Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 31
1.1. Физиологические основы регуляции объема клеток 31
1.1.1. Транспорт электролитов и регуляция клеточного объема 32
1.1.2 Участие органических осмолитов в объемном гомеостазе клетки 35
1.1.3 Волюмодетекторные и волюмоэффекторные механизмы
регуляции объема клеток 37
1.1.4 Роль Са2+-сигнальных путей в регуляции объема клеток крови 41
1.1.5 Роль аденилатциклазных путей в регуляции объема клеток 46
1.2. Структурно-функциональная организация ядра и его участие в регуляции объема клетки 50
1.3. Цитоархитектоника клеток крови 54
1.3.1 Структурно-функциональная организация цитоскелета клеток крови 54
1.3.2 Топография клеток крови 60
1.3.3 Участие белков цитоскелета в образовании рельефа клеточной поверхности 63
1.3.4 Использование инструментария атомно-силовой микроскопии в исследовании цитоархитектоники клеток 67
ГЛАВА 2. Результаты собственных исследований 71
2.1. Морфофункциональные свойства лимфоцитов доноров и больных ХЛЛ .71
2.1.1. Особенности цитоархитектоники и упруго-эластические свойства лимфоцитов доноров и больных ХЛЛ в физиологических условиях 71
2.1.2. Особенности цитоархитектоники и упруго-эластические свойства лимфоцитов доноров и больных ХЛЛ
под влиянием функциональных нагрузок 74
2.2. Регуляция объема лимфоцитов в тестах с осмотической нагрузкой (in vitro) 84
2.2.1. Реакции осморегуляции лимфоцитов доноров 84
2.2.2. Влияние функциональных нагрузок на реакции регуляции объема лимфоцитов доноров в осмотических тестах (in vitro) 88
2.2.3 Реакции осморегуляции лимфоцитов больных ХЛЛ 121
2.2.4. Влияние функциональных нагрузок на реакции регуляции объема лимфоцитов больных ХЛЛ в осмотических тестах (in vitro) 126
2.3. Цитоархитектоника лимфоцитов здоровых доноров и больных ХЛЛ в условиях гипоосмотической и функциональных нагрузок (in vitro) 163
2.3.1 Рельеф поверхности лимфоцитов доноров
в условиях гипоосмотической нагрузки 163
2.3.2 Рельеф поверхности лимфоцитов больных ХЛЛ в условиях гипоосмотической нагрузки 169
2.3.3 Рельеф поверхности лимфоцитов доноров
под влиянием функциональных нагрузок 175
2.4. Морфофункциональные свойства эритроцитов лягушек 199
2.4.1. Особенности цитоархитектоники и упруго-эластические свойства эритроцитов лягушек 199
2.4.2. Особенности цитоархитектоники и упруго-эластические свойства эритроцитов лягушек в условиях функциональных нагрузок 202
2.4.2. Влияние Са2+ и верапамила на цитоархитектонику эритроцитов лягушек 205
2.5. Регуляция объема эритроцитов лягушек в тестах с осмотической нагрузкой (in vitro) 208
2.5.1. Реакции осморегуляции эритроцитов лягушек 208
2.5.2 Влияние функциональных нагрузок на реакции регуляции объема эритроцитов лягушек в осмотических тестах (in vitro) 216
2.6. Цитоархитектоника эритроцитов лягушек в условиях гипотонической и функциональных нагрузок 256
2.6.1. Цитоархитектоника эритроцитов лягушек в условиях гипоосмотической нагрузки (in vitro) 256
2.6.2 Цитоархитектоника эритроцитов лягушек под влиянием функциональных нагрузок 262
Глава 3. Обсуждение результатов исследования 286
Выводы 315
Практические рекомендации 317
Список сокращений 318
- Транспорт электролитов и регуляция клеточного объема
- Особенности цитоархитектоники и упруго-эластические свойства лимфоцитов доноров и больных ХЛЛ в физиологических условиях
- Особенности цитоархитектоники и упруго-эластические свойства эритроцитов лягушек
- Влияние функциональных нагрузок на реакции регуляции объема эритроцитов лягушек в осмотических тестах (in vitro)
Транспорт электролитов и регуляция клеточного объема
В механизмах регуляции объема клеток потенциально важны элементы ци-тоскелета: они придают мембране свойства напряженности и метастабильности, кроме того, актин и актиноподобные белки, обладая сократимостью, могут маскировать и модифицировать осмотическое поведение клетки (Mills J.W., 1987). Следовательно, нормализация объема зависит не только от концентрации ионов, создаваемой работой соответствующей транспортной системы, но также от упруго-эластических характеристик мембраны и подмембранных белков. Макромолекулы цитоскелета обеспечивают высокую чувствительность клетки к изменению объема и препятствуют свободному току воды (Chen J. et al., 1994). С целью выявления зависимости между упруго-эластическими свойствами и интенсивностью использования резервных бассейнов клетками в осмотических тестах in vitro, в проведенном исследовании использован метод функциональных нагрузок, включающий инкубацию клеточных суспензий с адреналином, обзиданом, хлоридом кальция и верапамилом.
Выбор указанных веществ связан с их непосредственным влиянием на элементы универсальных регуляторных сигнальных путей – аденилатциклазного (Kaloyianin M., Doukakis I., 2003) и Са2+-сигнального (Sechi S.A., Wehland J., 2000; Mohanty M.J. et al., 2001). В частности, использование адреналина и обзидана в качестве неселективного блокатора -адренорецеторов, обусловлено участием -адренорецепторов в модуляции упруго-эластических свойств клеточной мембраны, посредством фосфорилирования белков цитоскелета (Tuvia S. et al., 1999). Известно, что -адренергические рецепторы признаны основными подтипами адре-нергических рецепторов, присутствующими на поверхности лимфоцитов (Landmann R., 1992). Плотность их на мембране лимфоцитов составляет 1000-3000 (Tuvia S. et al., 1999). Использование неселективного блокатора -адренорецепторов - обзидана связано с его влиянием на элементы сигнальных путей (в частности адренорецеп-торов типа ), активируемых при клональной пролиферации лимфоцитов (Kohm A.P., Sanders V.M., 2001). По данным литературы, -адренорецепторы в клетках крови не вовлекаются в регуляцию цАМФ, концентрация которого прямо пропорциональна деформируемости эритроцитов и трансформированных лимфоцитов, обладающих различным метастатическим потенциалом (Mittelman L. et al., 1994). Кроме того, в эритроцитах лягушек -адренорецепторов связанные с элементами цитоскелета, быстро реагируют на незначительные дозы обзидана (Chuang D.M., Costa E., 1979). По данным литературы мембраны ядерных эритроцитов лягушек содержат систему атипичных -адренорецепторов (Агалакова Н.И., 1996), которые одновременно обладают сходством с 1- и 2-адренорецепторами высших животных (Сергеев П.В., Шимановский В.Л., 1987; Cherksey B.D. et al., 1980).
Выбор кальциевой нагрузки in vitro связан с тем что, ионы Са2+ являются универсальными мессенджерами, участвуют в регуляции активности элементов цитоскелета (Grinstein S. et al., 1982b; Grinstein S., Smith J.D., 1990). В некоторых типах клеток регуляторное сокращение объема зависит от притока Са2+ вовнутрь (Montrose-Rafizadeh C., Guggio W.B., 1991), в других типах – ответ связан с немедленным выходом Са2+ из клеточных депо (Terreros D.A., Kanli H., 1992). Кроме того, влияния адреналина, реализуются посредством регуляции концентрации эндогенного Са2+, однако по данным литературы, в лимфоцитах в отличие от других клеток крови выход Са2+ из внутриклеточных депо ничтожно мал (Rink T.G. et al., 1983), что связано с низким содержанием в них эндоплазматической сети (около 1%). В связи с этим, в проведенном исследовании была создана экспериментальная модель экзогенной кальциевой нагрузки, стимулирующая поступление ионов Са2+ из инкубационной среды через высокоселективные Са2+- каналы типа TRPV5, описанные в лимфоцитах здоровых доноров (Васильева И.О., Негуляев Ю.А., 2008). Выбор верапамила с одной стороны связан с тем, что он, взаимодействуя с сайтами связывания для ионов Са2+, препятствует их потоку в клетку из среды (Kalin W. et al., 1982), и тем самым, выступает в качестве блокатора каль 17 циевых каналов, а с другой стороны, верапамил in vitro действует как ингибитор -адренорецепторов, аналогично обзидану (Feldman R.D., Park G.D., 1985).
Осмотические тесты in vitro Забор материала. Человеческую кровь получали путем венопункции в клинической лаборатории областной больницы г. Белгорода. Забор крови проводили с участием специализированного медперсонала в вакуумные пробирки Vacuette K3E, содержащие сухую ЭДТА К3 в концентрации 2,0 мг (0,006843 моль/литр) на 1 мл крови. ЭДТА предотвращает свертывание крови путем блокирования ионов Са2+, не влияет на гематологические параметры, морфологию клеток крови и сохраняет функциональную активность лимфоцитов (Гордиенко А.Д., Кудокоцева Е.В., 1980). Кровь для исследований у лягушек Rana Ridibunda Pall. брали путем пункции сердца. Стабилизацию крови проводили гепарином (5 Ед/мл).
Гипоосмотическая нагрузка. Динамику осморегуляторных реакций клеток крови изучали с использованием метода комплексного исследования, разработанного рядом авторов (Федорова М.З., Левин В.Н., 1997), на основе известных методик (Зацепина Г.Н. с соавт.,1984; Тарасова И.М., 1985; Mela M.J., 1967).
Полученную кровь здоровых доноров и больных ХЛЛ центрифугировали 10 мин. при 1500 об/мин. Удаляли верхний слой плазмы. Собирали нижнюю часть плазмы, богатую лейкоцитами и лейкоцитарное кольцо. Примесь эритроцитов разрушали 0,83% раствором хлорида аммония (Зиман Ю.И., Редькин А.П., 1987; Романова А.Ф., 2000; Карпищенко А.И., 2002). Клетки дважды отмывали изото-ничным буферным раствором (раствор Дульбекко, рН=7.4). Эритроциты лягушек выделяли из цельной крови, путем центрифугирования 5 мин при 1500 об/мин и последующего ресуспендирования в среде Хенкса, получали 1 мл суспензии.
Особенности цитоархитектоники и упруго-эластические свойства лимфоцитов доноров и больных ХЛЛ в физиологических условиях
На 30 секунде инкубации под влиянием обзидана в изотонической среде ЯЦО увеличились на 30,5% (р 0,05), адреналиновой нагрузки – на 24% (р 0,05) по сравнению с контролем. В интервале с 60 по 120 секунды прирост площади поверхности ядра к цитоплазме был более выражен в пробах с адреналином по сравнению с обзиданом. Затем со 180 по 380 секунды ситуация менялась и ЯЦО возрастали в пробах с обзиданом. К окончанию инкубации ЯЦО как после активации, так и после блокады -адренорецепторов были практически равны, но по отношению к контролю – повышены.
В пробах, проинкубированных с адреналином, интенсивность использования клеткой поверхностного резерва плазмалеммы в изотоническом растворе была снижена по сравнению с пробами, обработанными обзиданом. Максимальное использование относительного мембранного резерва (14%) клеткой под влиянием адреналиновой нагрузки отмечали на 180 секунде, в то же время, под влиянием обзидана (25,5%) – на 60 секунде инкубации. Ядро интенсивно использовало внутриклеточные мембранные резервы в процессах регуляции объема в изотонической среде, как под влиянием адреналина, так и обзидана. В условиях адреналиновой нагрузки максимальное использование относительного мембранного резерва ядром (35,6%) наблюдали на 150 секунде, а под влиянием обзидана (30,5%) – на 30 секунде инкубации (рисунок 40).
Под влиянием кальциевой нагрузки, в течение первых 90 секунд инкубации лимфоцитов, реакции регуляции объема в гипотонической среде не выявлены. Начиная со 120 секунды воздействия диаметр, объем и площади поверхности лимфоцитов увеличились соответственно на 3%, 9% и 6% (р 0,05) по сравнению с изотоническим раствором. В интервале со 150 по 360 секунды параметры клеток в гипо- и изотоническом растворах были в пределах не достоверных различий (таблица 42).
Реакцию увеличения объема лимфоцитов длительностью 60 секунд наблюдали на протяжении двух интервалов (390-420 секунды и 510-540 секунды). Начиная с 900 секунды и до конца инкубации, объем клеток в гипотонической среде уменьшился по сравнению с изотоническим раствором. К окончанию инкубации (3600 секунда) диаметр, объем и площадь поверхности лимфоцитов снизились соответственно на 12%, 40% и 26% (р 0,05) по сравнению с изотоническим раствором.
Под влиянием Са2+-нагрузки установлено чередование периодов увеличения и снижения объема ядра, длительностью соответственно 30 и 60 секунд каждый. В интервале с 60 по 120 секунды диаметр, объем и площадь поверхности ядра увеличились соответственно на 3, 8 и 5% (р 0,05; 60 секунда) и 5%, 14% и 9% (р 0,05; 120 секунда) по сравнению с изотоническим раствором (таблица 43).
Следующий период увеличения объема ядра наблюдали в интервале со 180 по 270 секунды. На 270 секунде диаметр, объем и площадь поверхности увеличились на 6%, 19,5% и 12% (р 0,05). Начиная с 420 секунды и до конца инкубации, морфометрические параметры ядра уменьшились. Причем сокращение ядра в объеме вначале было незначительным и составило 8,5% (р 0,05) на 420 секунде, а к 3600 секунде – на 37,6% (р 0,05) по сравнению с контролем.
Изменения показателя ЯЦО кореллировали с реакциями регуляторного увеличения объема и сморщивания ядра. В течение первых 300 секунд инкубации показатель ЯЦО в гипотонической среде увеличился: на 60 - 90 секундах – на 9% (р 0,05), на 180 с – 5% (р 0,05), 240 с – 11% (р 0,05), а к 270 – на 14% (р 0,05) по сравнению с контролем. В интервале с 420 по 570 секунды инкубации ЯЦО снизился: на 420 секунде – на 13% (р 0,05), 510 – на 13% (р 0,05), 540 – на 15,6% (р 0,05), а к 570 – на 17% (р 0,05). К окончанию инкубации различия в значениях ЯЦО между гипо- и изотонической средами были не достоверны (рисунок 41).
В течение первых 360 секунд наблюдали циклический характер в использовании дополнительных мембранных структур клетками. В изотоническом растворе вовлечение резервных мембранных структур произошло интенсивнее, чем в гипотонической среде (рисунок 42).
Под влиянием кальциевой нагрузки использование мембранного резерва плазмалеммой увеличилось на 30 и 120 секундах соответственно на 33% и 75% (р 0,05) по сравнению с изотоническим раствором. С увеличением времени инкубации использование мембранного резерва клеткой снизилось и к концу воздействия осморегуляторные реакции в гипотонической среде отсутствовали. В изотоническом растворе, наоборот, с увеличением времени инкубации использование мембранного резерва лимфоцитами возросло, максимум наблюдали на 3600 секунде инкубации (см. рисунок 42).
Под влиянием кальциевой нагрузки интенсивное использование резервных структур ядром в гипотонической среде протекало в течение первых 270 секунд инкубации, при этом в изотоническом растворе вовлечение внутриклеточных резервных структур кариолеммой произошло на 450 и сохранилось до конца инкубации (рисунок 43). мкм-
Увеличение объема ядра в гипотонической среде под влиянием Са2+-нагрузки протекало на 60 секунд быстрее, чем клеток. Общей реакцией явилось уменьшение объема клеток и их ядра в гипотонической среде во второй половине времени инкубации. Причем реакция на уровне ядра началась на 480 секунд раньше, чем на уровне целой клетки.
Регуляция объема лимфоцитов больных ХЛЛ в пробах с верапамилом Под влиянием верапамила увеличение объема клеток при снижении осмо-лярности среды наблюдали на 90 секунде и в интервале с 390 по 540 секунды инкубации. В остальные периоды инкубации достоверных различий в морфометри-ческих параметрах лимфоцитов между гипо- и изотоническими средами не выявлено (таблица 44).
На 180 секунде инкубации диаметр, объем и площадь поверхности ядра уменьшились соответственно на 3%; 9,8 % и 6,4% (р 0,05), на 270 секунде - на 3,4%; 10,5% и 7% (р 0,05) и 330 секунде - на 3%; 8,8% и 5,8% (р 0,05) по сравнению с изотоническим раствором. В интервале с 420 и по 480 секунды наблюдали реакцию увеличения объема ядра. К 480 секунде диаметр объем и площадь поверхности ядра возросли соответственно на 4%; 12% и 8% (р 0,05) по сравнению с контролем. Начиная с 510 и по 570 секунды, вновь наблюдали сморщивание ядер. К окончанию инкубации разницы в размерах ядер между исследуемыми пробами не выявлено (таблица 45).
Таким образом, анализируя развитие осморегуляторных реакций лимфоцитов больных ХЛЛ в условиях блокады Са2+-сигнальных путей можно отметить асинхронность и разнонаправленность реакций ядра и клетки в целом. Клетка начинала увеличиваться в размерах на 90 секунде, затем следовал период уменьшения ее объема в течение 240 секунд, который вновь сменялся фазой увеличения объема с 390 по 540 секунды инкубации. Ядро в гипотонической среде уменьшалось в размерах в течение первых 330 секунд, и лишь начиная с 420 и по 570 секунды – ее размеры увеличивались, задействовав внутриклеточные мембранные резервы в процессах регуляции объема. Длительность периодов увеличения размеров ядра и клетки были одинаковы и составили 150 секунд, но реакция уменьшения объема ядра развивалась на 300 секунд позже, чем у клетки в целом.
Особенности цитоархитектоники и упруго-эластические свойства эритроцитов лягушек
В течение первой минуты инкубации значения коэффициента осмотического натяжения плазмалеммы как после активации, так и после блокады Са2+-каналов снизились соответственно на 30 секунде - на 8,6% и 14% (р 0,05), 60 секунде - на 13% и 15,4% (р 0,05) по сравнению с контролем. Затем наблюдали временной интервал, в течение которого значения коэффициента осмотического натяжения в исследуемых группах были практически сходны с контрольными. При этом длительность равновесного интервала под влиянием кальциевой нагрузки составила 120 секунд (с 90 по 210 секунды), а под влиянием верапамила – 60 секунд (с 90 по 150 секунды). В последующие секунды инкубации наблюдали снижение коэффициента осмотического натяжения плазмалеммы: в пробах с Са2+ в интервале со 240 по 300 секунды, с верапамилом – 180 по 300 секунды. На 300 секунде отмечали одинаковые значения коэффициента в условиях активации и блокады Са2+-каналов, которые были ниже относительно контроля на 10% (р 0,05). Затем следовал 60-ти секундный интервал равновесного состояния, при этом значения между исследуемыми пробами практически не различались. На 390 секунде происходило возрастание коэффициента осмотического натяжения плаз-малеммы на 18% (р 0,05) после кальциевой нагрузки и 15% (р 0,05) под влиянием верапамила. Начиная с 510 секунды и до конца инкубации значения коэффициента осмотического натяжения мембраны увеличились как в пробах с Са2+, так и с верапамилом. Общей тенденцией в изменении значений коэффициента осмотического натяжения в условиях активации и блокады Са2+-каналов является его снижение в первые 300 секунд инкубации в гипотоническом растворе, несмотря на то, что клетка в этот момент увеличивается в размерах. При этом выявлена обратная зависимость, чем сильнее набухает клетка, тем больше выражено уменьшение коэффициента осмотического натяжения.
Коэффициент осмотического натяжения кариолеммы при инкубации в среде со сниженной осмолярностью был снижен под влиянием Са2+ нагрузки в течение первых 150 секунд инкубации, верапамила – 180 секунд. Наиболее выраженную реакцию кариолеммы наблюдали в первые 30 секунд инкубации, когда уменьшение коэффициента после активации и блокады Са2+-каналов составляло соответственно 45,6% и 54,6% (р 0,05) по сравнению с контролем. Увеличение коэффициента осмотического натяжения кариолеммы после Са2+-нагрузки установлено на 240 и 270 секундах инкубации на 14% и 21% (р 0,05), при этом в пробах, проинкубированных с верапамилом в этот период изменений в натяжении кариолем-мы по сравнению с контролем не выявлено. Начиная с 390 секунды и до конца инкубации, значения коэффициента осмотического натяжения кариолеммы были снижены.
Анализируя участие плазмалеммы и кариолеммы в развитии осморегуля-торных реакций, приходим к выводу о существовании механизмов внутриклеточной координации, регулирующих степень натяжения плазмалеммы и кариолеммы в гипотонической среде. Так на 300 секунде инкубации в клетке устанавливается равновесие, значения коэффициентов осмотического натяжения плазмалеммы и кариолеммы как под влиянием кальция, так и верапамила, значения составили 1,03±0,03 усл. ед. Затем, начиная с 390 секунды, реакции мембран были разнона-правлены: коэффициент осмотического натяжения плазмалеммы увеличился, а кариолеммы снизился по отношению к контролю.
Показатель ЯЦО в контроле был достоверно выше практически на протяжении всего времени инкубации (рисунок 47).
В течение первых 210 секунд изменения ЯЦО в пробах проинкубированных как с кальцием, так и с верапамилом, были одинаковы: на 30 секунде показатель ЯЦО уменьшился на 36,8%, 120 секунде – 36%, 150 секунде – 17% (р 0,05). В интервале с 240 по 420 секунды достоверных различий между исследуемыми группами не выявлено. В промежутке времени с 450 по 900 секунды отмечали снижение ЯЦО как под влиянием Са2+, так и верапамила. Показатель ЯЦО на 450 секун 158 де инкубации, в пробах с Са2+ уменьшился на 56% (р 0,05), а в пробах с верапа-милом – на 67% (р 0,05) по сравнению с контролем. На 540 секунде показатель ЯЦО после кальциевой нагрузки снизился на 69% (р 0,05), а после воздействия верапамила – на 41% (р 0,05). Более выраженное сокращение площади поверхности ядра по отношению к площади поверхности цитоплазмы под влиянием ионов Са2+ к концу инкубации свидетельствует о развитии дисрегуляторных реакций в клетке.
Сравнивая использование мембранного резерва ядром и клеткой в гипотонической среде под влиянием кальция и верапамила видно, что внутриклеточные мембранные резервные были задействованы в меньшей степени по сравнению с поверхностными структурами плазмалеммы.
Таким образом, в лимфоцитах больных ХЛЛ, проинкубированных с Са2+ и верапамилом, помещенных в гипотоническую среду, наблюдали увеличение ис 159 пользования мембранного резерва ядром и клеткой. Установлен циклический характер в использовании дополнительных резервных структур мембранами. Интенсивное увеличение объема клеток реализовалось в течение 330 секунд, в то время как их ядер - 270 секунд. Следовательно, лимфоцитам больных ХЛЛ свойственна асинхронность по времени (60 секунд) в развитии осморегуляторных реакций на уровне плазмалеммы и кариолеммы.
Сравнительный анализ регуляции объема лимфоцитов больных ХЛЛ в изотонической среде в условиях активации и блокады Са2+-каналов В изотонической среде морфометрические параметры лимфоцитов, проинкубированных с Са2+ и верапамилом возросли в течение часовой инкубации (таблица 49). Таблица 49 - Морфометрические параметры лимфоцитов больных ХЛЛ под влиянием Са + и верапамила в изотоническом растворе
Увеличение размеров клеток наблюдали в течение первой минуты воздействия: объем и диаметр лимфоцитов возросли на 33,5% и 137% (р 0,05) в пробах с Са2+, 39% и 169% (р 0,05) - с верапамилом. К концу инкубации диаметр и объем лимфоцитов увеличился на 51% и 242% (р 0,05) в пробах с Са2+, на 40% и 175% (р 0,05) с верапамилом.
В течение всего времени инкубации в изотонической среде, наблюдали увеличение размеров ядра клеток, проинкубированных с Са2+ и верапамилом. Реакции увеличения объема ядра под влиянием кальциевой нагрузки и верапамила наблюдали в первые 30 секунд инкубации: диаметр и объем возросли на 18,7% и 65,5% (р 0,05), под влиянием верапамила - на 26% и 59% (р 0,05) по сравнению с контролем (таблица 50).
Влияние функциональных нагрузок на реакции регуляции объема эритроцитов лягушек в осмотических тестах (in vitro)
Ha 90 секунде коэффициент эксцентричности ядра в пробах с адреналином увеличился на 15% (р 0,05) по сравнению с контролем и 25% (р 0,05) по сравнению с обзиданом. В интервале с 360 по 390 секунды ядро приобрело округлую форму, при этом значения коэффициента эксцентричности во всех исследуемых пробах достоверно не различались. В период с 420 по 510 секунды коэффициент эксцентричности ядра в пробах с адреналином увеличился в среднем на 24% (р 0,05) по сравнению с контролем и пробами с обзиданом.
На 30 секунде инкубации объем ядра, под влиянием адреналина и обзидана уменьшился соответственно на 68% и 27% (р 0,05) по сравнению с контролем. Уменьшение объема ядра под влиянием адреналина наблюдали на 180, 330 и 450 секундах инкубации соответственно на 82,7%, 79% и 72,5% (р 0,05) по сравнению с контролем. На 510 секунде объем ядра под влиянием адреналина увеличил 231 ся по сравнению с контролем и пробами с обзиданом соответственно на 34% и 21% (р 0,05). К окончанию инкубации (3600 секунда) объем ядра в пробах с адреналином превысил значения контроля на 21% (р 0,05).
Коэффициент осмотического натяжения плазмалеммы эритроцитов под влиянием адреналина и обзидана уменьшился в течение первых 90 секунд инкубации в гипотонической среде. В пробах, обработанных обзиданом, наблюдали снижение коэффициента осмотического натяжения мембраны на 60 секунде инкубации на 56% (р 0,05) по сравнению с контролем (
Ha 120 и 3600 секундах инкубации коэффициент осмотического натяжении плазмалеммы во всех исследуемых пробах был практически одинаковым, что свидетельствует об установлении равновесия между потоками веществ в клетку и из нее. Начиная со 150 секунды инкубации в пробах с адреналином, изменения коэффициента осмотического натяжения плазмалеммы, протекали циклически. 60-ти секундные периоды уменьшения коэффициента натяжении плазмалеммы чередовались с 90 секундными циклами увеличения коэффициента натяжения плазмалеммы.
Под влиянием обзидана коэффициент осмотического натяжения плазма-леммы увеличился по сравнению с контролем и пробами с адреналином в период с 330 по 3600 секунды инкубации. Коэффициент осмотического натяжения ка-риолеммы под влиянием адреналина снизился, а обзидана – увеличился на протяжении практически всего времени инкубации в гипотонической среде по сравнению с контролем (см. таблицу 81).
Под влиянием адреналиновой нагрузки ни клетка, ни ядро не участвовали в осморегуляторных реакциях. В условиях блокады -адренорецепторов клетки не участвовали в реакциях осморегуляции и не использовали мембранный резерв плазмалеммы, в то время как ядро вовлекало 73% внутриклеточного мембранного резерва в реакциях регуляции объема на 120 секунде инкубации в гипотонической среде.
Таким образом, под влиянием адреналина в гипотонической среде объем эритроцитов и их ядер уменьшился, коэффициент осмотического натяжения мембран снизился, и использование мембранного резерва клеточными структурами уменьшилось. Под влиянием обзидана в гипотонической среде ядра эритроцитов приобрели округлую форму вследствие интенсивного увеличения объема. В условиях блокады -адренорецепторов коэффициент осмотического натяжения карио-леммы увеличился, ядро интенсивно использовало внутриклеточные бассейны мембранного резерва.
Сравнительный анализ регуляции объема эритроцитов в изотонической среде в условиях активации и блокады р-адренорецепторов При инкубации эритроцитов в изотонической среде в течение первых 150 секунд коэффициент эксцентричности клеток увеличился как в пробах с адреналином, так и с обзиданом (таблица 82).
Под влиянием адреналина в изотонической среде наблюдали наиболее выраженные изменения формы. На 60 секунде инкубации коэффициент эксцентрич 234 ности эритроцитов увеличился на 26% (р 0,05) в пробах с адреналином, и на 12% (р 0,05) в пробах с обзиданом. Наиболее выраженное увеличение коэффициента эксцентричности эритроцитов наблюдали на 240 и 900 секундах соответственно на 14,5% и 15% (р 0,05) по сравнению с контролем. К окончанию воздействия коэффициент эксцентричности клеток в пробах с адреналином и обзиданом возрос соответственно на 18% и 10% (р 0,05) по сравнению с контролем.
В изотонической среде объем эритроцитов под влиянием адреналиновой нагрузки уменьшился и оставался таковым на протяжении всего времени инкубации, при этом, в пробах преинкубированных с обзиданом – увеличился по сравнению с контролем (см. таблицу 82). На 60 секунде инкубации объем эритроцитов под влиянием адреналиновой нагрузки сократился на 11,8% (р 0,05) по сравнению с контролем и 13,5% (р 0,05) по сравнению с пробами, обработанными обзи-даном. Существенное уменьшение объема клеток, под влиянием адреналина отмечали на 270 и 360 секундах, соответственно на 19% и 16% (р 0,05) по сравнению с контролем, и на 26,5% и 50% (р 0,05) по сравнению с пробами, проинкубированными с обзиданом. К окончанию инкубации (3600 с) значения объема эритроцитов после адреналиновой нагрузки практически восстановились до контрольных, а в пробах с обзиданом были повышены на 11,2% (р 0,05) по сравнению с контролем.
Изменения формы ядра эритроцитов под влиянием адреналина и обзидана наблюдали в течение 150 секунд от начала инкубации клеток в изотонической среде, а так же в конце с 900 по 3600 секунды. Под влиянием адреналина на 30 секунде инкубации коэффициент эксцентричности ядра снизился на 5,4% (р 0,05) по сравнению с контролем и 8% (р 0,05) по сравнению с пробами с обзиданом (таблица 83).
Под влиянием, как адреналина, так и обзидана объем ядра в изотонической среде в первые 30 секунд инкубации снизился соответственно на 21,2% и 19,4% (р 0,05) по сравнению с контролем. Под влиянием обзидана наблюдали более выраженное уменьшение объема ядра, начиная с 90 секунды и до конца инкубации (см. таблица 83). Под влиянием адреналина ядро увеличило свой объем, начиная с 330 секунды и до конца инкубации в изотонической среде. На 510 секунде воздействия объем ядра в изотонической среде под влиянием адреналиновой нагрузки увеличился на 101% (р 0,05) по сравнению с контролем и 167% (р 0,05) по сравнению с пробами, проинкубированными с обзиданом. К окончанию инкубации (3600 секунда) объем ядра под влиянием адреналиновой нагрузки превышал значения в контроле и пробах, обработанных обзиданом соответственно на 30 и 99% (р 0,05).
В условиях как активации, так и блокады -адренорецепторов в изотонической среде не выявлено развитие осморегуляторных реакций и использование мембранных бассейнов ни клетками, ни ядрами.
Таким образом, под влиянием адреналина в изотоническом растворе клетка и ядро приобрели эллипсоидную форму. Коэффициент эксцентричности клетки возрос, а ее объем уменьшился, в результате чего клетка не задействовала мембранные резервы в регуляции объема.
