Содержание к диссертации
Введение
1 Явление пространственно-временного распределения рН и мембранного потенциала вдоль внешней поверхности плазматической мембраны.
1.1 Acetabularia acetabulum (L.) Silva 9
1.2 Пыльцевая трубка Lilium longiflorum 12
1.3 Корневые волоски и корни. Trifolium repens, Zea mays, Hordeum vulgarше L., Lepidium sativum L., Nicotiana tabacum var. Havana 13
1.4 Цитоморфогенез 16
1.5 Явление образования чередующихся зон рН вдоль поверхности плазмалеммы клеток Char a corallina. 17
1.5.2 Гетерогенное распределение рН в примембранной области клетки водоросли Char a corallina. 19
1.5.3 Мембранный потенциал и ионный транспорт через мембрану клетки водоросли Chara corallina. 22
1.5.4 Протонная АТФ-аза цитоплазматической мембраны клетки водоросли Chara corallina. 24
1.5.5 Кинетический анализ функционирования Н+-АТФазы. 28
1.6 Модели, предложенные для описания чередования зон рН и мембранного потенциала вдоль клетки Chara. 32
1.7 Заключение обзора литературы и постановка задачи 44
2 Моделирование процессов трансмембранного ионного переноса и распределения потенциала вдоль мембраны на примере клетки водоросли Chara corallina.
2.1 Кинетическая модель работы транспортной системы Н+-АТФ-азы и каналов 47
2.2 Вывод уравнения изменения мембранного потенциала 51
3 Поведение во времени рН и потенциала вблизи цитоплазматической мембраны клетки Аналитическое исследование системы без диффузионных членов. Идентификация параметров системы. 56
3.1 Экспериментальные данные и результаты моделирования 59
4 Исследование пространственно-временной динамики в примембранной области клетки водоросли Chara corallina.
4.1 Исследование распределенной системы 71
4.2 Результаты моделирования и экспериментальные факты 71
5 Исследование пространственно-временной динамики рН и мембранного потенциала с учетом изменения рН цитоплазмы.
5.1 Модель из трех уравнений 83
5.2 Исследование модели из трех уравнений. Сравнение с экспериментальными данными. 88
Обсуждение 94
- Пыльцевая трубка Lilium longiflorum
- Модели, предложенные для описания чередования зон рН и мембранного потенциала вдоль клетки Chara.
- Вывод уравнения изменения мембранного потенциала
- Результаты моделирования и экспериментальные факты
Введение к работе
Актуальность проблемы. Для многих живых организмов экспериментально показано, что вдоль внешней поверхности плазматической мембраны могут возникать участки, различающиеся по значениям рН и трансмембранного потенциала
По предположению многих исследователей существование неоднородных по величине потенциала участков в примембранной области может играть важную роль в физиологии клетки. Так, для многих растений показано, что неравномерное распределение потенциала вдоль поверхности корешков [Weisenseel et al., 1979], корневых волосков [Miller et al., 1986] и пыльцевых трубок [Feijo et al., 1999] предшествует дальнейшей дифференциации тканей и играет важную роль в процессах роста. Также было обнаружено, что неравномерное пространственное распределение потоков у зигот водорослей (Pelvetia, Fucus) определяет дальнейшую структуру клетки во время ее роста [Jaffe, 1977]. В семействе водорослей Characea в результате освещения вдоль мембраны возникают устойчивые зоны с различными величинами рН и электрического потенциала, между которыми циркулируют токи, что возможно способствует ассимиляции органических веществ в клетке. Однако до конца не ясна причинно-следственная связь между явлением образования зон рН и потенциала и физиологическими процессами в органе или клетке.
Первоначально такого рода явления связывали со структурной неоднородностью мембран. В последнее время все большее число исследователей склоняется к тому, что они обусловлены, по-видимому, спецификой работы транспортных систем клетки: АТФ-аз, каналов, антипортеров и т.д. и неоднородным распределением потоков. Иными словами, такие зоны являются примером диссипативных структур в живых системах.
Несмотря на обилие экспериментальных работ в этой области, до сих пор не выявлен общий механизм, связывающий неравномерное распределение потоков с внутренними процессами в клетке, который приводит к образованию зон рН или неоднородному распределению потенциала в примембранной области клетки.
Клетки водорослей Chara corallina и Nitellopsys abtusa являются наиболее удобным объектом для исследования неравномерного распределения потоков. Они обладают большими размерами (диаметром 0.6 -1.0 мм и длиной 40-80 мм), и имеют более простое строение по сравнению с клетками высших растений или животных. Физиология этих организмов достаточно хорошо исследована.
Был предложен ряд математических моделей [Toko et al, 1988; Leonetti, Pelce, 1994; Bulychev A. A., 2001], в которых рассматриваются возможные механизмы зонообразования. В этих моделях были сделаны попытки либо учесть изменение трансмембранного потенциала, либо изменение концентрации ионов снаружи и внутри клетки.
В настоящей работе построена и исследована модель, в которой одновременно учтены процессы изменения мембранного потенциала и изменение концентрации ионов. Предложен механизм неравномерного распределения потоков в примембранной области клетки, учитывающий взаимосвязь процессов, происходящих на мембране хлоропластов, в цитоплазме и плазматической мембране клетки. Цель и задачи работы
Цель работы: методами математического моделирования исследовать динамику возникновения зон рН вдоль клеточной мембраны водоросли Chara и предложить механизм этого явления. В работе предполагается выполнить следующие задачи:
1. Построить математическую модель, описывающую процессы, связанные с потенциалозависимым ионным транспортом через плазматическую мембрану и перемещением ионов вдоль внешней поверхности плазматической мембраны.
2. Провести исследование модели, включающее:
а) исследование временной и пространственно-временной динамики рН и потенциала в примембранной области клетки водоросли.
б) идентификацию параметров по экспериментальным данным
в) описание наблюдаемых в эксперименте нелинейных процессов: колебания мембранного потенциала и рН, возникновение зон рН и потенциала.
3. Предложить возможный механизм образования зон рН и потенциала, учитывающий связь этих процессов с процессами фотосинтеза.
Научная новизна Впервые построена модель, одновременно учитывающая изменение трансмембранного потенциала и перенос ионов через мембрану. Подробно описана работа АТФ-азы плазматической мембраны, осуществляющей перенос протонов. Оценены диапазоны изменения параметров модели, соответствующие экспериментальным данным. Впервые предложен механизм возникновения зон рН и трансмембранного потенциала, основанный на взаимосвязи процессов, происходящих при освещении в разных компартментах клетки (хлоропласта, цитоплазма, плазматическая мембрана). Практическое значение Разработанная модель пространственно-временного распределения рН и потенциала вдоль клетки водоросли применима к широкому классу объектов, где встречаются подобные явления. Модель включает в себя подробное описание работы мембранной АТФ-азы, в модели учитываются изменение концентрации протонов снаружи и внутри клетки, потенциала - это позволяет глубже понять бифизические механизмы, лежащие в основе данного класса явлений. Апробация работы Материалы диссертации докладывались и обсуждались на: 2nd ESMTB School, Siguenza, Spain, 2001; 5th ESMTB conference, Milan, Italy, 2002; 11-той Международной конференции «Математика. Компьютер. Образование.», Дубна, 2004, Пущино, 2005; III - ем съезде биофизиков России, Воронеж, 2004; семинарах кафедры биофизики
Публикации По материалам диссертации опубликовано 12 работ, из них две в рецензируемом российском журнале, две в ежегодном сб. научных трудов конференции «Математика. Компьтер. Образование, 8 в сборниках тезисов российских и международных конференций. Структура и объем диссертации Диссертация состоит из введения, пяти глав, содержащих описание методов и результатов работы, обсуждения, выводов, списка литературы.
Пыльцевая трубка Lilium longiflorum
В отличие от выше рассмотренного организма в растущих пыльцевых трубках Lilium longiflorum исследовали [Feijo J. et al., 1999] внутриклеточное распределение рН. При измерении ионных потоков оказалось, что в проксимальной и апикальной областях трубки поток Н+ направлен внутрь клетки (рис.4), в то время как в остальных областях он направлен во внешнюю среду. Измеренные потоки совпадают с внутриклеточным распределением рН. У трубок длины больше 800 мкм наблюдались незатухающие колебания протонного тока в апикальной области (в зоне втока) в течение часа. Чтобы выяснить, связано ли такое внутриклеточное распределение рН с ростом трубки, была рассмотрена зависимость скорости роста от колебаний рН в щелочной зоне внутри клетки (рис.5). Видно, что с повышением рН, скорость роста падает и наоборот. Таким образом можно предположить, что трубка растет за счет «кислого» конца [Feijo J. etal., 1999]. Если за счет кислых зон происходит рост, то внутриклеточные щелочные зоны, по-видимому связаны с активацией актомиозинового комплекса. Было установлено [Yonezawa N. et al., 1985; Moon A., 1995], что кофилин/актин деполимизирующий фактор (ADF), участвующий в перестройке комплекса, активируется при слабощелочных рН. Также было показано [Kim S. et al, 1993], что этот белок присутствует в пыльцевых трубках многих растений, в том числе и в Lilium, и возможно, он активируется именно в щелочных зонах. Был предложен возможный механизм образования неравномерного распределения рН. Предполагается, [Feijo J. et al., 1995; Pierson E. et al., 1996; Malho R. et al., 1995] что закачка протонов в апексе производится с помощью Са2+ - активируемых протонных каналов. Поток протонов наружу осуществляется за счет работы АТФазы [Sze Н., 1985; Al-Awqati Q., 1986; Briskin D., 1992], а в апикальной области фермент ингибируется высокими концентрациями внеклеточного Са2+[Lino В. et al., 1998; Kinoshita Т. et al., 1995]. Таким образом неравномерное распределение потоков протонов может быть связано с физиологией клетки. 1.3. Корневые волоски и корни. Trifolium repens, Zea mays, Hordeum vulgare L., Lepidium sativum L., Nicotiana tabacum var. Havana Известно, что вдоль растущих и развивающихся органов растений существует распределение ионных токов (Jaffe L., 1977; Weisenseel М., 1981). Предполагается, что такое генерирование и распределение ионных потоков играет важную роль в дифференцировке тканей и процессах роста [Mentze J., 1977]. Исследовались корни и корневые волоски Trifolium repens, Zea mays, Hordeum vulgare L [Weisenseel M., 1979; Miller A., 1989; Miller A., 1986]. Было показано, что области входящих и выходящих токов могут не соответствовать морфологически выраженным зонам. Так, в 3-х и7-ми дневных корешках и корневых волосках Hordeum vulgare L , Trifolium repens, Zea mays выделили три основные области распределения ионных потоков: — зона интенсивного втока (4-12 мА/м2), соответствующая зоне корневого чехлика и зоне растяжения — зона противоположно направленного тока (4-6 мА/м2), соответствующая зоне созревания . — зона втока: зона прорастания корневых волосков и небольшая часть зоны созревания (1.5 мА/м2) Для того, чтобы выяснить какие ионы вносят наибольший вклад в эти потоки, меняли ионный состав среды [Miller А., 1989].
Наибольшее влияние на распределение потоков оказало изменение рН раствора. Так, при повышении рН раствора до 7.0 у Hordeum vulgare L величина входящего тока в зоне корневых волосков уменьшалась в два раза, а у Zea mays при понижении рН от 7.0 до 3.0 не только изменялась величина потока, но и происходила инверсия потоков в зонах апекса и созревания (рис. 6) Таким образом исследователи считают, что главной компонентой ионных токов является поток протонов, при этом выходящий ток обусловлен работой помпы [Anderson W., 1977; Raven J., 1976; Weisenseel M., 1979]. Также были исследованы процессы ранения. На корешках Nicotiana tabacum var. Havana было показано [Miller А., 1988], что если осторожно повредить эпидермис в зоне созревания, ток меняет свое направление в месте повреждения и увеличивается (80-90 мА/м2), а во всех остальных зонах его величина падает (2-5 мА/м2). Профиль ионного тока при разных значениях рН среды на 4-х дневных проросших семенах Zea mays Предполагается, что образование таких областей разнонаправленных потоков играет роль не только в физиологии, но и в экологии растений - в процессе заражения зооспорами патогенных грибов растений. Остается неоспоримым тот факт, что хемотаксис-один из основных механизмов аккумуляции зооспор гриба вокруг корня [Cameron J., 1978; Deacon J., 1993; Zentmyer G., 1961; Meyer A., 1997]. Однако до сих пор не выяснено, выделяемые растениями хемоаттрактанты вызывают направленное движение, или, напротив, способствуют инцистированию зооспор. Более того, с помощью хемотаксиса невозможно объяснить пространственные распределение в аккумуляции зооспор, так как зоны выделения аттрактантов распределены равномерно вдоль всей поверхности корня [GowN. et al., 1999; Hickman С, 1966; Zentmyer G., 1961]. Было показано, что в этом процессе играет большую роль не только химически направленное движение зооспор, но и явление электротаксиса [Morris В., 1992; West P., et al., 2002]. Зооспоры грибов имеют поверхностный заряд, либо «+», либо «-» и аккумулируются в зонах корня, противоположно им заряженных. Если нанести повреждение в области корня, где аккумулируются зооспоры «одного знака», то в месте ранения будут накапливаться зооспоры «другого знака» [West P. et al., 2002]. То есть, в месте повреждения меняется направление тока, а значит и заряд [West P. et al., 2002]. Таким образом, распределение ионных токов вдоль поверхности корня играет важную роль не только в дифференцировке тканей, но, по-видимому, в раневой реакции и процессах заражения патогенными грибами. Механизмы такого распределения пока неизвестны. 1.4 Цитоморфогенез Распределение потенциала и рН вдоль мембраны клетки наблюдается также при прорастании оплодотворенной яйцеклетки некоторых водорослей - зиготы. Были рассмотрены зиготы водорослей Fucus и Pelvetia [Quatrano R., 1978; Gibbon В., 1991]. Полярность зиготы устанавливается сразу после оплодотворения. Было показано, что в областях, где происходит распределение ионных потоков, и начинается формирование полюсов развития.
Так, в области, где наблюдается наибольший ток внутрь, будет развиваться ризоид, орган прикрепляющий водоросль к поверхности. Профиль рН вдоль мембраны 3-х дневных эмбрионов Pelvetia измерялся с помощью рН-селективных электродов (рис.7). Профиль рН коррелировал с ионными потоками. Видно, что вдоль основной части ризоида развиваются главным образом щелочные зоны (зоны втока), а в остальной части кислые (зоны оттока). Механизм такого распределения потоков неизвестен. Было показано, что ток протонов внутрь не сопряжен с транспортом анионов (POf, СО , NO;), и их отток не обусловлен работой помпы, так как при ее ингибировании профиль рН не менялся. Предполагается, что возникновение «кислых» зон связано с переносом в этих областях органических кислот из внутреннего во внеклеточное пространство. Авторы считают, что образование зон рН связано с изменением цитоплазматического рН, которое является одним из важнейших регуляторов процессов, происходящих в клетке [Felle Н., 1988; Regula С. et al, 1981., Winkler М. et al., 1980]. В заключение к краткому обзору о распределении рН и потенциала вдоль мембраны клетки или органа растений можно добавить, что исследование механизмов появления такого типа структур и их роли в общей физиологии клетки или органа на описанных выше объектах представляют собой трудности ввиду сложной организации самих объектов, а также малой их изученности. Наиболее исследованным с этой точки зрения являются гигантские клетки водоросли Cham corallina. 1.5 Явление образования чередующихся зон рН вдоль поверхности нлазмалсммы клеток Chara corallina. Гигантские клетки харовых водорослей уже на протяжении многих лет являются удобным объектом биофизических исследований. Большие размеры этих клеток позволяют проводить измерение мембранного потенциала, примембранного рН, трансмембранных ионных токов [Walker N., 1977; Lucas W., 1977]. В ходе таких измерений было установлено, что при освещении вдоль поверхности клетки харовых водорослей образуются зоны шириной 1-3 мм, отличающиеся по рН (10 и 8) и по электрическому потенциалу [Spear D., 1969; Smith F., 1976; Lucas W., 1982, 1983; Fisahn J., 1995, 1992].
Модели, предложенные для описания чередования зон рН и мембранного потенциала вдоль клетки Chara.
Для объяснения чередования зон рН и мембранного потенциала вдоль клетки Chara был предложен ряд моделей, в которых зоны рассматриваются как диссипативные структуры, появляющиеся вдали от равновесия. В связи с этим далее установление чередующихся зон рН и других, связанных с этим показателем параметров, будем называть термином «структурообразование». 1.6.1 Модель Toko К. et al. Модель Toko К. et al. [1988] основывалась на схеме, в которой электрические свойства плазмалеммы в связи с биофизическими процессами внутри клетки представлены следующими элементами: емкостью С, сопротивлением R, индуктивностью L и электродвижущей силой Е (Рис. 12). Никаких электрофизиологических компонентов элементам С, L, R и Е в точности не сопоставляется. Е можно интерпретировать как электродвижущую часть Н+-АТФазы. Сопротивление цитоплазмы принимается равным нулю. Уравнения для схемы, представленной на рис. 13 выглядят следующим образом: dV d2V C—-D—4- = I dt dz1 dl L— = -V-RI + E dt (1.9) дЕ дгЕ —- - d—г = -k,V + k2E dt dz1 x 2 Здесь D -коэффициент диффузии, t -время, d, к\ и кг. -параметры. Второе уравнение системы (1.1) подразумевает, что Н+-АТФазу активирует преимущественно трансмембранная разница концентраций Н+, что отражает присутствие положительной обратной связи в активации Н+-АТФазы и подтверждается в экспериментах [Toko К., 1988]. Также предполагается возможной дополнительная активация фотосинтеза за счет притока СОг в зонах закислення, что приводит к повышению концентрации АТФ и активации Н+-АТФазы. При численном решении системы (1.9) было получено, что устойчивые колебания (автоколебания) по потенциалу предшествуют возникновению устойчивых структур. Также было показано, что внутри каждой области могут существовать устойчивые колебания. Все полученные численные результаты согласуются с экспериментальными данными. Здесь можно отметить, что в модели вовсе не учитывается особенности кинетики работы АТФазы, кинетики остальных потоков, не берется во внимание, что возникновение структур зависит от интенсивности света. Это делает модель не совсем полной, хотя она качественно описывает некоторые экспериментальные данные. 1.6.2 Модель Toko К., Chosa Н., Yamafuji К. Модель Toko К. et al., 1985 хорошо описывает типичные свойства клетки Chara: появление структур при превышении некоторого порога интенсивности света и дальнейшее увеличение их числа с повышением интенсивности.
Для объяснения повышения рН в зонах защелачивания предполагалась циркуляция протонов Н+ благодаря активному оттоку через Hf—АТФазу и пассивному притоку. При этом существование активного транспорта ионов ОН" - не предполагалось. Если представить концентрацию Н+ в виде n(r, z, t), где г, z -координаты в цилиндрической системе, ориентированной так, что ось z совпадает с осью цилиндрической клетки Chara, диффузионные уравнения для внеклеточной среды и цитоплазмы будут выглядеть так: = D. дх дгг во внеклеточной среде (1.1 Оа) в цитоплазме (1.1 Об ) дг dz1 дг Уравнение для активного потока протонов Н+ Ja: Ja= r— (1.11) 1 + ехр[(Л-Ал) где а- численный коэффициент, описывающий максимальную плотность активного потока Н+, когда все молекулы Н+-АТФазы активированы. Разница концентраций протонов между внеклеточной средой и цитоплазмой: -п = пг- ПІ (1. 12) Внутренняя переменная h соответствует некоторому ингибирующему фактору: повышение h ведет к уменьшению Ja. Предполагается, что h является функцией только интенсивности света и не зависит от координаты. Возможно, таким ингибирующим фактором являются молекулы АДФ. Описываемая система далека от равновесия благодаря постоянному притоку световой энергии, и средний активный поток линейно зависит от интенсивности света: JaT=aI (1.13) Для пассивного потока Jp предполагается следующее линейное соотношение: Jp = -p-n (1.13а) где р -проницаемость мембраны.- Граничные условия модели задаются исходя из следующих предположений: 1. Непрерывность потока через мембрану: дп„ Зі, _A i7 = "A 7 = J + J" ПРИГ = І? 0-14) 2. Торцы клеток непроницаемы для Н+: dn/dz = 0npuz = LiuL2,0 r R (1.15) длина клетки Z, = Lj-L2, R -радиус клетки. 3. Непроницимаемость тонопласта для Н+: dn/dr = 0 при г =RV, при LJv z L2v, dn/dz = 0npnz =Z/v uL2V,0 r Rv (1.16) Rv -радиус тонопласта Lv = L;v- L2V 4. Непроницаемость резервуара для Н+: dn/dr = 0 при г = RK , при 0 z Lr, dn/dz = Oupnz = 0 uLr,0 r Rr (1.17) Rr- радиус резервуара, Lr - длина резервуара. Ниже перечислены основные свойства модели То ко: 1. Кинетические уравнения для внеклеточной среды и цитоплазмы являются линейными дифференциальными уравнениями; 2. Граничные условия, связанные с непрерывностью потока, описываются нелинейными уравнениями и содержат время (1.15); 3. Средний активный поток jj ограничен интенсивностью света / в уравнении (1.13); 4. Зона утечки Н+ ограничена объемом цитоплазмы от плазмалеммы до тонопласта (Rv = г = R) объемом внеклеточной среды (R = r= R г). При численном решении данной модели были воспроизведены состояния однородного потока и чередования кислых и щелочных зон вдоль мембраны. Когда интенсивность света / превышала некоторое критическое значение 1С , первое состояние переходило во второе: L DYZ-аХЖ ЄЄ 1С с " ( а — а -Луа , кк ЦРеХее р+- -—-—?-?- 1/2 (1.18) где к -число структур вдоль клетки, Хс, Yc, Zc и Wc—линейные комбинации произведений функций Бесселя, аргументами которых служат радиусы клетки R, вакуоли Rv, цилиндрического фрагмента среды, содержащий клетку (резервуара) Rr; Д и De -коэффициенты диффузии протонов, соответственно, внутри клетки и в среде.
Уравнение для описания структур вводится следующим образом. Пусть дпе и Ъп,— случайные отклонения от однородных значений Ne и Nj. Тогда 5Ап вводится как разность 6Дл = 8ие-5/і, (1.19) Отклонение h от однородного состояния h задается таким же образом через ЬИ. Кинетическое уравнение для 8Ап выглядит так: ка е dz1 SAn = Ja {SAn, 5 К) + J (SAn) , (1-20) где Т=— LJLSJ. (1.21) а для 6 Ah -±f Ja(SAn,Sh)dz = al (1.22) L Эти уравнения выполняются только на мембране, информация о внеклеточной и внутриклеточной среде заключена в Т (1.21). Влияние условий культивирования и цитоплазмы отражено в пороговом значении интенсивности света 1С (1.18). Решение для ЪАп выглядит следующим образом: » J , , Ля . , ,Лкл . . ,.Ъкп . ,„ „„ч 5Ап = А0 +Alexp(i—z) +A2exp(i z) +Агехр(і z)+... (1-23) JL/ X/ J-J Значение рН на поверхности получается при сложении амплитуд первой, второй, третьей и т. д. гармоник. Поверхностная концентрация протонов: nes =Ne + Hj cosfl—z) (1.24) где d = DeYeZJDJCeWe (1.25) Результаты анализа уравнения (1.25) хорошо согласуются с результатами компьютерного моделирования. Поток Н+ в цитоплазме усиливает защелачивание, тогда как поток Н+ во внеклеточной среде - нет. Далее, больший размер вакуоли и меньший размер резервуара приводит к более четкой картине чередования зон. Иными словами, чем выше Д, ниже Д, и меньше объем, доступный для потока Н+, тем лучше выражено структуробразование: Д » Д„ (R —Rv)/R « 1 (1.26) Физический смысл этих неравенств заключается в следующем. Н+-АТФаза откачивает протоны из цитоплазмы. При меньших значениях Д достаточный приток протонов к Н+-АТФазе не может быть обеспечен. Если, с другой стороны, протоны в цитоплазме диффундируют достаточно быстро, то они, проникая пассивно через мембрану в зонах защелачивания, могут быстро достигать Н+-АТФазы с внутренней стороны. Как видно, для осуществления подобной схемы необходима высокая проницаемость мембраны для Н+ в зонах защелачивания, что и было показано в экспериментах [Toko К., 1988]. Чем больше объем резервуара, тем больше поток протонов вдоль клетки с внешней стороны из кислых зон в щелочные. Это приводит к дестабилизации зон—структурообразование в этом случае слабее. Зависимости времени релаксации структур от размера резервуара, и экспериментальные результаты подтверждают это предположение.
Вывод уравнения изменения мембранного потенциала
Пассивные электрические характеристики клетки связаны с электрическими свойствами ее мембраны, цитоплазмы и внешней среды. Мембрану клетки можно представить в виде эквивалентной электрической схемы (рис. 16а,), включающей емкостной компонент мембраны (Ст) и резистивный компонент (Rm). Емкостной компонент реальной мембраны клетки обусловлен исключительно ее бислоем, а резистивный — белками, встроенными в липидный бислой и, прежде всего, белками, образующими ионные каналы. Но в эквивалентную электрическую схему, представленную на рис. 16а, введена еще и батарея (Ет), формирующая разность потенциалов относительно мембраны. Ее роль может выполнять Н+-АТФ-аза Р-типа, которая создает разность потенциалов относительно мембраны клетки (активная характеристика), то есть сама мембрана является источником электрического потенциала. Рассмотрим общий ток через мембрану при учете пассивных характеристик (Ст, Rm). Когда на мембрану подается импульс электрического тока (1т), он идет по двум путям (рис. 166). Сначала ток протекает по емкости мембраны, изменяя заряд на ней. Этот компонент тока называется емкостным током (7С). По мере заряда емкости снижаются емкостная составляющая тока и основная часть оставшегося тока, та, которая шла через сопротивление. Этот второй компонент называется током сопротивления (1С). Таким образом, общий ток через мембрану будет равен т Rm т dt К1-Ь) Сопротивление мембраны Rm в нашем случае является функцией потенциала, поэтому уравнение (2.3) перепишется в виде: т l v т т т j, 2.3.2 Уравнение для изменения потенциала на мембране клетки водоросли Chara corallina. Клетка Chara представляет собой кабель (длина 4-8 см, диаметр 1мм), где ячейки мембраны, представленные в виде эквивалентной схемы (рис.16а,б), связаны между собой с сопротивлением внутренней среды (цитоплазмы) и наружной среды (рис.ібв). Токи, протекающие через небольшой участок клеточной мембраны, будут вызывать пространственно неравномерное изменение потенциала клетки. Поэтому реальный потенциал мембраны клетки представляет собой функцию не только от времени, но и от расстояния (пространственной координаты). Вследствие пространственной разности потенциалов через мембрану клетки водоросли будет протекать ток. Количественно связь между трансмембранным током и потенциалом мембраны выражается уравнением: 2R, dr2 і Іт=- Чг (2-4)
Тогда, уравнение распределения трансмембранного потенциала запишем исходя из кабельных свойств мембраны клетки с учетом ионных токов через мембрану и выражения (2.4). Р д2 Р г . т , п д Р 2& Эх л" m dt = 1лтг + 1,- + Ся- г, (2.5) р д р . д(р. — Y) равен сумме емкостного \Cm—L- 2.R, ox dt где полный ток через мембрану ( п п 2 ) равен сумме емкостного (Ст- -) и ионного (Т) токов. В нашем случае, ионный ток (7) состоит из тока протонов через АТФ-азу (1АГР) и тока утечки (//), включающего в себя потоки остальных ионов. Здесь р - трансмембранный потенциал (В), Rt - сопротивление цитоплазмы (Ом-м); Ст — емкость out „У к е"(1-и) мембраны (Ф-и2), IATP=E0k_2 — ! — Fp - ток через Н+-АТФ-азу 2q = - + Q1V (1 + -)2 (« +1) у п (/К-и ); її - ток утечки, включающий потоки других ионов (A-MJ, F - число Фарадея (Кл-моль"), р - диаметр клетки (м). Ток утечки записывается как I, = g(p-(p0), где g — проводимость пассивных каналов, (Ом"1 м"2); р0 - потенциал покоя на плазматической мембране (В). Таким образом, нами построена модель для описания возникновения зон рН и мембранного потенциала в примембранной области клетки водоросли Chara corallina. При потроєний модели были рассмотрены изменение концентрации протонов снаружи клетки и трансмембранного потенциала. Предполагалось, что изменение концентрации протонов снаружи клетки происходит за счет потенциалзависимого переноса протонов через протонную АТФ-азу. Уравнение распределения трансмембранного потенциала выводилось исходя из кабельных свойств мембраны клетки с учетом ионных токов через мембрану (протонного тока через АТФ-азу и токов остальных ионов). Глава 3. Поведение во времени рН и потенциала вблизи цитоплазматической мембраны клетки. 3.1 Аналитическое исследование системы без диффузионных членов. Идентификация параметров системы. В предыдущей главе была сформулирована модель, переменными которой являются концентрация протонов снаружи клетки и трансмембранный потенциал. Для использования модели в качестве инструмента исследования физиологии и возможных механизмов процессов в клетке водоросли Chara corallina необходимо: 1) исследовать ее качественные свойства, 2) сопоставить результаты моделирования с экспериментальными данными. Сначала была исследована локальная система (без диффузионных членов). Точечная система имеет вид: d -КиІЄ{\-п) Т ТТ—, гул , и \і{ ,\z-SW-o) dt 2gh0Ut+ (l + hmlY(n + l) Г» K В ряде экспериментов было показано, что изменение величин концентрации протонов и мембранного потенциала, измеряемых в точке, могут иметь характер как затухающих, так и не затухающих колебаний. Поэтому при исследовании локальной системы искали условия, при которых в системе возможно возникновение автоколебаний (Приложение II). В Приложении II приведено подробное аналитическое исследование системы (3.1) без диффузионных членов. Были найдены условия, при которых в системе могут реализоваться колебательные режимы (автоколебания и затухающие колебания): 14 Лье" (1-Й) _ yhQz 1) у--,— г— =— г=, ц/п = и/ + — -, 0 « 1 (2 + e2"a + Ao)2(ii + l)) g Ге (1 + /го)2(п + 1) + 2 0е + е (« + 1)(/г02-1)1[е (/го+1)2(" + 1) + 2 /2о] Г/го с3 (ho + 1)(и + 1)(2(Ао +1) - 2)1 4Л0 7 7 - r- — =1. Z - 1 » о 1, 2zho2 + 2e ho " (Ао -1) где ho,у/- стационарные значения переменных hout,\f/ В численном исследовании были найдены области значений параметров, при которых в системе возможно существование триггерных режимов (Приложение II). Однако для использования результатов моделирования в построении схемы регуляции процессов в клетке, необходимо провести оценку области изменения параметров, соответствующих реальной ситуации.
Для оценки области изменения параметров модели была проведена идентификация параметров модельного тока через мембрану по экспериментальной вольт-амперной кривой (зависимости тока через мембрану от величины транмембранного потенциала), приведенной в работе [Takeuchi Y. et al., 1985], используя пакет программ DBSolve 7.0. Вольт-амперные кривые снимались в эксперименте при значениях рН среды 7.0 и 7.5 (рис.19). Выражение для ионного тока, для которого проводилась идентификация было следующее: I = E0k_2 77 ! 77 Fp + g( P- Po) і a+h,)2K2n _k_x K3h, + l A. kx В результате процедуры идентификации были получены следующие значения параметров: К, = 2-Ю"6моль м"3, к_2 =3.. 6- 10Г с"1, п = 0.91, q = 0.001, % = -200 мВ. Остальные параметры были взяты из литературы: ,,=5-10-12 моль-м"3 (общая концентрация фермента) [Takeuchi Y. et al., 1985], /7=1 мм (диаметр клетки) [Fisahn J., 1992], g=3.12 Ом -м"2 (проводимость тока утечки для невозбужденной мембраны) [Колье О.Р. и др., 1993], [Н(.] = 1(Г7 моль-м"3 (средняя концентрация протонов в цитоплазме, рН=7) [Felle Н., 1986]. Процедура идентификации позволяет определить порядок параметров модели при определенных условиях, однако значения этих величин могут варьировать в зависимости от ионной силы раствора, температуры, рН, освещения и т.д. Так равновесный потенциал тока утечки (pQ меняется в пределах -250- -70 мВ, тогда y/Q =-4.1- --1 [Sanders D., Hansen U., 1981], а рН цитоплазмы может меняться в пределах 6.9-ь7.7 [Felle Н., 1986; Walker N., 1975; Mimura Т., 1984], то [Я,.] меняется в пределах 1.6-10-8ч-7.9-10" моль-л"1. Это позволяет оценить интервалы изменения безразмерных параметров модели: hin = 8.3 - 40, и = 0.5 -н 0.92, q = 0.001 ч- 0.005 .
Результаты моделирования и экспериментальные факты
Эксперименты по исследованию динамики зон рН и потенциала можно условно разделить на две группы: изучение возникновения и динамики зон в зависимости от интенсивности освещения и влияние различных химических агентов на зонообразование. Было показано, что кислые и щелочные зоны вдоль мембраны клетки водоросли возникают при освещении клеток светом надпороговой интенсивности. Пороговое значение освещенности сильно варьирует в зависимости от физиологического состояния клетки и может сильно различаться для разных клеток. По данным Булычева А. [Булычев А. и др., 2002] и Lucas [Lucas W., 1975] пороговое значение параметра интенсивности света варьирует в пределах от 0.5-2 Вт/м . На рис. 29а изображен профиль рН, возникающий при освещении клетки светом надпороговой интенсивности (100 Вт/м ). В численном исследовании модели было показано, что при некотором критическом значении параметра / в системе возникают диссипативные структуры, соответствующие зонам с различным значением рН в реальной системе (рис.29 б,в). Интенсивность света вводилась в модель, как было подробно рассмотрено в гл.З. Эта зависимость феноменологическая и была введена следующим образом: hin=hne , где I — — . А- - о концентрация протонов в цитоплазме, соответствующая изначальному уровню рН цитоплазмы при определенных физиологических условиях (темнота, добавление в среду различных химических агентов). В модели А? менялась в пределах 7.4-7.7. /- величина -у интенсивности света, которая в эксперименте меняется от 0 до 100 Вт/м . 10- насыщающая интенсивность света, выбранная из диапазона интенсивностей в котором амплитуда рН структур не меняется [Булычев А.А., 2002]. Значение /0 = 40Вт/м2 выбиралась таким образом, чтобы рН цитоплазмы менялась в экспериментально измеряемых пределах от 6.9 до 7.4 Как указывалось выше, в лабораторном эксперименте было показано, что при увеличении интенсивности от 10 до 100 Вт/м2 амплитуда рН зон не меняется [Булычев А., 2002]. В модельном эксперименте при повышении интенсивности от 7 = 0.7 (/= 2.8 Вт/м )до 7 = 3(7= 120 Вт/м ) амплитуда зон рН и трансмембранного потенциала также не менялась. Экспериментально показано [Bulychev А.А., 2003], что в определенном диапазоне освещенности одной и той же величине интенсивности света могут соответствовать два состояния в распределении рН: полностью гомогенное состояние и полностью сформированные структуры.
Переход к состоянию с высокой амплитудой пиков рН происходит при увеличении интенсивности света, переход к гомогенному состоянию при уменьшении интенсивности света, то есть в системе может быть реализован гистерезис. Под гистерезисом здесь надо понимать, что структуры появляются при одной интенсивности, а исчезают при интенсивности меньше той, при которой они возникают. Эксперимент ставился следующим образом. Перед началом опыта клетку адаптировали к темноте для достижения однородного распределения рН, а затем последовательно выдерживали при интенсивностях света 0.24, 0.5, 1.78 и 0.5 Вт/м2. При интенсивности света, равной 0.24 и 0.5 Вт/м наблюдалось гомогенное распределение рН. При интенсивности света, равной 1.78 Вт/м2 возникал устойчивый профиль с щелочными и кислыми зонами. Повышение интенсивности проводилось через каждые 30 минут. При у интенсивности света, равной 1.78 Вт/м амплитуда структур достигает максимума. После получения устойчивого профиля структур интенсивность света ступенчато понижали до 0.5 Вт/м через каждые 30 минут, при этом амплитуда структур не изменялась. Таким образом одной и той же интенсивности света 0.5 Вт/м соответствовали два состояния рН: гомогенное распределение в экспериментах, когда интенсивность света постепенно повышается и устойчивый профиль рН с амплитудой равной 2,5 единиц рН в экспериментах, когда интенсивность света постепенно снижается. Аналогичные результаты получены и во втором цикле изменения интенсивности, в котором наибольшая интенсивность составляла 1.2 Вт/м2. На модели был воспроизведен лабораторный эксперимент. Было найдено критическое значение интенсивности света 7 = 0.025, при котором в системе возникают структуры (зоны рН и потенциала). Остальные параметры модели были следующими g = 0.08, (, = -1.335(—70мВ), z = l, Л = 6.98(концентрация протонов в цитоплазме в темноте), К2 =8.484-10"4, Къ = 0.996. При этом в точечной системе тип решения был устойчивый фокус (фазовый портрет системы приведен на рис. 30а.). Для модельных экспериментов (численный эксперимент в распределенной системе) мы брали ряд значений интенсивности света (I = 0.006-0.0455), соответствующий значениям интенсивностей, используемых в лабораторном эксперименте. При этом рН цитоплазмы в модели менялось от 6.9 до 7.4. Поскольку в лабораторном эксперименте интенсивность изменялась через каждые 30 минут, в численном эксперименте параметр интенсивности также менялся через определенный интервал времени, в размерном виде этот интервал равен -30 мин. В численном счете было обнаружено, что при увеличении параметра интенсивности в системе возникают рН структуры при значении интенсивности света больше порогового I = 0.04 (/= 1.78 Вт/м2 ), рис.306. При дальнейшем увеличении значения интенсивности их амплитуда остается постоянной. При уменьшении параметра интенсивности через тот же интервал времени структуры исчезают при значении интенсивности, ниже порогового значения I = 0.006 (7=0.24 у Вт/м ), рис.ЗОв. Таким образом, в модельной системе наблюдается гистерезис в изменении рН в зависимости от предыстории световых условий, как это было и в эксперименте.
В следующем лабораторном эксперименте [Bulychev А. А., 2003] было выявлено различное влияние повышающихся и понижающихся интенсивностей света при объединении данных, полученных на разных клетках. Поскольку амплитуда щелочных пиков на разных клетках различаются, была проведена нормировка сдвигов рН. Для каждой клетки определяли среднее значение перепада рН между кислыми и щелочными зонами в интервале интенсивностей 10-100 Вт/м2 и принимали его за единицу. Результаты, полученные при такой нормировке, представлены на рис.28а. Видно, что при понижении интенсивности света «щелочной» (структура со значениями рН=8.5-9.5) пик (последний из нескольких пиков в исходном профиле) зачастую сохраняется при очень низких интенсивностях (до 0.1-0.01 Вт/м ), тогда как при повышении освещенности пики рН возникают при интенсивности света не менее 1 Вт/м . Для сопоставления результатов численного счета с экспериментальными данными (рис.31а) амплитуда рН структур определялась как величина перепада рН между кислыми и щелочными зонами и была выражена в относительных единицах Величина амплитуды рН структур полученная в численном счете была нормирована на максимальную амплитуду рН структур (рис.316). В следующей серии экспериментов наблюдали зависимость роста или исчезновения зон рН в зависимости от добавления в среду различных вещество Экспериментально было показано [Bulychev A. et al., 2001], что при добавлении во внешнюю среду хлорида аммония амплитуда пиков и их количество уменьшается . Ионы аммония, проникая в клетку вступают в реакцию с ионами водорода, при этом происходит защелачивание внутреннего объема клетки. После удаления из среды хлорида аммония и добавления ЮмМ ацетата натрия зоны рН восстанавливались. Предполагается, что при добавлении слабой кислоты внутренняя среда клетки слегка подкисляется и это приводит к восстановлению структур. В нашей модельной системе добавление растворов солей аммония и ацетата соответствует понижению или повышению /г. При уменьшении параметра /г (соответствует добавлению хлорида аммония) от 11 до 6, амплитуда структур уменьшается, при повышении /г от 6 до 12.52 (соответствует добавлению ацетата) увеличивается число структур и их амплитуда, рис. 32 а, б. При этом восстановление структур происходит не плавно, а скачкообразно. При добавлении в среду хлорида калия амплитуда структур уменьшается (рис.33 а, б). Известно, что ионы хлорида калия вызывают деполяризацию мембраны и увеличивают проводимость калиевых каналов, что и приводит к ингибированию структур. В модели токи ионов калия, натрия, хлора и т.д. включены в ток утечки Ii=g( p- Po) Поэтому на модели исследовалось поведение системы в зависимости от параметра g (проводимости всех остальных ионных каналов, кроме протонных). Было показано, что при увеличении этого параметра от 0.08 до 0.095, амплитуда структур уменьшается, рис. 33 в.
