et al., 2008) показано, что подавление агрегации белков а-кристаллином обусловлено переходом процесса агрегации из диффузионно-контролируемого режима в кинетический режим, для которого вероятность слипания сталкивающихся частиц меньше единицы. Это показано на примере подавления тепловой агрегации ГАФД и гликогенфосфорилазы Ъ из скелетных мышц кролика и Рь-кристаллина. Представляло интерес выяснить, выполняется ли подобный механизм защитного действия а-кристаллина для других белковых субстратов и насколько он общий.
GroEL, представитель семейства шаперонинов 60, в клетках участвует в фолдинге белков. Известно, что GroEL проявляет способность подавлять агрегацию белковых субстратов, однако, механизм защитного действия GroEL оставался невыясненным. Поскольку способность взаимодействовать с развернутой формой белков проявляют шапероны различных классов, актуальным является проведение сравнительных исследований механизмов защитного действия различных шаперонов.
Цель работы. Целью настоящей работы является выявление кинетических закономерностей и механизма тепловой агрегации белков, приводящей к образованию аморфных агрегатов, в отсутствие и в присутствии шаперонов, взаимодействующих с развернутыми формами белков. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
изучить кинетику тепловой инактивации, денатурации и агрегации митохондриальной аспартатаминотрансферазы (мААТ) из сердца свиньи;
для получения более детальной информации о начальной стадии процесса тепловой агрегации белков подобрать условия агрегации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы (ГАФД) из скелетных мышц кролика, при которых возможна одновременная регистрация исходной (нативной) формы белка и белковых агрегатов;
с использованием в качестве белковых субстратов мААТ и ГАФД изучить влияние а-кристаллина, представителя семейства малых белков теплового шока, и GroEL, представителя семейства шаперонинов 60, на тепловую агрегацию белков;
проверить наличие шапероноподобной активности у дрожжевой алкогольдегидрогеназы I с использованием тест-системы, основанной на агрегации УФ-облученного [3-кристаллина при 37 С.
Научная новизна. На основании сопоставления процессов тепловой инактивации и денатурации мААТ сделан вывод о том, что инактивация фермента характеризуется более высокой скоростью по сравнению со скоростью денатурации белка. Это указывает на более высокую чувствительность активного центра фермента к денатурирующим воздействиям по сравнению с целой белковой глобулой. Установлено, что тепловая агрегация мААТ протекает в диффузионно-контролируемом режиме.
Подобраны условия агрегации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы, которые позволили доказать, что образование стартовых агрегатов из денатурированных молекул белка происходит по принципу «все-или-ничего», без образования интермедиатов.
Проведено сравнение механизмов подавления агрегации белков а-кристаллином и GroEL — белками, относящимися к различным классам шаперонов. Установлено, что а-кристаллин и GroEL препятствуют агрегации белков (мААТ и ГАФД) путем изменения кинетики агрегации из диффузионно-контролируемого режима в режим агрегации, характеризующийся вероятностью слипания частиц при столкновении, меньшей, чем единица.
Показано, что необычная кинетика тепловой агрегации алкогольдегидрогеназы I, проявляющаяся в экспоненциальной зависимости гидродинамического радиуса белковых агрегатов от времени, объясняется наличием шапероноподобной активности у нативного фермента.
Практическое значение работы. Понимание механизма агрегации белков позволяет предложить количественные методы оценки скорости агрегации, которые могут быть использованы для отбора агентов, эффективно подавляющих агрегацию белков. Понимание механизма защитного действия шаперонов различных классов может служить основой для поиска антиагрегационных агентов, которые, подобно шаперонам, будут оказывать защитное действие путем уменьшения вероятности слипания сталкивающихся частиц. Агенты подобного рода могут найти применение при решении биотехнологических задач и при создании препаратов медицинского назначения.
Апробация работы. Результаты диссертационной работы были представлены на XIII Международной конференции студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов— 2006» (Москва, 2006), III Международном симпозиуме "Проблемы биохимии, радиационной и космической биологии" (Дубна, 2007), 2-ой Международной конференции по проблемам стресса (Будапешт, Венгрия, 2007), на конкурсе аспирантов Института биохимии им. А.Н. Баха РАН на соискание стипендии имени члена-
корреспондента РАН В.Л. Кретовича (Москва, 2008). Присужден грант в области
естественных и гуманитарных наук по программе «Лучшие аспиранты РАН» (Москва,
2008).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ (5 статей в
рецензируемых журналах, 2 статьи в сборниках трудов и тезисы сообщений на 3-х
конференциях).
Объем и структура работы. Работа изложена на страницах, содержит рисунков и
таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (глав), описания
материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (глав),
выводов и списка цитируемой литературы ( источников).
