Введение к работе
Актуальность проблемы.
Под действием неблагоприятных условий (тепловой, осмотический и окислительный стрессы, облучение ультрафиолетом, критические изменения рН) белковые молекулы могут претерпевать трансформацию вторичной и третичной структур, что приводит к образованию нерастворимых внутри- и внеклеточных агрегатов. Проблемы, связанные с неправильным фолдингом, являются весьма актуальными при решении медицинских задач, поскольку в основе патогенеза так называемых «конформационных» заболеваний человека лежит формирование белковых агрегатов [Dobson, 2004; Luheshi and Dobson, 2009]. Эти проблемы приходится учитывать и при биотехнологическом производстве рекомбинантных белков, выход которых можно повысить, обеспечивая эффективный рефолдинг белка из агрегированного состояния в биологически активную конформацию.
В физиологических условиях в клетке функционирует «система контроля качества», «quality control system», включающая шапероны и протеиназы, защитная роль которых проявляется в торможении накопления белковых агрегатов. Традиционные представления о необходимости предотвращения накопления агрегатов, образующихся в результате нарушения пространственной структуры белка, основаны, главным образом, на данных о патогенности агрегатов, вызывающих развитие нейродегенеративных заболеваний. Однако исследования последних лет показали, что при определенных условиях многочисленные непатогенные белки и пептиды способны к агрегации с образованием надмолекулярных структур, сходных с патогенными амилоидоподобными фибриллами. Более того, выявлены белковые агрегаты, обладающие биологической активностью, необходимой для нормального функционирования клетки. В настоящее время развивается новая концепция о том, что агрегация белков и их способность к формированию амилоидоподобных структур является универсальным свойством полипептидных цепей и значительно более распространенным явлением в живой системе, чем ранее предполагалось [Stefani and Dobson, 2003; Kelly and Balch, 2003; Dobson, 2004; Stefani, 2004; Gebbink et al., 2005; Gazit, 2005; Ellis-Behnke et al., 2006; Krebs et al., 2007]. Подобные представления предполагают существование регуляторных систем, участвующих в трансформации компетентных к агрегации белков в различные надмолекулярные структуры, обладающие, возможно, различной биологической активностью. Особый интерес вызывают молекулярные шапероны, широкий спектр действия которых на конформационное состояние
белков хорошо известен.
а-Кристаллин, один из представителей семейства малых белков теплового шока, функционирует как молекулярный шаперон, взаимодействуя с развернутыми или неправильно свернутыми белками, предотвращая их агрегацию. В хрусталике глаза а-кристаллин обеспечивает защиту (3- и у-кристаллинов от ультрафиолетового облучения и окислительного стресса, повреждающих эти белки и приводящих к развитию катаракты [Sharma and Santhoshkumar, 2009; Zhu et al., 2010]. Повышенная экспрессия а-кристаллина выявлена также во многих тканях в условиях стресса и при различных патологиях. Многочисленные работы посвящены изучению его влияния на денатурацию и агрегацию различных белков [Carver et al., 1995; Bettelheim, 2002; Векшин, 2008, 2010; Ecroyd, 2009; Chen, 2010].
Шапероны постоянно синтезируются в клетке в небольшом количестве. Именно эти молекулы ответственны за первичный ответ на стресс. Они взаимодействуют с вновь образующимися денатурированными молекулами белков прежде, чем стрессовое воздействие вызовет активацию генома и резкое повышение экспрессии шаперонов. В этой связи чрезвычайно актуальным представляется исследование влияния низких концентраций а-кристаллина на агрегацию модельных белков, так как эти условия максимально приближены к условиям in vivo.
Цели и задачи работы.
Целью настоящей работы является изучение механизма действия а-кристаллина на дитиотреитол (ДТТ)-индуцированную агрегацию низкомолекулярных модельных белков в широком диапазоне концентраций шаперона. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
С использованием метода динамического лазерного светорассеяния (ДЛС) изучить кинетику ДТТ-индуцированной агрегации а-лактальбумина коровьего молока и рекомбинантного инсулина человека.
Изучить влияние а-кристаллина на кинетику агрегации модельных субстратов в широком диапазоне концентраций шаперона.
Методами ДЛС, флуориметрии, ультрафильтрации, электрофореза в полиакриламидном геле (ПААГ) и электронной микроскопии исследовать механизм образования и состав комплексов а-кристаллин-субстрат на разных стадиях процесса агрегации.
Научная новизна.
Установлено, что процесс ДТТ-индуцированной агрегации модельных белков, а-лактальбумина и инсулина, проходит через стадию формирования стартовых агрегатов с гидродинамическим радиусом 80 - 100 нм. При этом показано отсутствие промежуточных форм агрегатов между мономерным
белком и стартовыми агрегатами.
Было продемонстрировано шапероноподобное действие а-кристаллина на агрегацию исследуемых модельных субстратов. С помощью метода ДЛС изучены начальные этапы агрегации в присутствии а-кристаллина и показано образование комплексов а-кристаллин-субстрат. Обнаружен парадоксальный эффект, проявляемый а-кристаллином в низких концентрациях, выраженный в ускорении агрегации а-лактальбумина и инсулина на начальных этапах развития процесса, а также в увеличении размеров агрегатов и уменьшении длительности лаг-периода при агрегации инсулина. Предложена новая модель действия а-кристаллина на агрегацию белков, в основу которой положен процесс образования зародышей (ядер) из молекул субстрата на поверхности а-кристаллиновых частиц.
Методом электрофореза в присутствии додецилсульфата натрия (ДСН) в сочетании с ультрафильтрацией были выявлены существенные различия в механизме образования комплексов а-кристаллин-субстрат в зависимости от времени включения шаперона в среду агрегации, а также от его концентрации. Показана диссоциация олигомеров а-кристаллина в присутствии денатурированного субстрата, а-лактальбумина. Обнаружено образование комплексов между денатурированным субстратом и диссоциированными формами а-кристаллина.
С помощью электронной микроскопии было продемонстрировано образование структурированных ассоциатов крупного размера (50 - 250 нм) в процессе агрегации инсулина в присутствии а-кристаллина.
Практическая значимость работы.
Исследования молекулярных механизмов агрегации белков, а также действия шаперонов на развернутые или неправильно свернутые белки позволяют пролить свет на основы первичного клеточного ответа на стресс in vivo. Исследования защитной роли шапероноподобных белков, способных предотвращать агрегацию инсулина, могут быть важны для борьбы с патологическими состояниями, обусловленными дисфункцией инсулина. Полученные результаты могут быть рекомендованы для изучения ускорения агрегации белков малыми концентрациями различных шаперонов при образовании белковых надмолекулярных структур. Новые данные о классическом шапероне, а-кристаллине, могут служить базой для дальнейшего поиска эффективных химических агентов, действующих на агрегацию рекомбинантных белков, а также для создания различных лекарственных средств.
Связь работы с государственными программами.
Работа выполнена в соответствии с планом научно-исследовательских работ Учреждения Российской академии наук Института биохимии им. А.Н. Баха РАН, тема «Механизмы защитного действия шаперонов при агрегации белков»; гос. регистрационный номер темы 01200952331.
Работа поддержана программой «Молекулярная и клеточная биология» Президиума Российской академии наук и Российским фондом фундаментальных исследований (грант 08-04-00666-а).
Апробация работы.
Основные результаты работы были представлены на V съезде общества биотехнологов России им. Ю.А. Овчинникова, Москва, 2008; IV Российском симпозиуме «Белки и пептиды», Казань, 2009; The EMBO meeting «Advancing the life sciences», Барселона (Испания), 2010; XXI зимней молодежной научной школе «Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии», Москва, 2010.
Публикации.
По материалам диссертационной работы опубликовано 7 печатных работ, в том числе 3 статьи в рецензируемых международных научных журналах.
Структура и объем работы.
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, результатов и их обсуждения и списка литературы (324 наименования). Работа изложена на 146 страницах машинописного текста, содержит 47 рисунков и 5 таблиц.
