Введение к работе
Актуальность проблемы. Интерес к проблеме агрегации белков возник в последние годы в связи с обнаружением большого числа наследственных заболеваний, известных как «конформационные болезни» и возникающих в тех случаях, когда те или иные белки подвергаются структурной перестройке, способствующей их агрегации (болезни Альцгеймера, Паркинсона, Хантингтона, прионные энцефалопатии и др.). Агрегация белков является также важной проблемой для биотехнологии, т.к. агрегацией сопровождаются все стадии производства белковых лекарственных препаратов. Известно, что присутствие низкомолекулярных веществ (например, Сахаров, многоатомных спиртов, солей, аминокислот и т.д.) оказывает значительное влияние на стабильность белка в растворе. В связи с этим добавки, подавляющие агрегацию, часто используются во время производства, очистки и приготовления лекарственных форм и до настоящего времени являются наиболее эффективным способом борьбы с проблемой агрегации. Поскольку в продажу поступает все большее количество белковых препаратов, промышленность нуждается в новых антиагрегационных агентах для разработки технологии производства, позволяющей получать стабильные, правильно свернутые активные продукты.
Для подавления агрегации белков часто используют циклодекстрины (ЦД) и их производные. Способность ЦД подавлять агрегацию белков объясняется их способностью связываться с остатками гидрофобных аминокислот в ненативных (частично развернутых) формах белков, что приводит к подавлению процесса агрегации. Однако имеются данные, демонстрирующие стимуляцию агрегации белков в присутствии ЦД. Действие ЦД и их производных испытывают в различных тест-системах, каждая из которых имеет свои ограничения. В тест-системах, основанных на рефолдинге белков, ренатурация идет через стадию образования интермедиатов, склонных к агрегации. Используемый агент может оказывать влияние на стадию образования интермедиата из денатурированного белка. Возможно наложение эффектов агента на эту стадию и на стадию агрегации интермедиата. Таким образом, не представляется возможным использовать модель рефолдинга для изучения влияния агентов на стадию агрегации. В качестве тест-систем, пригодных для испытания эффективности подавления агрегации белков ЦД и их производными, применяются также системы, основанные на тепловой агрегации белков. В таких тест-системах также возможно влияние агентов на стадию денатурации нативного белка, и исследование чистого эффекта на стадию агрегации невозможно без предварительной проверки термостабильности белка в присутствии агента.
Цели и задачи работы. Целью настоящей работы является изучение механизмов разнонаправленного (подавляющего и ускоряющего) действия циклодекстринов (на примере 2-гидроксипропил-(3-пиклодекстрина; ГПЦД) на процесс агрегации белков и разработка тест-системы, позволяющей оценивать влияние различных агентов непосредственно на стадию агрегации белковых молекул. В соответствии с этой целью были поставлены следующие задачи:
Изучить влияние ГПЦД на термостабильность и кинетику тепловой агрегации креатинкиназы из скелетных мышц кролика.
Изучить влияние ГПЦД на термостабильность и кинетику тепловой агрегации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из скелетных мышц кролика.
Исследовать агрегацию У Ф-об лученной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.
Изучить влияние ГПЦД на кинетику агрегации УФ-облученной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.
Научная новизна. При изучении кинетики тепловой агрегации креатинкиназы из скелетных мышц кролика методом динамического светорассеяния установлено, что механизм тепловой агрегации креатинкиназы включает стадию образования стартовых агрегатов. Показано, что тепловая агрегация креатинкиназы протекает в реакционно-контролируемом режиме.
На основании сопоставления процессов тепловой инактивации и денатурации креатинкиназы в присутствии ГПЦД сделан вывод о том, что ГПЦД не влияет на термостабильность белка. Методом динамического светорассеяния показано подавляющее действие ГПЦД на тепловую агрегацию креатинкиназы.
Показано, что стимуляция агрегации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы из скелетных мышц кролика в присутствии ГПЦД вызвана дестабилизацией белка под действием ГПЦД. Ускорение денатурации глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы в присутствии ГПЦД «перекрывает» возможный защитный эффект ГПЦД на стадии агрегации и общим эффектом является ускорение агрегации.
Разработана новая тест-система для скрининга антиагрегационных агентов, основанная на агрегации УФ-облученной глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы. Показано, что в результате УФ-облучения в растворе образуются развернутые молекулы белка, что дает возможность исследовать влияние различных агентов, обладающих шапероноподобной активностью, непосредственно на стадию агрегации белка в условиях, близких к физиологическим (37 С). С помощью такой
тест-системы показано защитное действие ГПЦД на агрегацию глицеральдегид-3-фосфатдегидрогеназы.
Практическое значение работы. Новая тест-система, основанная на агрегации УФ-облученного белка, может быть использована для поиска антиагрегационных агентов и оценки их шапероноподобной активности. Результаты исследований механизма действия ГПЦД на агрегацию белков могут быть учтены при решении биотехнологических задач и создании белковых препаратов медицинского назначения. Понимание механизмов агрегации белков и механизмов, предотвращающих агрегацию, на молекулярном уровне открывает перспективы для исследования и лечения большого ряда наследственных заболеваний, известных как «конформационные болезни».
Апробация работы. Результаты диссертационной работы представлены на Международных конференциях студентов, аспирантов и молодых учёных «Ломоносов» (Москва, 2008; 2009), конференции молодых ученых в рамках V Международного Симпозиума «Российско-Европейское сотрудничество в области «Биотехнология, сельское хозяйство и пища» в седьмой рамочной программе ЕС» (Пущино, 1-3 октября, 2008), VIII и IX Европейских Симпозиумах Общества Белка (Цюрих, Швейцария, 2009 и Стокгольм, Швеция, 2011).
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 10 печатных работ (4 статьи в рецензируемых журналах, статья в сборнике трудов и 5 тезисов).
Объем и структура работы. Работа изложена на 122 страницах, содержит 46 рисунков и 12 таблиц. Диссертация состоит из введения, обзора литературы (5 глав), описания материалов и методов исследования, изложения результатов и их обсуждения (3 главы), выводов и списка цитируемой литературы (231 источник).
