Введение к работе
Актуальность исследования
Эффективность доставки кровью веществ и кислорода к клеткам зависит от двух групп факторов: сосудистых и реологических (Н. Schmid-Schonbein, 1975; J.F. Stoltz, 1995; A. Pries, T. Secomb, 2003). В микрососудах, особенно в капиллярах, стенки которых лишены сократительных элементов и вазомоторной иннервации (Г.И. Мчедлишвили, 1995), ведущую роль в тканевой перфузии играют реологические свойства крови и особенно микрореология эритроцитов (Н.Н. Фирсов, 2004; J.F. Stoltz, 1999). По данным ряда авторов снижение деформируемости эритроцитов и их высокая агрегация могут являться ведущим звеном расстройств микроциркуляции (И.А. Соколова и др., 2005; O.K. Baskurt, H.J. Meiselman, 2007). Следовательно, проблема срочного и долговременного изменения микрореологических свойств эритроцитов при адаптации кровотока или компенсации сосудистых нарушений требует своего изучения. Для ее решения имеется ряд предпосылок. Несмотря на простоту конструкции, зрелые эритроциты сохранили многие элементы молекулярных сигнальных путей (D. Miles, 2000; G. Minetti et al., 2004), при активации которых могут изменяться их реологические свойства (S. Manno et al., 2005). Имеется ряд работ, в которых сообщается о том, что под влиянием внеклеточных сигнальных факторов изменяется микрореология эритроцитов (А.В. Муравьев и др., 2002; И.А. Тихомирова, 2006; J.F. Horga et al., 2000; F.A. Carvalho et al., 2006). Вместе с тем лишь отдельные работы посвящены исследованию внутриклеточных сигнальных систем, связанных с микрореологическим поведением эритроцитов (Y. Zipser et al., 2002; С. Saldanha et al., 2007). Кроме того, отсутствуют комплексные исследования всего вне- и внутриклеточного сигнального каскада и анализ вовлечения в регулятор-ный процесс разных внутриклеточных сигнальных путей.
Таким образом, отсутствие в литературе исчерпывающих данных о регуляторных внутриклеточных механизмах изменения агрегации и деформации эритроцитов, а также важная роль этих микрореологических свойств в обеспечении транспорта вещества и энергии в системе микроциркуляции мотивировало проведение настоящего исследования. Кроме того, необходимо заметить, что элементы внутриклеточных сигнальных каскадов могут быть молекулярными мишенями, воздействие на которые может привести к коррекции негативно измененных реологических свойств эритроцитов и крови в целом. Для того чтобы лучше определить величину вклада микрореологических свойств эритроцитов в текучесть цельной крови и ее транспортный потенциал, был изучен комплекс реоло-
гических характеристик крови в условиях физиологической нормы и у лиц с нарушениями артериального сосудистого русла при церебральном склерозе и атеросклерозе сосудов нижних конечностей. Дефицит дилатации в этих условиях может быть либо компенсирован реологическими свойствами крови, или негативные изменения гемореологического профиля приведут к дальнейшей декомпенсации периферического кровообращения.
С учетом вышесказанного была сформулирована цель и основные задачи исследования.
Цель диссертационной работы: исследование роли внутриклеточных эффекторных механизмов эритроцитов, связанных с изменениями их микрореологических свойств, в норме и на фоне атеросклероза.
Задачи исследования:
Изучить гемореологический профиль лиц в норме и при атеро-склеротических изменениях сосудистого русла.
Исследовать роль аденилатциклазной системы в изменениях микрореологических свойств эритроцитов.
Изучить участие протеинкиназ в перестройках микрореологии эритроцитов.
Исследовать элементы кальциевого сигнального пути при изменениях микрореологических свойств эритроцитов.
Научная новизна исследования
Для решения поставленных в работе задач был разработан новый метод регистрации деформируемости эритроцитов на основе проточной микрокамеры и компьютерного анализа изображения клеток. Доказана высокая эффективность применения этого метода для экспериментальных и клинических исследований микрореологии эритроцитов. При анализе реологических характеристик крови норме и у лиц с атеросклеротическими изменениями были получены новые данные об особенностях реологии крови в условиях дефицита сосудистого русла и о вкладе отдельных макро- и микрореологических характеристик в текучесть цельной крови и ее транспортный потенциал. Показана возможность срочного изменения микрореологии эритроцитов под влиянием однократного приема лекарственных препаратов - ингибиторов активности фосфодиэстераз. Впервые получен комплекс доказательств участия аденилатциклазной системы в регуляции микрореологических свойств эритроцитов. Получены новые данные, свидетельствующие о том, что стимулирование протеинкиназы А дает больший позитивный микрореологический эффект, чем активация протеинкиназы С. Впервые установлено, что стимулирование тирозиновых протеинкиназ приводит к заметному повышению деформируемости эритроцитов. Новыми являются данные о том, что изменение уровня Са2+ в
эритроцитах существенным образом влияет на микрореологическое поведение эритроцитов, особенно на их агрегацию.
Теоретическая и практическая значимость работы
При исследовании микрореологического поведения эритроцитов получены новые данные о внутриклеточных механизмах регуляции этих, присущих эритроцитам, клеточных свойств. Методы и подходы, разработанные для изучения регуляторных механизмов изменения микрореологии эритроцитов, могут быть применены и для исследования других типов клеток. В частности разработанный в данном исследовании метод проточной микрокамеры с точно дозированным напряжением сдвига может быть применен для исследования механического нагружения лейкоцитов, клеток сосудистого эндотелия и опухолевых клеток. Определение внутриклеточных молекулярных мишеней, действие на которые сигнальными молекулами меняет реологическое поведение эритроцитов, может быть использовано при разработке новых лекарственных препаратов с целью коррекции негативно измененных реологических свойств эритроцитов. Материалы диссертации расширяют представления о факторах регуляции вязкости крови, а также механизмах изменения микрореологических свойств эритроцитов. Они могут быть использованы в лекционных курсах по физиологии крови и кровообращения для студентов биологических и медицинских факультетов вузов, для написания монографий и практических руководств, а также для организации и проведения дальнейших исследований.
Основные положения, выносимые на защиту:
У лиц с атеросклеротическим поражением сосудистого русла имеется комплекс негативных гемореологических изменений по сравнению с данными лиц контроля. Эти изменения включают повышение вязкости крови и плазмы, прирост агрегации и ригидности эритроцитов.
Повышение активности аденилатциклазный системы эритроцитов: 1) при прямом стимулировании аденилатциклазы форсколином, 2) введением в среду инкубации клеток стабильного аналога ц-АМФ, 3) ингибиро-ванием (в том числе селективным) фосфодиэстераз эритроцитов - приводит к достоверному приросту их деформируемости и снижению агрегации клеток.
При стимулировании цАМФ-зависимой протеинкиназы А в эритроцитах наблюдается статистически достоверное и существенное повышение деформируемости эритроцитов и снижение их агрегации. Тогда как стимулирование протеинкиназы С с помощью форболового эфира и кальциевого ионофора дает меньший микрореологический эффект. Активация тирозиновых протеинкиназ при помощи ванадата натрия, эритропоэтина и цисплатина сопровождается достоверным приростом деформируемости эритроцитов и меньшим изменением их агрегации.
4. Блокирование входа Са в эритроциты при помощи верапамила и его связывание в среде инкубации при помощи хелатора ЭГТА сопровождается достоверным увеличением деформируемости клеток и снижением их агрегации, тогда как повышение внутриклеточного Са2+ путем инкубации клеток с кальциевым ионофором (А23187) сочетается с выраженным приростом агрегации эритроцитов и некоторым снижением их деформируемости.
Апробация результатов работы
Материалы диссертации доложены и обсуждены на международной конференции «Гемореология в микро- и макроциркуляции» (Ярославль, 2005); XX съезде физиологического общества им. Павлова (Москва, 2007); VI международной конференции «Гемореология и микроциркуляция» (Ярославль, 2007); V Всероссийской конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2007); Conference on Clinical Hemorheology and Microcirculation (Дрезден, Германия, 2007); Всероссийской школе-семинаре «Нанобиотехнологии: проблемы и перспективы» (Белгород, 2008, 2009); Всероссийской конференции «Механизмы функционирования висцеральных систем» (Санкт-Петербург, 2008); IV Всероссийской с международным участием школе-конференции по физиологии кровообращения (Москва, 2008); XII Международном конгрессе по Биореологии (Пенсильвания, США, 2008); IV Всероссийской конференции «Клиническая гемостазиология и гемореология в сердечнососудистой хирургии» с международным участием (Москва, 2009); I Международной научно-практической конференции «Научно-техническое творчество молодежи» (Москва, 2009); Европейской конференции по Ге-мореологии (Сан-Мориц, Швейцария, 2009); Европейской школе-конференции по Биореологии, (Варна, Болгария, 2006, 2009).
Публикации: по теме диссертации опубликовано 22 печатных работы, в том числе 5 - в изданиях, рекомендованных Высшей аттестационной комиссией Министерства образования и науки Российской Федерации.
Структура и объем диссертации
Диссертация изложена на 149 страницах печатного текста, включает 25 таблиц и 34 рисунка. Работа состоит из введения, обзора литературы, главы с описанием методов исследования, 2-х глав с изложением полученных результатов, обсуждения, выводов, списка литературы. Библиографический указатель включает 369 источников: 87 отечественных и 262 зарубежных.
