Содержание к диссертации
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ 2
ВВЕДЕНИЕ 3 - 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ 6 - 116
Б-ГЛ И ЦЕРЛЛ ЬД ЕГИ Д-З-ФОСФ АТД ЕГИ Д РО Г Е11 АЗ А:
ОСНОВНЫЕ СВОЙСТВА 7 - 35
ОСНОВНЫЕ СТРУКТУРНЫЕ И ФУНКЦИОНАЛЬНЫЕ ОСОБЕННОСТИ ШАПЕРОНОВ 35 - 64
ИСПОЛЬЗОВАНИЕ АНТИТЕЛ ДЛЯ ИЗУЧЕНИЯ РЕНАТУРАЦИИ БЕЛКОВ И ДЛЯ ИНГИБИРОВАНИЯ ФЕРМЕНТОВ 64 - 73
4. НЕКАНОНИЧЕСКИЕ ФУНКЦИИ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3-
ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ 74 - 116
ЭКСПЕРИМЕНТАЛЬНАЯ ЧАСТЬ 117 - 155
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ ИССЛЕДОВАНИЯ 118 - 155
РЕЗУЛЬТАТЫ И ИХ ОБСУЖДЕНИЕ 156 - 285
РАЗОБЩЕНИЕ ГЛИКОЛИЗА ПРИ ИНДУКЦИИ АЦИЛФОСФАТАЗНОЙ АКТИВНОСТИ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-3- ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ 156 - 181
ВЗАИМОДЕЙСТВИЕ ГАФД С НУКЛЕИНОВЫМИ КИСЛОТАМИ 181-194
ИЗМЕНЕНИЕ ВНУТРИКЛЕТОЧНОЙ ЛОКАЛИЗАЦИИ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-З-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗЫ ПРИ ИНДУКЦИИ АПОПТОЗА 195 - 210
БЛОКИРОВАНИЕ ШАПЕРОНИНА GroEL НЕНАТИВНЫМИ
ПОЛУЧЕНИЕ АНТИТЕЛ, ИНАКТИВИРУЮЩИХ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-З-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗУ, И ИХ ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ДЛЯ СНИЖЕНИЯ АКТИВНОСТИ ФЕРМЕНТА 249 - 285
ФОРМАМИ ГЛИЦЕРАЛЬДЕГИД-З-ФОСФАТДЕГИДРОГЕНАЗ 211 - 249
ВЫВОДЫ 286-288
СПИСОК ЦИТИРОВАННОЙ ЛИТЕРАТУРЫ 289 - 339
СПИСОК СОКРАЩЕНИЙ
ГАПН - Нефосфорилирующая D-глицеральдегид-З-фосфат дегидрогеназа
ГАФД - D-Глицеральдегид-З-фосфатдегидрогеназа
(фосфорилирующая)
ДСК - Дифференциальная сканирующая калориметрия
ДСН - Додецилсульфат натрия
ДТНБ - Дитио-(бис)-нитробензойная кислота
КД - Круговой дихроизм
МЭ - 2-Меркаптоэтанол
ПААГ - Полиакриламидный гель
Трис - Трис (гидроксиметил) аминометан
3-ФГ - З-Фосфоглицерат
3-ФГА - Глицеральдегид-3-фосфат
ФМСФ фенилметилсульфонилфторид
ADP - Аденозиндифосфат ч
АТР - Аденозинтрифосфат
NAD - никотинамидадениндинуклеотид окисленный
NADH - никотинамидадениндинуклеотид восстановленный
NADP - никотинамидадениндинуклеотидфосфат окисленный
NADPH - никотинамидадениндинуклеотидфосфат
восстановленный
ДСр - Избыточное теплопоглощение
ДНса1 - Калориметрическая энтальпия
KD - Константа диссоциации
Km - Константа Михаэлиса
PBS фосфатно-солевой буфер
Тмакс. - Температура максимального теплопоглощения
Введение к работе
Белок-белковые взаимодействия лежат в основе многих процессов, протекающих в клетке. Их роль в регуляции жизнедеятельности достаточно хорошо известна, однако каждый год появляется информация о принципиально новых процессах, в которые вовлечены белок-белковые взаимодействия. Особенно важно, что целый ряд патологических состояний клетки может возникать из-за нарушения "правильных" взаимодействий между белками. Принципиально новая ситуация возникла после открытия целого класса белков (а точнее полибелковых комплексов) — шаперонов и шаперонинов (так называемых "белков теплового шока"). Стало очевидным, что сворачивание белков, образование олигомерных белковых структур и перемещение белков между внутриклеточными компартментами не спонтанный процесс, а сложный механизм, зависящий от эффективности действия системы белков теплового шока. Эти белки, как оказалось, присутствуют (и работают) в клетках и в обычных условиях, а не только в экстремальных. Эффективность функционирования шаперонов, несомненно, регулируется совокупностью всех белков и полипептидных цепей, присутствующих в клетке. Особую роль в такой регуляции должны играть нативные и ненативные формы глицеральдельдегид-3- фосфатдегидрогеназы, которая, с одной стороны, содержится в клетке в очень высокой концентрации, а с другой, является мишенью для различных окислителей и других химических реагентов, так как обладает высокореакционноспособными сульфгидрильными группами активного центра. Именно этим аспектам посвящена настоящая работа, причем основным объектом достаточно разнопланового исследования является необычный фермент — глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназа, на некоторых особенностях которого мы хотели бы остановиться во «Введении».
Хорошо известно, что ГАФД является одним из важнейших гликолитичских ферментов, так как осуществляет реакцию гликолитической оксидоредукции, в результате которой образуется макроэргическое соединение — 1,3-дифосфоглицерат - и МАЕ)Н. Именно эта функция фермента изучалась наиболее интенсивно с конца 30-ых до начала 80-ых годов прошлого века. В результате интенсивных исследований, в ходе которых ГАФД превратилась в излюбленный модельный объект многих известнейших биохимиков (Эфраим Рэкер, Пауль Боейр, Кошланд, Перхам, Россман), было практически все выяснено о механизме катализируемой ГАФД реакции, обо всех уровнях структуры фермента и об особенностях его регуляции. Интерес к ферменту объяснялся и тем, что его очень просто было выделить из практически любого источника - простым фракционированием с помощью сульфата аммония можно было получить сотни миллиграммов гомогенного фермента из килограмма мышечной ткани. Простота выделения объяснялась тем, что содержание ГАФД составляет 10-20% от общего количества растворимых белков клетки, на порядок превосходя содержание других ферментов гликолиза. Энзимологи с удовольствием пользовались такой особенностью фермента, не особенно задумываясь о причинах столь высокого содержания фермента в клетке. Однако постепенно накапливалась информация о том, что ГАФД может участвовать в процессах, которые не связаны непосредственно с ее участием в гликолизе. Прежде всего, многие исследователи обратили внимание на способность ГАФД взаимодействовать с другими белками, а также с нуклеиновыми кислотами и даже внутриклеточными структурами. Приписать такому взаимодействию функциональное значение долгое время не удавалось из-за обычных возражений о неспецифичности такого рода связывания. Суть этих скептических замечаний заключалась в следующем - белок (ГАФД), положительно заряженный при физиологических значениях рН и ионной силы, связывается с любыми отрицательно заряженными биомолекулами, а высокое содержание фермента в клетке увеличивает вероятность выявления такого взаимодействия. Следовательно, это взаимодействие не является специфичным именно для ГАФД, а характерно для многих белков со сходным зарядом, и не следует говорить о возможной роли такого взаимодействия в регуляции жизнедеятельности клетки. Однако в этих рассуждениях было одно противоречие - даже если допустить, что специфичность взаимодействия ГАФД с другими биомолекулями не слишком велика, то только за счет высокой концентрации этого белка в клетке именно связывание ГАФД с другими белками и нуклеиновыми кислотами будет доминирующим процессом. Наша работа связана с подтверждением концепции, согласно которой ГАФД вовлечена в целый ряд протекающих в клетке процессов, которые не связаны непосредственно с ее гликолитической функцией.
