Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 15
1.1 Нейросетевой подход в изучении активности мозга 15
1.1.1. Современные представления о нейронных сетях мозга 15
1.1.2 Морфофункциональные нейронные сети гиппокампа 18
1.1.3. Современные методические подходы к изучению нейронных сетей 23
1.2 Морфофоункциональные характеристики состояний, связанных с нарушением работы нейронных сетей 30
1.2.1 Влияние гипоксии на морфофункциональные характеристики нейронной сети 31
1.2.2 Влияние нарушения энергетического обмена на морфофункциональные характеристики нейронных сетей 34
1.2.3 Роль внеклеточного матрикса мозга в поддержании гомеостаза нейронной сети
1.2.4 Роль кальция в функциональной сигнализации и развитии стресс-реакций в нейронных сетях 43
1.3 Роль молекул межклеточной сигнализации в развитии и адаптации к стрессу нейронных сетей 49
1.3.1. Роль нейротрофического фактора головного мозга в развитии и функционировании нейронных сетей 50
1.3.2. Глиальный нейротрофический фактор головного мозга как регулятор функционирования нейронных сетей 59
1.3.3. Влияние лигандов эндоканнабиноидной системы на морфофункциональные характеристики нейронных сетей 67
1.3.4. Взаимодействие молекул внеклеточной сигнализации BDNF, GDNF
и эндоканнабиноида N-ADA в поддержании гомеостаза нейронной сети 77
Заключение по главе 1 81
Глава 2. Материалы и методы исследования 83
2.1. Объект исследования
2.2. Схема экспериментов 84
2.3. Методы культивирования клеточных культур
2.3.1 Метод культивирования диссоциированных культур клеток гиппокампа 87
2.3.2 Метод культивирования индуцированных плюрипотентных клеток человека 87
2.4. Методы исследования спонтанной биоэлектрической и функциональной кальциевой активности нейронной сети гиппокампа in vitro 89
2.4.1. Мультиэлектродные методы исследования спонтанной биоэлектической активности 89
2.4.2 Функциональный кальциевый имиджинг 94
2.5. Иммуноцитохимическое маркирование клеточных структур 95
2.6. Электронно-микроскопический метод исследования ультраструктуры культур диссоциированных клеток 97
2.7 Биохимические методы исследования 97
2.8. Экспериментальное моделирование стресс условий in vitro
2.8.1. Моделирование нормобарической гипоксии in vitro 98
2.8.2. Моделирование глюкозной депривации in vitro 99
2.8.3. Моделирование нарушений структуры гиалуронового каркаса внеклеточного матрикса мозга 99 2.9 Оценка выживаемости клеток в первичных культурах клеток гиппокампа 100 2.10.Экспериментальные исследования in vivo
2.10.1. Моделирование острой гипобарической гипоксии in vivo 101
2.10.2. Методы оценки антигипоксического действия исследуемых веществ при моделировании острой гипобарической гипоксии in vivo 102
2.10.3. Метод исследования навигационного научения и долговременной памяти - водный лабиринт Морриса 102
2.11. Методы статистической обработки результатов 103
Глава 3. Результаты и их обсуждение 106
3.1 Исследование основных закономерностей развития нейронных сетей in vitro 106
3.1.1 Закономерности развития структуры нейронных сетей первичных культур клеток гиппокампа 106
3.1.2. Закономерности развития функциональной активности нейронных сетей в первичных культурах клеток гиппокампа 117
3.1.3 Особенности развития нейронных сетей, полученных из индуцированных плюрипотентных клеток человека 132
Заключение по главе 3.1. 138
Глава 3.2 Изучение влияния стресс-факторов на функциональное состояние нейронных сетей 140
3.2.1 Влияние глюкозной депривации на функциональную активность и жизнеспособность в культуре диссоциированных клеток гиппокампа 140
3.2.2 Влияние гипоксии на функциональную активность и жизнеспособность диссоциированных культур клеток гиппокампа 153
3.2.3 Влияние факторов ишемии (гипоксии и глюкозной депривации) на морфологию культур диссоциированных клеток гиппокампа 160
3.2.4 Гиалуронидаза-индуцированное изменение функциональной активности нейронной сети первичной культуры клеток гиппокампа 162
Заключение по главе 3.2 176
Глава 3.3. Исследование нейротропного и антигипоксического действия молекул межклеточной сигнализации - нейротрофического фактора головного мозга, глиального нейротрофического фактора и эндоканнабиноида N-арахидоноилдофамина 177
3.3.1 Характеристика нейротропного и антигипоксического действия нейротрофического фактора головного мозга 180
3.3.2 Характеристика нейротропного и антигипоксического действия 203
глиального нейротрофического фактора
3.3.3 Антигипоксическое и нейропротективное действие N арахидоноилдофамина при моделировании острой гипоксии 216
Заключение по главе 3.3 237
Глава 3.4 Исследование влияния исследуемых молекул межклеточной сигнализации на восстановление функциональной активности нейронных сетей in vitro 244
Заключение 253
Выводы 261
Список сокращений 262
Список литературы 267
- Морфофункциональные нейронные сети гиппокампа
- Метод культивирования диссоциированных культур клеток гиппокампа
- Закономерности развития функциональной активности нейронных сетей в первичных культурах клеток гиппокампа
- Исследование нейротропного и антигипоксического действия молекул межклеточной сигнализации - нейротрофического фактора головного мозга, глиального нейротрофического фактора и эндоканнабиноида N-арахидоноилдофамина
Морфофункциональные нейронные сети гиппокампа
Гиппокамп - парное образование в головном мозге позвоночных, расположенное в глубине височных долей мозга и является основной структурой лимбической системы. Морфологически гиппокамп представлен стереотипно повторяющимися модулями, связанными между собой и с другими структурами. Модульное строение обусловливает способность гиппокампа генерировать высокоамплитудную ритмическую активность. Связь модулей создает условие циркулирования активности в гиппокампе при обучении. При этом возрастает амплитуда синаптических потенциалов, увеличиваются нейросекреция клеток гиппокампа, число шипиков на дендритах его нейронов, что свидетельствует о переходе потенциальных синапсов в активные. Многочисленные связи гиппокампа со структурами как лимбической системы, так и других отделов мозга определяют его многофункциональность.
Нейроны гиппокампа отличаются выраженной фоновой активностью. В ответ на сенсорное раздражение реагирует до 60% нейронов гиппокампа. Особенность строения гиппокампа определяют цикл генерации возбуждения в нем, что выражается в длительной реакции (до 12 с) нейронов на однократный короткий стимул (Purves et al, 2012, Chinnery, 2006).
Основные клеточные элементы гиппокампальной формации представлены типичными пирамидными нейронами с длинными апикальными дендритами, ориентированными строго перпендикулярно к плоскости клеточного слоя, и отходящими в противоположном направлении ветвящимися базальными дендритами. В настоящее время выделяют 4 области гиппокампа (СА1- СА4) (Amaral, Witter, 1995).
Формирование лимбической коры и субикулярной области у мыши начинается на 11-й день эмбрионального развития и идет по общему принципу формирования корковых структур в направлении «изнутри наружу» (первыми закладываются глубокие слои). Ретроспинальная и энторинальная кора, парасубикулюм и субикулюм заканчивают период формирования (в них прекращается миграция фибробластов) к 15 эмбриональному дню. Пирамиды полей СА1 и СА2 продолжают возникать до момента рождения, причем поле СА2, опережает по быстроте формирования СА1. Наиболее поздним развитием обладает зубчатая фасция, развивающаяся в отличие от других областей «снаружи внутрь» и частично формирующаяся за счет миграции нейробластов из пролиферативной области гиппокампа и частично за счет пролиферации глубоких нейробластов в самом гранулярном слое. Пренатально сформированный слой гранул составляет не более 10-15%, от рождения до трех месяцев число гранулярных клеток возрастает в 6 раз. Миграция гранул через гиппокамп начинается в то время, когда ещё идет формирование поля САЗ. Микроскопические исследования на грызунах подтвердили данные о позднем созревании гиппокампальной формации. У новорожденных крыс тела пирамид в гиппокампе овальны, грушевидны, веретенообразны, их характерная форма появляется лишь позднее. В ряде случаев отсутствуют базальные и апикальные дендриты, ветвлений дендритов почти нет. На первой недели жизни появляются ветвления 3-го порядка, на 2-й - 4-го и 5-го порядка, в то же время появляются шипики.
Схожая динамика развития наблюдается у крыс. В процессе эмбриогенеза образование пирамидных клеток происходит на 16-19 день внутриутробного развития в вентрикулярной зоне коры, из которой происходит миграция клеток в радиальном направлении в область гиппокампа (Bayer et al., 1974, Bayer, 1980, Altman, Bayer, 1990а,б,в). В поле CA1 гиппокампа образование пирамидного слоя происходит на 20 день эмбриогенеза, а в поле САЗ - на 22 день, однако небольшое количество пирамидных клеток мигрируют до процесса рождения. Развитие гранулярных клеток зубчатой фасции происходит позднее, примерно 85% этих клеток образуются после рождения (Bayer, 1980). Особенностью области зубчатой фасции является сохранение у гранулярных клеток способности к нейрогенезу даже в постнатальный период. В гиппокампе образование GABA-ергических клеток происходит раньше пирамидных клеток. Интернейроны, возникающие в вентрикулярной зоне сформированного мозга, мигрируют трансгенциально по отношению к развивающейся коре, их «прибытие» связано с образованием зачатка гиппокампа (Bayer, 1980, Altman, Bayer, 1990). Функциональные GABA-ергические синапсы формируются раньше глутаматергических, как в интернейронах, так и в пирамидных нейронах гиппокампа (Khazipov et al., 1997, Hennou et al., 2002). Показано, что в переживающих срезах гиппокампа новорожденных крыс (Р0) 5% интернейронов не имеет функциональных синапсов, 17% - имеет только GABA-ергические синапсы, а 78% - GABA-ергические и глутаматергические синапсы. До образования функциональных химических синапсов пирамидные нейроны гиппокампа обладают выраженной GABA а-рецептор опосредованной тонической проводимостью (Owens, Kriegstein, 2002). Несмотря на то, что GABA является основным тормозным медиатором в ЦНС, показано, что GABA обладает возбуждающим действием в пренатальный и ранний постнатальный период (до 6 дня постнатального развития) (Ben-Ari et al., 1989, Ben-Ari, 2002, Khazipov et al, 2001). Кроме того, активная работа GABAa-рецепторов обеспечивает увеличение внутриклеточной концентрации ионов С1" в формирующихся нейронах. Это существенно (15мВ) снижает потенциал покоя в формирующемся гиппокампе (Berninger et al., 1995, Khazipovet et al., 2001, Ben-Ari, 2002, Hennou et al., 2002, Varela et al, 2005), неокортексе, гипоталамусе, мозжечке и спинном мозге (Ben-Ari, 2002). GABA-ергическая деполяризация часто активирует потенциал-зависимые Са2+ токи, которые влияют на развитие нейронов (Marty, 2000, Dzhala et al, 2001, Eilers et al, 2001, Khazipov et al, 2001). Показано наличие гигантских деполяризующих потенциалов (ГДП) длительностью 0,5-2 секунды и частотой 0,01-0,3 Гц, являющихся общей эволюционной особенностью клеток незрелого гиппокампа млекопитающих (Ben-Ari, 1989, Chiu et al, 2002, Семьянов, 2003, Рорр et al, 2009). В период возникновения ГДП в нейронных сетях гиппокампа появляются «популяционные пачки», назваемае также «ранние сетевые осцилляции» (Palva et al., 2000). ГДП детектируется при регистрации полевых потенциалов, а также связаны с внутриклеточными пачками потенциалов действия и Са2+ осцилляциями (Canepari et al., 2000). Сетевые события, связанные с GABA-опосредованными ГДП исчезают к 12-14 дню постнатального развития крыс. Появление ГДП в нейронных сетях гиппокампа связаны с повышенным высвобождением нейротрансмиттеров (GABA, глутамат) из пирамидных и интернейронов (Ben-Ari et al, 1989, Palva et al, 2000, Khazipov et al, 2001). Ионотропная глутаматергическая передача опосредована в основном работой АМРА рецепторов и имеет решающее значение в генерации ГДП. Таким образом, в процессе постнатального развития гиппокампа можно выделить несколько этапов, влияющих на формирование клеточных сетей.
Согласно анатомическим исследованиям, около 300 тысяч пирамидных нейронов находятся в поле САЗ гиппокампа крыс, создавая локальную автономную сеть. В среднем каждый пирамидный нейрон имеет связь с 6000 другими пирамидными нейронами, значительная часть которых находится в пределах радиуса нескольких миллиметров (Caeser, Aertsen, 1991, Zador М., 1993, Cesare et al, 1997). Примерно 20% клеток имеют моносинаптические связи (Sasaki etal.,2007).
Двусторонняя связь между нейронами и клетками глии имеет важное значение для аксональной проводимости, синаптической передачи и обработки информации в нейронных сетях. Сигналы между нейронами и клетками глии включат потоки ионов, нейротрансмиттеров, молекул клеточной адгезии и специальных сигнальных молекул, высвобождаемых синаптическими и несинаптическими участками нейронов. В отличие от передачи информации по сети нейронов, клетки глии взаимодействуют друг с другом через внутриклеточные кальциевые волны и межклеточную диффузию химических передатчиков. Экзоцитоз нейротрансмиттеров и других внеклеточных сигнальных молекул клетками глии могут влиять на возбудимость нейронов и синаптическую передачу и возможно координировать активность нейрональных сетей (Stevens-Graham, 2005, Fellin et al., 2007, Fields, Vijayaraghavan, 2009, Verkhratsky et al., 2012).
Метод культивирования диссоциированных культур клеток гиппокампа
Среда культивирования содержит 21,02±1,8 ммоль/л глюкозы и 0,9±0,23 ммоль/л лактата, однако за сутки в инкубаторе происходит испарение 12-15% культуральной среды, что приводит к конденсации веществ в растворе и увеличению реальной концентрации. В первые сутки культивирования клетки поглощают большое количество глюкозы, но уже к 3 DIV в культуральной среде происходит достоверное (р 0,01) увеличение концентрации лактата (в 9,8 раза относительно исходного уровня). Достоверное увеличение концентрации лактата продолжается вплоть до 9-10 DIV. На 9 день развития культуры концентрация молочной кислоты в среде составила 28,7±2,56 ммоль/л. Начиная с 11 DIV изменения концентраций лактата в культуральной среде не достоверны. Концентрация лактата в среде остается на высоком уровне вплоть до 30 DIV.
Процесс потребления глюкозы и выделения в культуральную среду лактата связан с активной работой глюкозо-лактатного шунта между астроцитами и нейронами. Астроциты способны поглощать глюкозу, окислять ее до лактата и выбрасывать в межклеточное пространство через монокарбоксилатные транспортеры (МСТ рецепторы 1 и 4 типа). Потребление лактата активно работающим нейроном осуществляется через транспортеры того же типа, расположенные на мембране нейронов. Количество переработанной глюкозы напрямую зависит от количества выделившегося глутамата - основного нейромедиатора (Okada, et. al, 2007, Ikemoto et. al., 2003, Pellerin et. al., 1994). При выделении глутамата в синаптическую щель часть молекул нейромедиатора захватывается находящимися в непосредственной близости астроцитами. Захваченный глутамат переводится в глутамин и вновь передается нейронам. Посредством вторичных мессенджеров этот процесс активирует процессы гликолиза и выделения лактата через монокарбоксилатные транспортеры. Нейроны способны поглощать глюкозу и окислять ее самостоятельно, однако процессы передачи информации в нейронной сети энергозатратны. В отростках формируется недостаток субстрата для окисления, поэтому особое значение нейрон-астроцитарный глюкозо-лактатный шунт имеет для пресинаптических областей нейрона. Это позволяет нейрону пропускать этап гликолиза -малопродуктивную стадию окислении глюкозы и быстро получать большое количество энергии. В это же время сома нейрона может самостоятельно потреблять и окислять глюкозу без привлечения глюкозо-лактатного шунта. Таким образом, биоэлектрическая активность нейронов культуры пропорциональна количеству выделенного астроцитами лактата. Активация глюкозо-лактатного шунта объединяет нейроны и астроциты в единую метаболическую.
Для оценки функционального состояния и изучения механизмов функционирования нейронных сетей перспективным является исследование ионных токов в нервных и глиальных клетках. Являясь вторичным мессенджером, ионы кальция играют особую роль в системе внутриклеточной сигнализации, и изменения их концентрации становятся «пусковым толчком» для реализации различных биохимических сигнальных механизмов клетки, поэтому изменения внутриклеточной концентрации ионов кальция служат надежным показателем функциональной активности нейрон-глиальных сетей. Оптический флуоресцентный кальциевый имиджинг является наиболее информативным методом при измерениях пространственного распределения и изменения концентрации ионов кальция в клетках (Agronskaia et al, 2004, Stosiek, et al, 2003, Paredesetal.,2008).
Увеличение концентрации Ca2+ в цитоплазме клетки является сигнальным процессом, запускающим различные каскады биохимических реакций. Са2+-активность нервных клеток - это способность нейронов быстро изменять содержание цитоплазматического Са2+ в виде осцилляции. Спонтанная Са2+ активность в клетках формируется при активации ионотропных и метаботропных рецепторов, ионных каналов и регулируется работой белков - транспортеров (Sipila, 2006, Takahashi, 2007).
Механизмы развития кальциевых сигналов в нейронах, то есть быстрых колебаний концентрации внутриклеточного кальция в клетках, обусловлены либо выбросом кальция из внутриклеточного обменного Са2+-депо, либо поступлением ионов кальция через мембрану (Nunez et al. 1996, Nunez et al, 2007). Осцилляторная активность в культурах гиппокампа синаптически управляема, так как блокируется тетродоксин-6-циано-7-нитрогиноксалин-2,3-дионом (CNQX), антагонистом глутаматных рецепторов и токсическим ингибитором нейротрансмиттерного ответа из пресинаптического нервного окончания. На Са2+ события не влияет пикротоксин, антагонист GABA рецептора. Одновременная активность NMDA - рецепторов и потенциалзависимых кальциевых каналов позволяет кальцию проникать из внеклеточного пространства и поддерживать долговременную деполяризацию за счет входа кальция. Для исследования функциональной активности культур в онтогенезе были взяты следующие возрастные группы: 3, 5, 7, 10, 14, 21 и 30 день развития in vitro. В процессе развития диссоциированных культур структура Са2+ событий изменялась (рис. 20).
На третьи сутки после посадки культуры, Са2+ событий в клетках диссоциированной культуры гиппокампа обнаружить не удалось, первые осцилляции появлялись на 5 день развития in vitro. Средняя длительность составляла 12±1,64 секунд, а средняя частота 0,012±0,003Гц (рис. 20). Из всех проанализированных клеток на этой временной точке активными были в среднем только 1 % клеток (рис. 21). Спонтанная активность клеток не синхронизирована (рис. 22) (приложение рис.5).
Показатели функциональной кальциевой активности на разных этапах развития первичной культуры клеток гиппокампа: А - длительность Са2+ осцилляции; Б - частота Са2+ осцилляции, - статистически значимое отличие р 0,05, - статистически значимое отличие р 0,05, критерий Манна Уитни, п= 28.
К 7 дню в культуре появляются редкие (0,03±0,007 Гц) и длительные (8±0,55 сек) Са2+ осцилляции. Процент работающих клеток составляет 6,6%. Наблюдается тенденция к синхронизации. Этот срок характеризуется появлением первых зрелых химических синапсов (приложение, рис.6).
На 10 день тенденция к увеличению частоты кальциевых событий (0,03±0,004). Развитие морфоструктурной организации сети приводит к дальнейшему увеличению числа клеток, вовлеченных в функциональные кальциевые события (20%), отличающиеся высокой синхронностью Са2+ осцилляции на данном и последующих этапах развития (рис. 20) (приложение, рис.7 ).
Закономерности развития функциональной активности нейронных сетей в первичных культурах клеток гиппокампа
Нейролипины относятся к одному из активно исследуемых в последнее время семейств нейроактивных липидов. В состав данного семейства входят эндогенные амиды жирных кислот с биогенными аминами, а также эфирные производные - 2-ацилглицерины. Наиболее изученными мишенями действия нейролипинов являются ключевые белки эндогенной каннабиноидной системы. Современные представления о работе эндогенной каннабиноидной системы позволяют говорить о том, что нейроактивные липиды играют важную роль в модуляции синаптической передачи и поддержании нормального функционирования нервной системы (Bobrov et al., 2008). Регуляция активности нейронов каннабиноидами в условиях ишемии оказывает нейропротекторное действие, что было показано рядом исследований на различных моделях как in vitro, так и in vivo (Nagayama et al., 1999; Parmentier-Batteur et al, 2002; Schomacher et al. 2008; Schabitz et al., 2002; Franklin et al., 2003; Muthian et al, 2004; Degn et al, 2007; Grabiec et al., 2012 и др., Pazos et al, 2013; Chiarlone et al., 2014; Dhopeshwarkar & Mackie, 2014).
Исследовано влияние N-арахидоноилдофамина (2,5, 6, и 10 мкМ) на спонтанную биоэлектрическую активность нейронной сети. Выбор концентраций N-ADA основан на данных исследования свойств N-арахидоноилдофамина на культурах клеток-зерен мозжечка (Генрихе и др., 2010). При оценке моделирующего действия N-ADA на спонтанную биоэлектрическую активность на 14 день развития диссоциированных культур гиппокампа in vitro нами обнаружено достоверное (ANOVA, р 0,05) уменьшение количества спайков пачке (количество спайков в пачке до аппликации N-ADA 10 мкМ - 2005,56±423,87, после 645,63± 134,01) при аппликации N-ADA в концентрации 10 мкМ. При этом количество пачек импульсов за 10 минут достоверно не изменялось (рис. 71 ). Таким образом, N-ADA в концентрации 10 мкМ вызывает краткосрочное снижение спонтанной биоэлектрической активности на 14 день развития диссоциированных культур гиппокампа. Не обнаружено достоверных изменений при аппликации других концентраций N-ADA (2,5 и 6 мкМ).
Эффекты, наблюдаемые от добавления N-ADA 10 мкМ, развиваются быстро, что очевидно связано с непосредственным действием каннабиноида на каннабиноидные рецепторы синаптической области. При этом действие, оказываемое N-ADA краткосрочно. Через 2 часа после аппликации не обнаружено достоверных отличий в показателях спонтанной биоэлектрической активности при применении N-ADA в концентрации 10 мкМ.
При изучении влияния N-ADA (2,5, 6 и 10 мкМ) на спонтанную биоэлектрическую активность на других сроках развития диссоциированных культур гиппокампа in vitro достоверных изменений параметров биоэлектрической активности нами не выявлено. На 7 и 21 день развития культуры in vitro ни одна из использованных концентраций N-арахидоноилдофамина не вызывала достоверных изменений уровня активности гиппокампальных культур.
Влияние N-арахидоноилдофамина на спонтанную биоэлектрическую активность диссоциированных культур гиппокампа на 14 день развития in vitro. Данные нормированы относительно исходного уровня. А количество малых сетевых пачек, Б - количество спайков в пачке. статистически значимое отличие с исходным уровнем; р 0,05, ANOVA, п=18.
Отсутствие эффекта N-арахидоноилдофаминированных культур гиппокампа может быть связано с тем, что рецепторы эндоканнабиноидной системы расположены как на постсинатических, так и на пресинаптических терминалях, а эффекты вызываемые активацией этих рецепторов могут быть противоположны (Marinelli et al., 2007). Следовательно, применение N-ADA в отсутствии блокаторов какого-либо из данных рецепторов существенного влияния на спонтанную биоэлектрическую активность не оказывает. Эффект, обнаруженный на 14 день развития первичной культуры клеток гиппокампа, может быть связан с особенностями экспрессии рецепторов на данном сроке развития нейронной сети.
Для исследования антигипоксических и нейропротективных свойств проведено изучение влияния N-ADA на выживаемость клеток и функциональные показатели нейронной сети после моделирования нормобарической гипоксии. Опытной группе во время гипоксии в культуральную среду добавляли N-ADA (10 мкМ).
Установлено, что применение N-ADA (10 мкМ) способствует сохранению количества жизнеспособных клеток в культуре в течение всего срока наблюдения (рис. 72). На первые сутки после гипоксии у культур, получавших N-ADA 10 мкМ, также отмечается снижение жизнеспособности, сопоставимое с культурами, однако в дальнейшем их жизнеспособность не снижалась и на 7 сутки после гипоксии. Показано, что процент жизнеспособных клеток в культурах, подвергавшихся 10 минутной гипоксии с аппликацией N-ADA на 7 сутки после воздействия более чем в 3,5 раза выше, чем в контрольных культурах (36,65±11,65% - «Гипоксия», 10,15±2,36 - «Гипоксия+N-ADA 10 мкМ»). Таким образом, превентивное введение N-арахидоноилдофамина повышают жизнеспособность клеток как минимум в течение 7 суток после моделирования нормобарической гипоксии.
Аппликация N-ADA в концентрации 10 мкМ предотвращает патологические изменения спонтанной биоэлектрической активности. При моделировании острой нормобарической гипоксии количество сетевых пачек в группе, получавших N-ADA (10 мкМ) достоверно снижается относительно исходного уровня, однако в период реоксигенации число пачек импульсов достоверно не отличалось от аналогичного показателя в культурах, не подвергавшихся гипоксии. Через сутки после воздействия гипоксии спонтанная биоэлектрическая активность в опытной группе не отличалась от исходного уровня. На 7 сутки постгипоксического периода количество малых сетевых пачек в группе культур, получавших N-ADA, достоверно (ANOVA, р 0,05) снижалось по сравнению с исходными значениями, однако оставалось существенно выше, чем в контрольных культурах, не получавших N-арахидоноилдофамин во время гипоксического воздействия (8,66±2,01 и 1,5±0,27 соответственно). При применении N-ADA в концентрации 10 мкМ уменьшение среднего числа спайков в пачке на 1 сутки после моделирования гипоксии составляло 42,87%. К седьмым суткам при использовании N-ADA (10 мкМ) отмечалось некоторое увеличение количества спайков в пачке (рис. 73).
Таким образом, аппликация N-ADA предотвращает вызванные гипоксией изменения структуры сетевой пачки импульсов. Это было подтверждено при анализе паттернов спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур клеток гиппокампа (рис. 74). При анализе графиков спайковой активности за 50 мс и растровых диаграмм, установлено, что количество внеклеточных потенциалов действия за 50 мс в опытной группе, которой при моделировании гипоксии проводилась аппликация N-ADA, наблюдалось лишь незначительное (менее, чем на 30%) снижение количества спайков за 50 мс относительно исходной активности культур через сутки после воздействия (в контрольных культурах это снижение обнаружено снижение в 3,8 раза относительно исходного уровня р 0,05).
Исследование нейротропного и антигипоксического действия молекул межклеточной сигнализации - нейротрофического фактора головного мозга, глиального нейротрофического фактора и эндоканнабиноида N-арахидоноилдофамина
Глиальный нейротрофический фактор головного мозга наряду с другими нейротрофинами участвует в процессах регуляции работы нейронных сетей во взрослом организме. Несмотря на высокую концентрацию данного белка в биологических жидкостях организма, биологические мишени, механизм действия и эффекты данного фактора межклеточной сигнализации остаются плохо изученными. Первоначальные исследования показали, что GDNF не оказывает влияние на GABA-ергические нейроны, поэтому его долго считали фактором выживания нейронов дофаминэргической системы черной субстанции и рассматривали как основного кандидата для терапии болезни Паркинсона (Henderson et al. 1994). Позже стало ясно, что GDNF также действует как мощный нейротрофический фактор для других типов нейронов в центральной и периферической нервной системе (Trupp et al. 1995, Airaksinen and Saarma, 2002, Sariola and Saarma, 2003, Enomoto 2005, Paratcha and Ledda, 2008, Ibanez, 2010). Механизмы действия GDNF связаны с активацией сложных многокомпонентных нейрон-глиальных взаимодействий. Уникальность рецепторной системы данного белка позволяет ему оказывать действие дистанционно на клетки, не имеющие специального рецепторного аппарата. Однако, способность рецептора к межклеточной транслокации затрудняет исследования роли данного рецептора и нейротрофина в активации тех или иных внутриклеточных механизмов. В связи с этим, в данной главе нами исследовались только эффекты, оказываемые данным нейротрофином в норме и при моделировании гипоксии как in vitro, так и in vivo.
Первым этапом стало исследование влияния GDNF (0,1, 1 и 10 нг/мл) на спонтанную биоэлектрическую активность проводилось на 14 день культивирования диссоциированных культур клеток гиппокампа. Исследовались основные показатели спонтанной биоэлектрической активности. Не обнаружено достоверных различий между показателями спонтанной биоэлектрической активности в течение двух суток после добавления GDNF различных концентраций и контрольными значениями (исходный уровень активности, активность культур с добавлением фосфатного буферного раствора). Все изменения носили статистически не значимый характер.
В связи с тем, что GDNF не влияет на показатели спонтанной биоэлектрической активности и, следовательно, не обладает выраженным нейротропным действием, для выбора оптимальной концентрации нейротрофина проведена оценка жизнеспособности клеток первичной культуры клеток гиппокампа через 7 суток после моделирования гипоксии для всех выбранных концентраций. Обнаружено, что применение всех концентраций GDNF (0,1, 1 и 10 нг/мл) вызывает соизмеримые эффекты, количество мертвых клеток составило 13,3±2,31%, 13,6±2,18% и 18,7±4,46% соответственно. В связи с этим, для дальнейших исследований выбрана концентрация сопоставимая с концентрацией BDNF (глава 3.3.1)-1 нг/мл.
Для выявления антигипоксических и нейротропных эффектов глиального нейротрофического фактора изучались: жизнеспособность клеток в культуре, изменение показателей спонтанной биоэлектрической активности и функциональной кальциевой активности после моделирования нормобарической гипоксии на первичных культурах клеток гиппокампа.
Оценка жизнеспособности клеток в диссоциированной культуре гиппокампа проводилась на 1, 3 и 7 день постгипоксического периода. Выявлено, что превентивное введение GDNF достоверно (ANOVA, р 0,05) снижает количество мертвых клеток в культуре на всех выбранных сроках наблюдения. Количество мертвых (пропидий иодид положительных) клеток в экспериментальной группе, с превентивным добавлением GDNF (1 нг/мл) оказалось достоверно (ANOVA, р 0,05) меньше (в 2,5 раза) по сравнению с контрольной группой, и составило 13,9% от общего числа клеток. Количество мертвых клеток в интактных культурах в течение всего периода наблюдения достоверно не изменялось (рис. 64).
Таким образом, применение GDNF в концентрациях 1 нг/мл и 0,1 нг/мл снижает негативные эффекты острой нормобарической гипоксии. Количество нежизнеспособных клеток достоверно ниже, чем в контрольной группе, не обнаружено достоверных различий с показателями интактной группы. GDNF обладает выраженным антигипоксическим эффектом, выражающимся в увеличении жизнеспособности при моделировании нормобарической гипоксии in
Следующим этапом исследований стало изучение влияние GDNF (1 нг/мл) на показатели функциональной активности нейронных сетей первичной диссоциированной культуры гиппокампа после моделирования нормобарической гипоксию Анализ спонтанной биоэлектрической активности первичных культур клеток гиппокампа показал, что превентивное введение GDNF (1 нг/мл) способствует сохранению спонтанной активности (рис. 65). Установлено, что сетевая пачечная активность в опытной группе меняется в течении всего срока наблюдения. На третьи сутки после моделирования нормобарической гипоксии количество сетевых пачек достоверно (ANOVA, р 0,05) снижается относительно исходного уровня и уровня группы «Нормоксия», при этом количество спайков в пачке возрастает.
Влияние глиального нейротрофического фактора GDNF на изменение показателей спонтанной биоэлектрической активности первичной культуры клеток гиппокампа после моделирования нормобарической гипоксии. Данные нормированы относительно исходного уровня. А - количество малых сетевых пачек; Б - количество спайков в пачке. - статистически значимое отличие с исходным уровнем, # - статистически значимое отличие с группой "Гипоксия", р 0,05, ANOVA, п=15.
Таким образом, наблюдается изменение паттерна активности культур без тенденции к деструкции сетевой активности (рис. 66, 67). Данное явление может быть связано с гомеостатической пластичностью нейронной сети и особенностями действия GDNF. На 7 день после моделирования гипоксии в опытной группе структура сетевой пачки стабильна. Количество спайков за 50мс и растровые диаграммы спонтанной биоэлектрической активности диссоциированных культур остаются практически не измененными относительно исходного уровня активности. В большей части культур (68%) наблюдаются лишь гомеостатические изменения сетевой активности.
