Введение к работе
Актуальность проблемы В последнее время значительно усилился интерес к изучению механизмов взаимодействия клеточных мембран Это связано с тем, что процесс агрегации плазматических мембран является начальной стадией многих физиологических процессов, кроме того, может находиться на границе нормы и патологии в живых организмах С одной стороны процесс агрегации может быть индуктором, запускающим защитные реакции свертывания крови, с другой стороны сигналом к патологии -тромбообразованию
Процесс агрегации является первым этапом слияния плазматических мембран Слияние происходит при каждом акте экзо- и эндоцитоза и лежит в основе таких процессов как формирование самой мембраны, деление клеток, оплодотворение, образование многоядерных клеток при дифференцировке (например, в случае биогенеза мышечных волокон) и т.д (Poste, Allison, 1973) Слияние является необходимой стадией множества физиологических процессов in vivo, в то же время это явление широко используется in vitio при решении различных биотехнологических и биомедицинских задач с помощью гибридных клеток Нарушение способности мембран сливаться может быть основой патологических изменений в клетке или системе клеток
Выяснение механизма слияния клеточных мембран даст возможность управлять этим процессом. Это также важно для разработки методов направленной доставки лекарств в органы с помощью липосом и эритроцитов, введение в клеточные мембраны белков, липидов, модификаторов клеточного метаболизма
Универсальность процессов агрегации и слияния обуславливает значительный интерес к изучению их механизмов. Этими обстоятельствами и определяется актуальность проблемы выбранной в качестве предмета диссертационной работы
В настоящее время для изучения механизмов агрегации и слияния биологических мембран широкое использование получили красные клетки крови - эритроциты, как модельная система
В экспериментах ш vitro агрегацию и слияние клеток можно получить индукторами различной природы вирусом Сендай, гемагглютинином вируса гриппа (Рингерц, Севидж, 1979, Hernandez et al, 1996), химическими агентами (полиэтиленгликоль, кальций-фосфат, хлорпромазин и др) (Lucy, 1984) и электрическим полем (Zimmermann, 1982)
Из химических агентов особый интерес представляет использование в качестве индуктора агрегации и слияния клеток ионов La3+ Это обусловлено тем, что способность La3+ вытеснять кальций из мест его связывания на молекулах белков и фосфолипидов широко используется при изучении роли кальция в различных биологических процессах (Lettvin et al, 1964, Takata et al, 1966, Weiss, 1974, Martin, Richardson, 1979, Segal, 1986, Abe, Takeda, 1988, "Wang et al, 1999 и др ) Имеются сведения о том, что ионы La + индуцируют
v 'а
ч \J
\
агрегацию и слияние фосфатидилсериновых везикул (Hammoudah et al, 1979, 1981, Ohki, Duax , 1986, Ohki, 1988 , Bentz et al, 1988, Ohki, Arnold, 1990), a также агрегацию тромбоцитов (Левин, Шереметьев, 1980, Sauerheber et al, 1980), тимоцитов (Segal, 1986) и эритроцитов (Lerche et al, 1979, Левин, Шереметьев, 1980). Недавно показано, что La3+ в мембранах из фосфатидилэтаноламина индуцирует переход липида из La в гексагональную (Ни) фазу (Тапака et al, 2001), а также изменение формы гигантских везикул из фосфатидилхолина (Тапака et al, 2002)
Однако до настоящего времени известна лишь одна работа, в которой в качестве индуктора слияния эритроцитов использовали ионы La3+ (Majumdar et al, 1980) Это, по-видимому, связано с очень низкой частотой слияния клеток К тому же авторы использовали высокие концентрации лантана (ЮмМ) Поэтому изучение механизма слияния, индуцированного La +, проводилось, как правило, на фосфатидилсериновых везикулах
Учитывая то, что лантан имеет сходный с кальцием ионный радиус (Martin, Richardson, 1979), высокую степень сродства к местам взаимодействия кальция на мембране, представляется важным изучить механизмы агрегации и слияния эритроцитов, индуцируемых ионами La3+
Комплекс кальция с фосфатом (Ca2+/P03_4), является известным индуктором слияния клеток (Zakai et al, 1976, Hoekstra et al, 1983, Stewe et al, 1992) В отличии от La3+ кальций и фосфат являются химическими элементами активно участвующими в метаболизме клеток Эта модельная система является более физиологичной В этой модельной системе кальций сам вместе с фосфатом выступает в качестве индуктора агрегации и слияния клеток.
Поэтому в ряде опытов изучили кальций- фосфат- индуцируемое слияние эритроцитов
Целью работы явилось изучение роли физико-химического состояния мембран в механизмах La3+- индуцируемых агрегации и слияния эритроцитов
Задачи исследования. Были поставлены следующие задачи
-изучить роль поверхностного заряда мембран эритроцитов в их агрегации,
-изучить роль внутриклеточного содержания аденозинтрифосфорной кислоты в агрегации и слиянии эритроцитов,
-изучить роль формы и деформируемости в агрегации и слиянии эритроцитов,
-изучить характер распределения внутримембранных частиц эритроцитов при их агрегации и слиянии,
-изучить белки цитоскелета эритроцитов при их агрегации и слиянии,
-разработать новые способы оценки изменения физико-химического состояния мембран эритроцитов и методы их слияния
Научная новизна. Научная новизна настоящего исследования определяется главными ее результатами
Впервые установлено, что ионы LaJ+ индуцируют агрегацию эритроцитов человека, кур, крысы и быка Впервые проведен систематический анализ механизмов взаимодействия клеточных мембран при агрегации и слиянии эритроцитов человека, индуцируемых ионами лантана
Впервые показано, что при концентрациях ионов лантана, индуцирующих агрегацию эритроцитов, происходит трансформация их формы эритроциты из дискоцитов превращаются в стоматоциты Перемешивание суспензии клеток после добавления La3+ приводит к сильной агрегации эритроцитов При комнатной температуре агрегация эритроцитов является обратимым процессом Фиксация формы эритроцитов гяутаровым альдегидом ингибирует как изменение формы клеток под влиянием La3+ так и их агрегацию Впервые показаны различия в степени агрегации интактных эритроцитов по сравнению с клетками, имеющими как пониженное, так и повышенное содержание внутриклеточного АТФ, обработанных низкими концентрациями глутарового альдегида, ферментами (нейраминидазой, трипсином, проназой), инкубированных при высоких температурах и при различных значениях рН
Впервые изучена взаимосвязь между изменением деформируемости эритроцитов и их агрегацией, индуцируемой лантаном В работе получены новые данные о влиянии SH - реагентов и температуры на агрегацию эритроцитов, индуцируемую различными концентрациями ионов лантана Выяснено, что снижение отрицательного заряда эритроцитов не играет ведущей роли в их агрегации Установлено, что при агрегации эритроцитов в их мембранах образуется высокомолекулярный белковый агрегат Показано, что ионы La3+вызывают перераспределение ВМЧ
Проведенные исследования позволяют понять механизм агрегирующего действия ионов лантана на эритроциты, начальным этапом которого является вход La3+ в клетки и взаимодействие его с белками цитоскелета , а конечным этапом образование на поверхности мембран дискретных областей, обладающих сильным электрическим зарядом Электростатическое взаимодействие трехвалентного катиона La3+ с участками мембран соседних клеток, обладающими сильным отрицательным зарядом , приводит к агрегации эритроцитов. Изученный механизм агрегирующего действия ионов La3+ на эритроциты может служить базой для дальнейших исследований в клеточной физиологии
Показано возникновение искусственной агрегации эритроцитов эхиноцитной формы при низких значениях рН
Впервые изучено слияние клеточных мембран, индуцируемое ионами лантана. Установлено, что ионы лантана не вызывают полного слияния (объединения содержимого) клеток, имеющих нормальное содержание внутриклеточной аденозинтрифосфорной кислоты В то же время агрегация интактных эритроцитов после инкубации их агрегатов при 37С становится необратимой
Впервые показано, что снижение уровня АТФ (ниже физиологического) приводит к массовому полному слиянию эритроцитов Повышение внутриклеточного содержания АТФ (выше физиологического) также приводит к массовому слиянию эритроцитов с образованием гигантских сферических клеток
Впервые показано, что эритроциты донорской крови, заготовленной на цитратном гемоконсерванте «Глюгицир», начинают сливаться под влиянием
ионов лантана через 1 сут после хранения донорской крови при 4С Наиболее сильное слияние наблюдали через 4 сут после хранения крови В результате слияния таких эритроцитов образуются гигантские клетки
Впервые в гигантские эритроциты введен микроэлектрод и измерен трансмембранный потенциал покоя слившихся клеток
Впервые показано, что в процессе слияния эритроцитов происходит изменение белкового состава цитоскелета клеток Исчезает белок полосы 2,1. (анкирин) и значительно увеличивается белок полосы 2,3 Анализ характера распределения ВМЧ показал, что в процессе слияния эритроцитов происходит их агрегация.У становлено, что SH -реагенты (диамид и дитиотреитол) ингибируют слияние эритроцитов
Впервые показана возможность слияния ионами лантана протопластов растительных клеток
Впервые показано, что повышение в эритроцитах внутриклеточного содержания АТФ приводит к значительному увеличению индекса слияния клеток, индуцированного комбинированным действием кальция и фосфата В результате слияния образуются гигантские клетки Выяснено, что в процессе слияния происходят качественные и количественные изменения белкового состава мембран эритроцитов Показано, что SH -реагенты ингибировали слияние эритроцитов, индуцируемое кальций -фосфатом Положения, выносимые на защиту: 1. Агрегационная способность эритроцитов связана с уровнем АТФ и физико-химическим состоянием их мембран Механизм агрегации эритроцитов, включающий изменение формы клеток, образование в мембранах белкового агрегата, перераспределение внутримембранных частиц, несущих отрицательный заряд 2 Возникновение слияния эритроцитов связано с изменением уровня АТФ Механизм слияния эритроцитов, включающий агрегацию внутримембранных частиц, протеолиз белков цитоскелета, нарушение асимметричного расположения фосфолипидов 3. Возникновение искусственной агрегации эритроцитов связано с образованием эхиноцитов при низких значениях рН среды
-
Измерение мембранного потенциала эритроцитов с помощью микроэлектродной техники связано с получением гигантских клеток
-
Методы оценки изменения физико-химического состояния мембран эритроцитов основаны на измерении их агрегационной способности Методы слияния эритроцитов основаны на изменении внутриклеточного содержания АТФ
Научно-практическое значение. Научно-практическое значение подтверждается авторскими свидетельствами и патентами РФ Асі 752762 «Способ слияния эритроцитов», 1992, А с 1812209 «Способ получения слившихся эритроцитов», 1993,Пат 2027188 «Способ регистрации изменений поверхностного заряда эритроцитов», 1995, Пат 2033183 «Способ получения гигантских эритроцитов» ,1995, Пат 2032746 «Способ слияния клеток» , 1995,
Пат. 2082968 «Способ оценки изменения состояния мембран эритроцитов», 1997, Пат 2238556 «Способ оценки изменения состояния мембран эритроцитов» , 2004; Пат.2277711 «Способ оценки стабильного состояния мембран эритроцитов», 2006 Сконструирована, собрана и используется в работе высокочувствительная установка для регистрации процесса агрегации эритроцитов Данная установка легко собирается в любой лаборатории и может использоваться для изучения агрегационной способности эритроцитов, индуцируемой различными химическими агентами
Установлено возникновение агрегации эхиноцитов при низких значениях рН среды Разработан новый экспериментальный подход к изучению агрегационной способности эритроцитов
Разработана новая модельная система, позволяющая изучать механизмы агрегации и слияния эритроцитов, индуцируемых ионами лантана
Выяснено, что лантан является высокоэффективным индуктором слияния эритроцитов и протопластов растительных клеток Это может использоваться в клеточной инженерии для получения гибридных клеток
Получение гигантских эритроцитов методом слияния и введение в них микроэлектрода открывает возможность изучения трансмембранного потенциала в эритроцитах с помощью микроэлектродной техники.
Разработанные методы оценки изменения физико- химического состояния эритроцитов могут использоваться в медицине и ветеринарии для изучения состояния мембран клеток в процессе гемоконсервации, при анемиях различного генеза, различных заболеваниях человека и животных.
Предложенные методы и механизмы слияния клеточных мембран необходимо учитывать при проведении работ в мембранной и клеточной биологии
Апробация работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на I Всесоюзном биофизическом съезде (Москва, 1982), на VI съезде Всесоюзного общества генетиков и селекционеров им НИ. Вавилова (Минск, 1992), на II съезде биохимического общества при Российской академии наук (Москва, 1997), на II съезде биофизиков России (Москва, 1999), на научных семинарах и конференциях Нижегородской государственной сельскохозяйственной академии (1992-2003)
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 29 работ, в том числе 2 авторских свидетельства и 6 патентов.
Структура и объем диссертации. Диссертация состоит из введения, обзора литературы, описания использованных в работе материалов и методов исследования, изложения собственных экспериментальных данных, обсуждения результатов исследований, выводов, работы, практических рекомендаций и списка литературы из 342 наименований, в том числе 319 на иностранных языках, работа изложена на '6V страницах машинописного текста, содержит 3ш\0 таблиц
