Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 9
1.1. Эволюция системы крови 9
1.1.1. Кровь как внутренняя среда организма 9
1.1.2. Клетки крови 11
1.1.3. Кроветворение 20
1.2. Морфофизиология клеток крови позвоночных животных 23
1.2.1. Эритроциты 23
1.2.2. Лимфоциты 26
1.2.3. Гранулоциты 27
1.3. Регуляция объёма клеток 36
1.4. Изучение морфологических особенностей и механических свойств клеток с помощью атомно-силовой микроскопии 43
Глава 2. Материал и методы исследования 45
Глава 3. Результаты исследования 53
3.1. Морфофункциональная характеристика клеток крови позвоночных животных разных классов 55
3.1.1. Млекопитающие 55
3.1.2. Птицы 58
3.1.3. Рептилии 61
3.1.4. Амфибии 63
3.1.5. Костные рыбы 66
3.2. Сравнительная оценка мембранного резерва и механических свойств клеток разных пулов 69
3.2.1. Мембранный резерв 69
3.2.2. Модуль Юнга 70
3.3. Эволюция морфофункциональной организации клеток крови позвоночных животных 71
3.3.1. Эритроциты 71
3.3.2. Лимфоциты 75
3.3.3. Гранулоциты 78
3.4. Изучение морфометрических показателей гемоцитов с помощью атомно-силовой микроскопии 81
3.4.1. Эритроциты 81
3.4.2. Лимфоциты 84
3.4.3. Гранулоциты 87
Глава 4. Обсуждение результатов исследования 89
4.1. Эволюция клеток крови 89
4.1.1. Эритроциты 89
4.1.2. Лимфоциты 93
4.1.3. Гранулоциты 94
4.2. Атомно-силовая микроскопия как перспективный метод изучения морфологических особенностей и механических свойств клеток крови 95
Выводы 97
Библиографический список 98
- Кроветворение
- Изучение морфологических особенностей и механических свойств клеток с помощью атомно-силовой микроскопии
- Лимфоциты
- Эритроциты
Введение к работе
Актуальность исследования.
Исследования XIX и XX веков позволили описать и систематизировать клетки крови беспозвоночных и позвоночных животных (А.А. Заварзин, 1953, 1976, 1985; R.P. Dales, 1964; R.B. Hill et el., 1966; H.E. Jordan, 1938; D.S. Linthicum, 1975; С Mangum, 1970), установить основные функции и закономерности их эволюционного становления (В.Н. Беклемишев, 1964; В.Г. Галактионов, 1975, 1997, 2005; И.И. Мечников, 1883; 1884, 1898). Одной из морфофункциональных особенностей клеток крови является мембранный резерв, заложенный в складчатости плазмалеммы. Мембранный резерв может использоваться макро- и микрофагами на образование фагосом, формирование эритроцитами (кроме млекопитающих), лейкоцитами и тромбоцитами псевдоподий при амебоидном движении, а также на деформацию гемоцитов при прохождении через капилляры (У. Багги, 1988; Геннис Р., 1997; П. Каппуччинелли, 1982; Л.Н. Катюхин, 2003; Л.Д. Крымский с соавт., 1976). В поддержании функциональной активности форменных элементов крови большое значение имеет система саморегуляции объёма клеток и упругие свойства гемоцитов (С.Н. Орлов с соавт., 1996; R. Kinne, 1993).
Величина мембранного резерва лейкоцитов млекопитающих (и, прежде всего, человека) хорошо изучена. Установлена его роль в обеспечении микрореологических свойств, механизмы возврата участков мембраны в плазмалемму после разрушения фагосом (СБ. Милакин, 1989). Работы по изучению величины мембранного резерва ядерных клеток крови низших позвоночных животных не проводились. Оценка этого показателя имеет важное значение не только для уточнения направлений эволюции морфофункциональной организации клеток крови, но также для понимания механизмов возникновения нарушений и патологических изменений в системе крови человека.
В связи с вышеизложенным целью работы была сравнительная оценка морфофункциональной организации форменных элементов крови позвоночных животных разных классов.
Для достижения цели исследования были поставлены следующие задачи:
изучить наличие и величину мембранного резерва форменных элементов крови позвоночных животных;
определить модуль Юнга гемоцитов;
сравнить осморегуляторные реакции клеток крови;
установить тенденции эволюции морфофункциональной организации форменных элементов крови.
Научная новизна исследования. Впервые проведена сравнительная оценка объемных показателей и мембранного резерва ядерных гемоцитов (лейкоцитов и эритроцитов) основных классов позвоночных животных. Установлено наличие
эволюционной закономерности складчатости плазмалеммы клеток крови:
филогенез эритроцитов идет в сторону уменьшения резерва
цитоплазматической мембраны, а лейкоцитов - в сторону увеличения.
Впервые установлена связь осморегуляторных реакций клеточного объема с
экологическим положением животных. Методом атомно-силовой
микроскопии определены показатели упругости клеток крови в
эволюционном ряду. Показано отсутствие связи упругих свойств с уровнем
организации животных. Анализ величины мембранного резерва ядерных
гемоцитов позволил впервые дать сравнительную оценку
микрореологических свойств клеток крови позвоночных животных.
Теоретическая и практическая значимость исследования.
Полученные в исследовании данные дополняют современные представления об эволюционном развитии защитных функций и микрореологических свойств клеток крови. Уменьшение мембранного резерва эритроцитов идет параллельно со специализацией на дыхательной функции и утратой способности к фагоцитозу. Увеличение резерва плазмалеммы лейкоцитов лимфоидного и миелоидного ряда создает благоприятные условия для реализации фагоцитарной функции и деформации при прохождении по микрососудам.
Наличие мембранного резерва ядерных эритроцитов позвоночных животных, позволяющего реализовать реакции миграции, поглощения и деформации клеток в узких капиллярах, делает возможным их использование в качестве модели для испытания лекарственных и других корригирующих препаратов в экспериментальной биологии и медицине.
Полученные результаты нацеливают на проведение новых исследований, по изучению общих рецепторных механизмов и сигнальных путей ядерных эритроцитов и лейкоцитов, что может стать полезным в понимании причин возникновения ряда заболеваний человека.
Основные положения диссертации, выносимые на защиту:
филогенез эритроцитов идёт в сторону снижения мембранного резерва, а лейкоцитов - в сторону его увеличения;
упругие свойства форменных элементов крови не определяются эволюционно-систематическим положением животных;
степень развития системы регуляции объёма клеток крови определяется не уровнем организации животных, а их экологическим положением.
Апробация результатов работы. Материалы диссертации доложены и обсуждены на 11 Международной школе-конференции молодых учёных (Пущино, 2007), XLV Международной научной конференции «Студент и научно-технический прогресс» (Новосибирск, 2007), VI Молодёжной научной конференции Института физиологии НЦ Уро РАН (Сыктывкар, 2007), XX Съезде Физиологического общества им. И.П. Павлова (Москва, 2007), VI Сибирском физиологическом съезде (Барнаул, 2008), II Съезде
физиологов СНГ (Кишинёв, 2008), XV Школе-конференции «Актуальные проблемы биологии развития» (Звенигород, 2008).
Объем и структура диссертации. Диссертация содержит 120 страниц машинописного текста, 15 таблиц, 39 рисунков. Рукопись состоит из введения, четырёх глав основной части (обзор литературы, материал и методы исследования, результаты исследования, обсуждение результатов), выводов и библиографического списка, включающего 249 источника (231 отечественных и 18 зарубежных публикаций).
Кроветворение
Центральным моментом исторического развития системы крови является эволюция органов кроветворения (Иржак Л.И., 1983). В процессе эволюции происходит изменение топографии кроветворения, усложнение структуры и дифференциация функций кроветворных органов (Акилов А.Т. с соавт., 1983; Чертков И.Л. с соавт., 1997; Чертков И.Л. с соавт., 1984; Чертков И.Л. с соавт., 1991; Чертков И.Л., 1993; Шубникова Е.А., 1981; Эмерсон С.Дж., 2000).
Беспозвоночные животные не имеют специализированных органов кроветворения: гемопоэтические элементы находятся в различных частях тела (Иржак Л.И., 1983).
Очаги кроветворения, имеющие органную специфику, впервые появляются в стенке пищеварительного канала у низших позвоночных (кругло-ротые) (Заварзин, А.А., 1953, 1976, 1985). В этих очагах основу составляет ретикулярная ткань, имеются широкие капилляры (синусоиды) (Заварзин, А.А., 1953, 1976, 1985).
У хрящевых и костных рыб формируется обособленный кроветворный орган - селезенка, появляется тимус (Анисимова И.М., Лавровский В.В., 1983; Наумов Н.П., Карташов Н.Н., 1979). Очаги кроветворения, главным образом гранулоцитопоэза, имеются также в мезонефросе, интерре-нальной железе, гонадах, эпикарде (Наумов Н.П., Карташов Н.Н., 1979). У костных ганоидов впервые отмечается локализация кроветворения в костной ткани, а именно в полости черепа над областью IV желудочка (Анисимова И.М., Лавровский В.В., 1983). На этом этапе эволюции стенка кишки уже не является основным кроветворным органом, однако у рыб и вышестоящих классов позвоночных в ней сохраняются очаги лимфоцитопоэза (ЖитеневаЛ.Д., 1999).
У хвостатых амфибий кроветворение сосредоточено в селезенке, краевой зоне печени, в мезонефросе, эпикарде (Наумов Н.П., Карташов Н.Н., 1979). У бесхвостых амфибий кроветворными органами являются селезенка и костный мозг, который функционирует только сезонно (Иржак Л.И., 1983). Небольшие скопления лимфоидной ткани — примитивные предшественники лимфатических узлов — появляются в подмышечных и паховых областях (Заварзин, А.А,, 1985). Таким образом, у земноводных намечается органное разделение собственно кроветворной и лимфатической ткани, которое становится более отчетливым на следующих стадиях эволюции.
У рептилий и птиц кроветворение сосредоточивается в костном мозге; селезенка выполняет в основном функции лимфоцитопоэза и депонирования крови (Евстратова A.M., 1970; Иржак Л.И., 1983; Наумов Н.П., Карташов Н.Н., 1979). У птиц, в отличие от других позвоночных, наряду с тимусом имеется своеобразный лимфоэпителиальный орган — фабрициева сумка, с которой связано происхождение В-лимфоцитов, осуществляющих гуморальные реакции иммунитета (Физиология сельскохозяйственных животных, 1980).
У млекопитающих основным кроветворным органом становится костный мозг, развивается система лимфатических узлов. Селезенка утрачивает функцию образования клеток красного ряда, гранулоцитов, мегака-риоцитов и только у низших млекопитающих сохраняет очаги эритроцито-поэза (Воробьёв А.И. с соавт., 1995; Захаров Ю.М. с соавт., 1984; Захаров Ю.М., 1991; Козинец Г.И. с соавт., 1982; Козинец Г.И., Погорелов В.М., 1998; Моисеева О.И., 1985; Мосягина Е.Н. с соавт., 1976; Мосягина Е.Н. с соавт., 1976; Натан Д.Г. с соавт., 1994; Терентьева Э.И. с соавт., 1972).
Форма и размеры эритроцитов. Эритроциты млекопитающих являются узкоспециализированными клетками, осуществляющими дыхательную функцию крови. В процессе созревания они утрачивают ядро и приобретают форму двояковогнутого диска (у мозоленогих эллипсоидные) (Вельш У., Шторх Ф., 1976). Красные кровяные клетки млекопитающих имеют сравнительно небольшие размеры. Так диаметр эритроцитов человека составляет 7.5 мкм, а толщина 2.2 мкм (Клиорин А.И. с соавт., 1974; Флиндт Р., 1992).
Двояковогнутая форма эритроцитов и их малые размеры обеспечивают увеличение площади поверхности клеток, что способствует более быстрой и равномерной диффузии газов через плазмалемму (Иржак Л.И., 1964; Иржак Л.И., 1975; Иржак Л.И., 1979; Истанманова Т.С., 1963; Иста-манова Т.С. с соавт., 1973; Катюхин Л.Н., 1995, 2003; Коржуев П.А., 1949, 1964; Крепе Е.М, 1943; Миклеев A.M. с соавт., 1984; Муравьев А.В. с соавт., 2000; Муравьев, А.В., Чепоров СВ., 2009; Новицкий В.В. с соавт., 2001; Новожилов А.В., Катюхин Л.Н., 2008). Кроме того, при такой форме клетки обладают большей способностью к обратимой деформации при прохождении через узкие капилляры (Александрова Н.П. с соавт, 1988; Алов И.А. с соавт., 1969; Джонсон П., 1982; Зинчук В.В., 2001; Каро К. с соавт., 1981; Козлов В.И., 1970; Левтов В.А. с соавт., 1982; Сторожок С.А., 1998; Чижевский А.Л., 1959).
Эритроциты других позвоночных существенно отличаются от красных кровяных клеток млекопитающих тем, что в зрелом состоянии содержат ядро, которое обусловливает их двустороннюю выпуклость. Кроме того, они крупнее по размерам и имеют эллипсоидную форму.
Наименьшая величина ядерных эритроцитов характерна для птиц, наибольшая для хвостатых амфибий (Коштоянц Х.С, 1940; Проссер Л. Браун Ф., 1967). Кроме того, существует зависимость между количеством эритроцитов в крови и их размерами (Иржак Л.И., 1983; Шмаров А.Д. с со-авт., 2002) (рис. 10).
Изучение морфологических особенностей и механических свойств клеток с помощью атомно-силовой микроскопии
Эволюция клеток крови позвоночных животных идёт в сторону узкой функциональной специализации, что сопровождается соответствующими структурными преобразованиями.
Эволюционные изменения морфофункциональной организации красных кровяных клеток связаны с совершенствованием дыхательной функции крови. Для дыхательного обмена большое значение имеет степень насыщенности эритроцитов дыхательным пигментом, и величина их общей поверхности, являющейся производной размера и формы отдельных эритроцитов (Заварзин, А.А., 1953; Иванова Н.Т., 1995; Иржак Л.И., 1983; Иса-баеваВ.А., 1981; Истанманова Т.С., 1963).
Эритроциты позвоночных подразделяются на ядерные плоскоэллипсоидные (характерны для круглоротых, хрящевых и костных рыб, амфибий, рептилий и птиц) и безъядерные дискообразной формы (характерны для млекопитающих) (рис. 38). Как показали наши исследования «толщина» (малая ось эллипсоида) красных кровяных клеток разных систематических групп примерно одинакова, несмотря на порой значительные различия по «длине» и «ширине». Так результаты измерений живых клеток полученные с помощью атомно-силового микроскопа в полуконтактном режиме сканирования дают величину малой оси 2 мкм; а измерения в объёме жидкости в камере Горяева с использованием системы «Видео-Тест» указывают на «толщину» эритроцитов 4 мкм. Таким образом, для обеспечения максимального насыщения гемоглобина кислородом уже на ранних стадиях эволюции эритроциты приобретают максимально уплощённую форму.
В ходе исторического развития позвоночных наблюдается тенденция к уменьшению размеров эритроцитов. При этом по мере повышения уровня организации водных черепных красные кровяные клетки становятся мельче, а при переходе анамний к земно-водному образу жизни (у амфибий) происходит их резкое и существенное укрупнение. Для наземных позвоночных (амниот) по мере перехода к теплокровности характерна тенденция к уменьшению объёма эритроцитов. Согласно нашим данным размеры (длинная ось х средняя ось) красных кровяных клеток сазана составляют 12.58 х 8.86 мкм, лягушки - 21.90 х 14.11 мкм, трионикса - 18.52 х 10.65 мкм, курицы- 10.84 х 6.94.
Таким образом, в процессе уменьшения линейных размеров, обеспечивающего увеличение отношения площади поверхности к объёму, эллипсоидных эритроцитов сокращению подвергаются длинная и средняя оси, а длина малой оси примерно одинакова у представителей различных систематических групп.
Складчатость плазмалеммы находящаяся преимущественно над ядром, наряду с уменьшением объёма, также обеспечивает совершенствование дыхательной функции эритроцитов (рис. 39). Причём мембранный резерв может составлять до 14% от площади поверхности клетки (у амфибий). Однако по мере повышения уровня организации животных наблюдается тенденция к снижению величины резервной площади плазмалеммы, как в абсолютном, так и относительном выражении. Из этого следует, что эволюция красных кровяных клеток идёт в сторону увеличения суммарной площади поверхности, приходящейся на единицу объёма клетки благодаря уменьшению линейных размеров, а не роста складчатости. Однако в случае скачкообразного существенного укрупнения эритроцитов произошедшего у земноводных, чтобы компенсировать сокращение отношения площади поверхности к объёму, произошло возрастание доли мембранного резерва.
Исследование осморегуляторных реакций ядерных эритроцитов позвоночных разных классов показало их способность к регуляции объёма. Причём колебания этого показателя как в сторону увеличения, так и в сторону уменьшения, в сравнении с другими типами клеток, незначительны и составляют 5%. Резистентность красных кровяных клеток к умеренной гипотонии может быть обусловлена как наличием развитых механизмов регуляции объёма, так и особенностями организации внутриклеточных опорных структур цитоскелета (Е.А. Смирнова, Н.Н. Казачкина, В.И. Гребенщикова, Ю.С. Ченцов, 1987). При этом наблюдается связь между способностью клеток к увеличению размеров и величиной резервной площади плазмалеммы. Это объясняется тем, что возрастание объёма возможно только при пропорциональном увеличении площади поверхности.
Таким образом, можно предположить, что для эритроцитов критически важно поддерживать величину объёма постоянной. Возможно, в связи с этим и происходит в процессе эволюции сокращение мембранного резерва, характерного для амебоидных «предков» красных кровяных клеток.
Однако то, что мембранный резерв эритроцитов в ходе эволюции не исчезает полностью и сохраняется даже у птиц (4%), указывает на его физиологическую значимость. Несмотря на чёткую функциональную специализацию, красные кровяные клетки сохраняют такие архаичные признаки, как способность к фагоцитозу (Prunesco Р., 1971) и миграционная активность (Чернявских С.Д. с соавт., 2008).
Лимфоциты являются иммунокомпетентными клетками, которые осуществляют специфическую клеточную и гуморальную защиту организма от всех антигенно чужеродных веществ как экзогенной, так и эндогенной природы, поддерживая генетическую целостность особей вида в течение их индивидуальной жизни и обеспечивая, таким образом, эволюционный прогресс в мире животных по линии увеличения абсолютного количества соматических клеток (Галактионов В.Г., 2005).
Динамика размеров лимфоцитов в процессе эволюции соответствует таковой эритроцитов. Так диаметр лейкоцитов сазана составляет 5.36 мкм, лягушки - 11.05 мкм, трионикса — 8.17 мкм, а курицы и крысы 4.88 мкм и 6.20 мкм соответственно. Уменьшение линейных размеров лимфоцитов в процессе исторического развития обеспечивает увеличение отношения площади поверхности клеток к их объёму, что сопряжено с интенсификацией метаболизма в ряду позвоночных (Иржак Л.И., 1983; Исабаева В.А., 1981).
В процессе исторического развития позвоночных животных наблюдается увеличение доли мембранного резерва лимфоцитов. Морфофизио-логический прогресс земноводных, связанный с выходом на сушу, сопровождался резким увеличением мембранного резерва агранулоцитов (у лягушки 53%). Складчатость плазмалеммы рептилий по сравнению с земноводными ниже (у трионикса вдвое меньше, чем у лягушки). Но в ходе дальнейшей эволюции, приведшей к возникновению млекопитающих и птиц, площадь мембранного резерва лимфоцитов значительно возрастает (крыса - 42%, курица - 58%).
Лимфоциты
В настоящее время большое внимание уделяется изучению морфологических параметров и механических свойств клеток методами атомно-силовой микроскопии (АСМ). В настоящей работе проводилось исследование морфометрических показателей живых клеток крови позвоночных животных разных классов с помощью сканирующей зондовой микроскопии в полуконтактном режиме сканирования с целью сопоставления результатов с аналогичными показателями фиксированных клеток, полученными с помощью анализатора изображений «ВидеоТест» (табл. 13).
Из таблицы видно, что значения длин большой и средней осей для разных методов измерения фактически одинаковы. Что же касается малой оси, то различия здесь существенные. Это является следствием распластывания живых клеток на поверхности подложки.
И как результат обнаруживается большая разница между значениями объёма и площади поверхности клеток (2-3 раза). Однако, результаты, полученные с помощью АСМ следует признать более точными, так как все расчёты в данном случае осуществляются с помощью специального программного обеспечения. Таким образом, имеются очевидные преимущества в использовании атомно-силовой микроскопии для определения морфометрических показателей клеток.
Опытным путём установлено, что сканирование живых клеток в полуконтактном режиме не приводит к их деформации. Из рисунка 35 видно, что ядерные эритроциты позвоночных имеют эллипсоидную форму. Вследствие низкой жёсткости клетки распластываются на подложке. Обращает на себя внимание резко выступающее ядро, которое имеет эллипсоидную форму и обладает большей жёсткостью, чем цитоплазма, так как практически не распластывается на поверхности стекла.
Из таблицы 14 видно, что значения диаметров живых лимфоцитов заметно больше, чем аналогичные показатели фиксированных клеток. При этом следует обратить внимание на сильную степень распластывания живых лимфоцитов на поверхности подложки (диаметр клетки превышает её высоту примерно в 10 раз). Таким образом данные по диаметру клеток, полученные с помощью АСМ являются существенно завышенными.
Обнаруживаются и значительные различия производных линейных размеров — площади поверхности и объёма клеток. При этом значения, полученные для фиксированных клеток, превышают таковые для живых клеток в несколько раз. Связано это с тем, что фиксация клеток производилась после приготовления мазка, которое приводило к нарушению формы ин-тактных лимфоцитов, а расчёты площади и объёма основывались на допущении шарообразности клеток.
Известно, что лимфоциты являются шарообразными клетками, содержащими ядро и сравнительно мало цитоплазмы. Из рисунка 36 видно, что поверхность клеток является складчатой.
Эритроциты
В данной работе проводилась сравнительная оценка морфофункцио-нальной организации красных кровяных клеток животных четырёх классов позвоночных с целью установления эволюционных закономерностей.
Известно, что по мере эволюции водных позвоночных наблюдается уменьшение размеров эритроцитов (рис. 23). Однако при переходе к земно-водному образу жизни происходит их резкое и существенное укрупнение. Для наземных позвоночных (амниот) по мере перехода к теплокровности характерна тенденция к уменьшению объёма красных кровяных клеток.При этом в процессе уменьшения линейных размеров эллипсоидных эритроцитов наибольшему сокращению подвергаются длинная и средняя оси, а длина малой оси примерно одинакова у всех изученных видов.
По мере повышения уровня организации животных от костных рыб до птиц наблюдается тенденция к снижению доли резервной площади плазмалеммы при максимальном её значении у амфибий (рис. 24). Более того, из рисунков 23 и 24, то видно, что более крупным клеткам, как правило, соответствует больший мембранный резерв.
Однако, если проводить сравнение по относительным показателям (отношения общей площади плазмалеммы и площади резерва мембраны к нормальному объёму), то видно, что эволюция эритроцитов идёт в сторону увеличения суммарной площади поверхности, приходящейся на единицу объёма клетки, благодаря уменьшению линейных размеров, а не роста мембранного резерва (рис. 25). Таким образом, в ходе исторического развития красных кровяных клеток их поверхность становится менее складчатой, но в тоже время удельная площадь поверхности возрастает благодаря уменьшению объёма. (различия по каждому виду и между видами достоверны, Р 0.05). Из рисунка 26 видно, что набуханию в гипотонической среде подвергаются эритроциты более низкоорганизованных животных. При этом наблюдается связь между способностью клеток к увеличению размеров и величиной резервной площади плазмалеммы. Это объясняется тем, что возрастание объёма возможно только при адекватном увеличении площади поверхности. Эритроциты же наземных позвоночных, обладающие меньшим мембранным резервом, устойчивы к умеренно-гипоосмотической нагрузке. Динамика размера лимфоцитов в процессе эволюции аналогична таковой эритроцитов (рис. 27). То есть при выходе позвоночных на сушу происходило значительное укрупнение клеток, которое нивелировалось у истинно наземных животных. По мере повышения уровня организации позвоночных животных наблюдается тенденция к возрастанию доли мембранного резерва лимфоцитов (рис. 28). Морфофизиологический прогресс позвоночных, связанный с выходом на сушу (амфибии), сопровождался резким увеличением мембранного резерва (MP) агранулоцитов. Складчатость плазмалеммы рептилий по сравнению с земноводными ниже. Но в ходе дальнейшей эволюции, приведшей к возникновению млекопитающих и птиц, площадь мембранного резерва лимфоцитов значительно возрастает на фоне уменьшения их диаметра. плазмалеммы (различия между видами достоверны, Р 0.05). В целом можно отметить, что эволюция лимфоцитов шла в сторону увеличения площади поверхности за счёт уменьшения объёма и роста складчатости поверхностной мембраны.
