Содержание к диссертации
Введение
Глава 1. Обзор литературы 8
1.1. Тепловое равновесие в системе спинов 8
1.2. Спиновая диффузия в диамагнитных ионных кристаллах 11
1.3. 'Н-ЯМР- спектры нативных белков 12
1.4. Условия возникновение и распространения спиновой диффузии в белках 15
1.5. Динамические характеристики нативных белков 18
1.6. Равновесные промежуточные состояния белков 20
1.7. Связь плотности упаковки белков с экспериментальными параметрами 24
1.8. Спиновая диффузия и интегральные структурно-динамические характеристики глобулярных белков. Спектр спиновой диффузии 27
1.9. Параметр жесткости и компактность глобулярных белков 32
1.10. Применение метода спиновой диффузии к исследованию ненативных состояний белков 33
Глава 2. Материалы и методы 36
2.1. Список используемых сокращений и обозначений 36
2.2. Объекты исследования и материалы 37
2.3. 'Н-ЯМР - спектроскопия 38
2.3.1. Спектры спиновой диффузии 38
2.3.2. Метод внерезонансного возбуждения спиновой диффузии 40
2.3. Малоугловое диффузное рассеяние рентгеновских лучей в растворе. 41
2.4. Спектроскопия кругового дихроизма 45
Глава 3. Результаты и обсуждение 48
3.1. Исследование а-лактальбумина человека методом спиновой диффузии 48
3.2. Разворачивание расплавленной глобулы карбоангидразы В гуанидингидрохлоридом 56
3.3. Параметры спиновой диффузии, определяющие индивидуальные и коллективные свойства молекул 66
3.4. Разворачивание нативной карбоангидразы В растворами мочевины. Самоассоциация компактного ненативного состояния 76
3.5. Исследование ассоциатов промежуточного состояния карбоангидразы В при концентрации мочевины 4.2М 86
3.6. Заключение 96
Выводы 97
Благодарности 98
Список литературы 99
- Спиновая диффузия в диамагнитных ионных кристаллах
- Спиновая диффузия и интегральные структурно-динамические характеристики глобулярных белков. Спектр спиновой диффузии
- Метод внерезонансного возбуждения спиновой диффузии
- Разворачивание расплавленной глобулы карбоангидразы В гуанидингидрохлоридом
Введение к работе
Актуальность темы. Несмотря на 40-летнюю историю, проблема самоорганизации белков остается одной из «горячих точек» молекулярной биологии. Важным и актуальным этапом данного направления является исследование частично денатурированных (ненативных) промежуточных состояний глобулярных белков. Характерной чертой большинства белков, находящихся в промежуточных ненативных состояниях, является их склонность к ассоциации или агрегации [1-6]. Белки в ненативном состоянии часто формируют тела включения (специфические in vivo агрегаты), существенно осложняющие выделение многих рекомбинантных белков [7, 8]. Также известно, что ренатурация белков часто сопровождается ассоциацией частично свернутых интермедиатов [1-4, 9]. При определённых условиях самоассоциация может рассматриваться как дополнительный структуро-формирующий фактор, ведущий к возникновению новых «структурных уровней» частично свернутого белка [6, 10, 11]. В течение длительного времени к агрегации белка не относились серьезно, рассматривая ее как экспериментальный артефакт. Однако, в последние годы существенно возрос интерес к исследованиям, посвященным самоассоциации и агрегации белка. Это связано с тем, что широкий диапазон заболеваний человека, известных как заболевания, связанные с нарушением конформации белка или его сворачивания, проистекают из-за неспособности специфических пептидов или белков принимать нативную конформацию, необходимую для нормального функционирования белка [12-16]. Накопленные к настоящему времени данные свидетельствуют в пользу модели, в которой формирование фибрилл белков протекает через образование относительно развернутой амилоидогенной конформации, включая многочисленные нейродегенеративные нарушения и амилоидозы. Переход белка в «прионное» состояние, как правило, сопровождается существенным
увеличением доли ^-структуры в его составе. Возникающая межмолекулярная р-структура стабилизирует ассоциат, приводя в конечном счете к образованию высокоупорядоченных фибрилл (амилоидов). В тоже время множество белков, не имеющих отношения к амилоидной дистрофии, также образуют фибриллы при определенных условиях [17-19]. Способность белков формировать амилоиды зависит от их заряда и гидрофобности [20] и, по-видимому, является общим свойством полипептидных цепей, поскольку in vitro в условиях частичной денатурации многие пептиды и белки образуют подобные структуры [21, 22]. Эти белки используют в качестве моделей для изучения процессов, приводящих к нарушению сворачивания белков, олигомеризации и образованию фибрилл. Важное место в них отводится изучению роли воды, или, в общем случае, растворителя [23, 24]. Молекулярный механизм взаимодействия белков с растворителем до сих пор не до конца понятен и является предметом многих исследований [25-28] с использованием различных физических методов [29-31]. Поэтому изучение молекулярных механизмов ассоциации белков и роли растворителя в таких процессах является актуальной задачей для понимания причин образования амилоидов и амилоидоподобных структур. Однако только ограниченное число экспериментальных методов способно фиксировать влияние растворителя (воду и компоненты, образующие растворитель) на процессы агрегации или самоассоциации белков. Среди них выделяется метод ЯМР высокого разрешения, способный отслеживать взаимодействие молекул растворителя с молекулами белка в режиме реального времени и даже установить некоторые количественные характеристики при таком взаимодействии [32, 33].
В качестве объектов исследования были выбраны глобулярные белки, способные легко переходить в состояние расплавленной глобулы: карбоангидраза В коровы (Мг=29 кДа) [34-36] и ос-лактальбумин человека (Мг=14.2 кДа) [37, 38]. Недавно нами было показано, что при определенных
условиях карбоангидраза В способна формировать амилоидоподобные структуры [39]. Также известны условия, при которых а-лактальбумин человека формирует амилоидные фибриллы [40]. Характерно, что в большинстве описанных случаев, образованию амилоидов in vitro предшествует ассоциация частично денатурированных форм белка.
Цель и задачи работы. Основной целью настоящей работы является исследование динамики межмолекулярных процессов, происходящих с частично денатурированными глобулярными белками при взаимодействии с молекулами денатурантов и воды методом ЯМР.
Соответственно цели были поставлены следующие научно-методические задачи:
-методом 'Н-ЯМР провести исследование взаимодействия денатурантов (гуанидинхлорида, мочевины) с ненативными формами а-лактальбумина человека и карбоангидразы В коровы.
-используя комплекс физических методов (1Н-ЯМР, круговой дихроизм, синхротронное малоугловое рентгеновское рассеяние) провести изучение динамики формирования ассоциатов ненативных форм белков, условий, приводящих к самоассоциации, роли растворителя в этом процессе.
-в ходе выполнения работы разработать новые методические подходы для изучения процесса самоассоциации белков и получения информации о коллективных и индивидульных свойствах, входящих в состав ассоциатов, белковых молекул и растворителя.
Научная новизна и практическая значимость. В данной работе впервые [33, 41,44-46]:
-показано различие в молекулярных механизмах взаимодействия мочевины и гуанидингидрохлорида с белковой молекулой.
-исследована степень и характер вовлечения молекул растворителя в состав ассоциатов в процессе разворачивания белка.
-показан динамический характер взаимодействия молекул белка и растворителя в белковом ассоциате и сделано предположение о причинах, препятствующих образованию протяженных белковых ассоциатов (агрегатов), подобным амилоидным фибриллам.
-в рамках ЯМР высокого разрешения предложен новый методический подход- «внерезонансное возбуждение спиновой диффузии», позволяющий исследовать молекулярную ассоциацию и дающий возможность получить информацию, как о коллективных, так и индивидульных свойствах ассоциатов и входящих в их состав белковых молекул и растворителя.
Рассмотренная в работе система карбоангидраза В коровы-растворитель может быть использована в качестве удобной модели в дальнейших исследованиях по выяснению молекулярных механизмов образования амилоидов, приводящих к прионным заболеваниям человека и животных, а как следствие, устранению причин их вызывающих. Таким образом, в перспективе, результаты работы найдут свое применение в биомедицине. Реализованный в работе новый методический подход «внерезонансного возбуждения спиновой диффузии» будет полезен исследователям, занимающихся изучением межмолекулярных процессов в растворе с использованием ЯМР.
Работа выполнена в группе «ЯМР-исследований биосистем» Института теоретической и экспериментальной биофизики РАН.
Спиновая диффузия в диамагнитных ионных кристаллах
Согласно теории в диамагнитных, ионных кристаллах (1=1/2) величина Т\ должна быть 10 сек. Однако экспериментально наблюдаемые значения 0 7 Л Т\ -10 -5-10 сек были меньше в 10 раз. Бломберген показал, что аномально низкие времена ядерной спин-решёточной релаксации (1=1/2) в диамагнитных, ионных кристаллах вызываются парамагнитными примесями, присутствующими в очень малых количествах [50]. Это кажется удивительным, поскольку лишь незначительная часть ядерных спинов может оказаться настолько близкой к электронным спинам, чтобы произошло их взаимодействие. Следовательно, существует механизм, благодаря которому ядра, находящиеся вблизи парамагнитных ионов, имеющие малое Гь сами являются мощными источниками спин-решёточной релаксации для соседних ядер, время релаксации которых также понижается и теперь уже они являются релаксационными стоками для своих соседей и т.д. Этот процесс распространяется по всему объему образца, приводя к выравниванию скоростей релаксации всех спинов. Ядерная намагниченность как бы перемещается в окрестности электронных спинов, где и происходит эффективная ядерная релаксация. Этот процесс Блоемберген описал математически и получил дифференциальное уравнение типа уравнения диффузии, поэтому процесс был назван - спиновая диффузия [47, 50]. Уравнение имеет вид: -dp/8t = D Ap, (4). где коэффицент диффузии D= W»Q . Q - расстояние между ближайшими соседями, W — вероятность их парного переворачивания. Типичные значения D и W имеют соответственно порядок 10"13 см2/сек и КГ сек"1. Величина р характеризует ядерную поляризацию в точке (в малой области, имеющей размеры порядка нескольких постоянных решётки), А - лапласиан.
Н-ЯМР-спектр водного раствора белка может содержать сотни и даже тысячи резонансных линий в области от -1 до 10 м.д. Причем положение каждого резонанса определяется как принадлежностью групп атомов к той или иной спиновой системе (аминокислотному остатку), так и локальным окружением рассматриваемых групп [51, 62]. Образование пептидной связи (первичной структуры) в полипептиде сопровождается лишь сдвигами сигналов а-протонов. Спектр развернутого белка, не содержащего элементов вторичных и третичных структур, является суммой спектров входящих в него аминокислотных остатков, за исключением области поглощения а-протонов.
Наличие уникальной пространственной структуры белка обуславливает дополнительные химические сдвиги сигналов групп аминокислотных остатков, входящих в его состав. Одинаковые аминокислотные остатки становятся магнитно-неэквивалентными вследствие различного пространственного окружения. Такие химические сдвиги принято называть вторичными [52] . Типичным примером таких сдвигов в спектрах глобулярных белков являются сдвиги в высокие поля резонансов протонов метильных и метиленовых групп алифатических аминокислотных остатков кольцевыми токами боковых цепей ароматических аминокислотных остатков [53, 54]. Вторичные химические сдвиги отражают уникальность пространственного окружения каждого аминокислотного остатка и непосредственным образом связаны со структурой белка. Так, например, вторичные химические сдвиги ядер атомов остова полипептидной цепи отражают вторичную структуру белка. Отнесение соответствующих сигналов позволяет судить о локализации элементов вторичной структуры вдоль полипептидной цепи. В простейшем случае анализ вторичных химических сдвигов а-Н протонов при наличии гомоядерного протонного отнесения позволяет установить локализацию а-спиралей, Р-слоев и нерегулярных участков [55, 56].
Более сложные подходы позволяют с хорошей точностью (± 10- 20) предсказывать двугранные углы ф и \/ на основании величин химических сдвигов HN, N, Са, На и карбонильных (С) ядер атомов [57, 58]. Точность предсказаний позволяет использовать величины ф и ц/ как дополнительные ограничения при расчете пространственных структур белков. Связь вторичных химических сдвигов групп боковых цепей со структурой менее очевидна в силу большого разнообразия их окружения. Тем не менее, в настоящее время уже существуют достаточно эффективные алгоритмы, способные на основании только химических сдвигов и первичной последовательности предсказывать как трехмерные структуры белков [59], так и вычислять внутримолекулярную подвижность [60, 61].
Протонный спектр глобулярного белка можно условно разделить на несколько частей. Область от 10 до 6 м.д. содержит резонансы протонов амидных групп полипептидной цепи. Спектр растворенного в обычной воде белка несет полный набор сигналов амидных протонов. Если белок растворён в тяжелой воде, то в спектре наблюдается лишь та их часть, которая недоступна растворителю. Как правило, такие протоны находятся во внутренних областях глобулы. В зависимости от температуры, при которой проводится исследование, и природы белка эти протоны могут оставаться незамещенными на дейтерий от десятков и более дней до часов и даже минут. Таким образом, эта область спектра может характеризовать доступность для растворителя внутренних частей белковой глобулы - степень плотности ее упаковки [62]. В частности, для рибонуклеазы А такая доступность при комнатных и низких температурах минимальна и эта область спектра может оставаться без видимых изменений в течение десятков дней [63, 64]. В то время, как в других белках, например, в апомиоглобине вблизи рН=7 и комнатной температуре амидные протоны полностью обмениваются меньше, чем за два дня [65, 66].
Область 7.5 - 6.5 мд содержит сигналы протонов араматических колец аминокислотных остатков, таких как фенилаланин, тирозин, триптофан. Кроме того, в этой области можно наблюдать сигналы С2-Н и С4-Н протонов гистидина. Резонансы этих протонов в некоторых белках можно наблюдать вплоть до 8.5 - 9.0 мд [67].
Область спектра примерно от 5.5 до сигнала воды 4.8 м.д. содержит сигналы а-протонов, участвующих в образовании р-структуры [55. 56]. Если белок обладает р-структурой, то в этой области будут появляться сигналы. Если белок содержит лишь а-спирали (апомиоглобин) или денатурирован, то эта область совершенно свободна от сигналов.
В области от 4.8 и до 3.5 мд дают вклад почти все а-протоны полипептидной цепи, как входящие, так и не входящие в состав а-спиралей и Р-структур [55, 56]. Область 3.5-1.5 мд содержит сигналы P,y,5,s - метиленовых протонов алифатических аминокислотных остатков. В области 1.4-0 м.д. и более высоких полях (нативные белки) наблюдаются сигналы метальных протонов таких аминокислотных остатков, как аланины, валины, лейцины и изолейцины. Основное количество метальных резонансов приходится на область 1-0.9 м.д., но те метилы, которые входят в состав гидрофобных областей и близко расположены около колец ароматических аминокислотных остатков, магнитными полями кольцевых токов сдвигаются в разные стороны от этого положения [53, 54]. Они особенно хорошо доступны для наблюдения в высоких полях в области от 1 до -0.5 м.д. Наличие таких сигналов говорит о существовании плотноупакованных глобулярных доменов в составе белка. Все выше упомянутые особенности структурной организации белковой молекулы делают спектр нативного белка уникальным, неповторимым и не похожим на спектр другого белка.
Спиновая диффузия и интегральные структурно-динамические характеристики глобулярных белков. Спектр спиновой диффузии
Упомянутые выше условия возникновения и распространения спиновой диффузии в глобулярных белках нашли многочисленные подтверждения и приложения в работах Кутышенко В.П. [128]. Им был предложен в рамках ЯМР высокого разрешения методический подход к исследованию белков с нарушенной нативной структурой, основанный на известных явлениях спиновой диффузии и ЯЭО, и получивший название метода спиновой диффузии. Этот метод лишен возможности следить за характеристиками каждого отдельного протона, но дает представление о макромолекуле или какой-то ее части в целом после потери или до приобретения ею нативных свойств [127-128]. Кроме того, метод позволяет наблюдать за взаимодействием макромолекул с растворителем [32, 129], денатурантами [33, 41, 42, 44-46] и различными лигандами [128]; качественно и количественно исследовать процесс ассоциации белковых молекул [130], определять наличие стабильных промежуточных состояний в процессе тепловой [131, 63] или иной денатурации [132, 64].
Среди основных предпосылок, послуживших развитию метода применительно к глобулярным белкам можно указать следующие: 1. Молекулярная масса природных глобулярных белков бкДа. Это означает, что на спектрометрах с рабочей частотой /2л; 100МГц для них всегда выполняется необходимое условие существования спиновой диффузии: (ютс)2 »1. 2. Метальные группы в белках с одной стороны обладают наибольшей подвижностью. Времена их вращательной корреляции тг 10"10 - 10"11 сек [69]. С другой стороны аминокислотные остатки, содержащие метальные группы (аланин, валин, лейцин, изолейцин), как правило, входят в состав плотно упакованного гидрофобного ядра глобулярных белков [74]. Это означает, что ближайшее протонное окружение метальных групп, имеет время корреляции (тс) характерное для молекул белка в целом ( 10 9сек). Благодаря этому протоны, в составе метальных групп, оказываются сильнее остальных связанными с решёткой и, как показал Калк [69], являются основными релаксационными стоками. Молекулы белка в этом случае могут рассматриваться как двухспиновые системы. Где в качестве одного спина, выступают метилы, другой спин - все остальные протоны, входящие в плотно упакованную третичную структуру нативного белка. Наличие пространственной сближенности между двумя типами спинов с различными скоростями релаксации является достаточным условием возникновения спиновой диффузии в белках. 3. В глобулярных белках основная масса метальных протонов дает сигнал в относительно узкой области (при 1-0.9 мд), образуя практически обособленный пул сигналов. Причем эта область почти не перекрывается с областью поглощения других групп [67] и, таким образом, имеется возможность селективного воздействия на большинство метильных сигналов. 4. При насыщении резонансов метильного пула возмущающая энергия передается по путям стока релаксации, но в обратном направлении. Распространение такого возмущения согласно формуле (12) будет зависеть как от компактности молекулы, так и от ее внутренней динамики. Оба эти параметра ответственны как за формирование множества уникальных пространственных структур белков, так и за многообразие их биологических функций.
На практике возбуждение спиновой диффузии в белках происходит при длительном (1-2сек) насыщении пула метильных протонов. В таких условиях для белков при тссо »1 ядерная намагниченность между спинами переносится не только через пространство, но и через соседние спины. Эффективный обмен энергией между спинами приводит к почти полной потере селективности ЯЭО. Как следствие, информация о расстояниях между протонами и их взаимном расположении теряется. Спектр ЯЭО переходит в спектр спиновой диффузии. В отличие от спектров ЯЭО, содержащих лишь сигналы ближайших соседей облучаемого спина (не более 5А), спектры спиновой диффузии мало отличаются от обзорных по своему виду. Такие спектры содержат сигналы лишь от достаточно жестких, крупных массивов макромолекулы, образующих устойчивые пространственные структуры, например а-спирали, Р-складки и т.п., для которых время межпротонной корреляции (тСу) удовлетворяет условию сохСц »1. При частоте протонного резонанса 600 МГц в спектре будут наблюдаться сигналы от таких сегментов молекулы белка, для которых время межпротонной корреляции хСу 10"9сек. Иначе говоря, если пространственная сближенность каких-либо участков полипептидной цепи, существует больше чем это время, то такая структура детектируется как устойчивая (жесткая) [128]. В качестве характерного примера можно привести гликопротеин cq-микроглобулин - белок иммунной системы. Известно, что молекулярная масса этого белка порядка 30 кДа, а сахарные цепи, входящие в его состав составляют -20% от общей массы белка [133]. В спектре сахарные протоны дают сигналы в области от 4,8 до 3,8 мд, а в спектре спиновой диффузии эти сигналы отсутствуют, хотя имеет место эффективная спиновая диффузия, характерная для глобулярньк белков такой молекулярной массы. Отсутствие сигналов сахарных протонов в спектре спиновой диффузии можно объяснить только тем, что большинство сахарных цепей расположено вне глобулы, а не внутри, и в силу этого, являются значительно более подвижными, с временами межпротонной корреляции Tq,, столь короткими, что прерывается цепочка спиновой диффузии [134].
Так же, как и одномерный спектр ЯЭО, спектр спиновой диффузии является дифференциальным. Отличие заключается лишь в длительности селективного облучения выбранных сигналов согласно схеме импульсной последовательности: [(Dl-D2-D3-90-fid)onres. - (Dl-D2-D3-90-fid) off.rcs] xn Здесь D1 - релаксационная задержка ЗОсек, D2- время возбуждения спиновой диффузии 1-2сек (при 50-60 дб от мощности 100 Вт), D3- задержка 0.1 сек перед 90 импульсом (10-16 мкс). Если возбуждение спиновой диффузии происходит на частоте резонансов метальных протонов, то offset on res. 0.9 м.д., offset off res. находится в высокопольной области и отстоит от резонансов метилов на- 10 м.д. [46].
Метод внерезонансного возбуждения спиновой диффузии
Диффузное рассеяние рентгеновских лучей занимает особое место среди других методов изучения структуры макромолекул в растворе. Являясь непосредственно аналогом рентгеноструктурного анализа для исследования неупорядоченных объектов и, следовательно, используя математический аппарат теории дифракции, диффузное рентгеновское рассеяние дает прямую структурную информацию о взаимном распределении рассеивающих масс -информацию, которая в принципе не может быть получена не дифракционными методами. Другая исключительно важная особенность рентгеновского рассеяния, основанная на фундаментальной связи между строением исследуемого образца и его дифракционными свойствами, состоит в возможности разномасштабного изучения структуры объекта; при увеличении угла рассеяния рентгеновская камера подобно микроскопу с переменным увеличением, способна "видеть" более мелкие детали структуры. Это позволяет проводить всесторонние исследования макромолекул в растворе, а именно, под малыми углами изучать их общее строение, а под средними и большими -особенности их внутренней структуры. Среди объектов исследования наиболее важное место занимают биополимеры. Это объясняется не только актуальностью изучения их структуры, но и тем обстоятельством, что биополимеры обладают, как правило, размерами, хорошо соответствующими возможностям рентгеновского рассеяния. Действительно, рентгеновское малоугловое рассеяние позволяет оценить внешние структурные параметры частиц, размеры которых заключены в интервале от нескольких сотен до нескольких десятков ангстрем, куда, как известно, попадают многие глобулярные белки, вирусы, липопротеиды, нуклеопротеиды и др.
В фундаментальных работах Дебая [152], Гинье [153] были заложены основы теории малоугловой дифракции, выявившие возможность количественной интерпретации внутренней части кривой рассеяния макромолекулами в растворе в терминах их структурных параметров, не зависящих в ряде случаев от каких бы то ни было модельных представлений. Гинье показал, что в области очень малых углов интенсивность рассеяния от частицы любой формы падает по экспоненте, показатель которой связан с обобщенным размером частицы - ее радиусом инерции. Величина последнего зависит от распределения рассеивающих центров в пространстве частицы и, как следствие этого, от ее размеров и формы [154]. Так появился метод, позволяющий с высокой точностью определять размеры макромолекул в растворе.
Малоугловым методом были получены такие важные характеристики биополимеров, как молекулярный вес (линейная плотность для длинных частиц), их размеры (радиус инерции), степень вытянутости, объем и ряд других параметров.
Далее было обнаружено, что с увеличением угла рассеяния спад интенсивности тесно связан с формой частицы и существенно различен для трех базовых конформаций биологических макромолекул, таких как глобула, палочка, клубок. Большеугловое диффузное рассеяние охватывает интервал углов (условно, от нескольких градусов до - 25 для СиКд -излучения), соответствующий брэгговским расстояниям от 30-40 А до 10-5 А. Эта область индикатрис рассеяния несёт информацию о характере распределения неоднородностей в частице и, таким образом, даёт ключ к изучению ее внутреннего строения. Важным применением болыпеуглового анализа является, например, изучение детальной структуры глобулярных белков. Эти факты легли в основу метода моделирования, когда на основании измеренной кривой рассеяния выдвигается модель рассеивающей частицы, которая не противоречит кривой рассеяния, а также экспериментальным данным, полученным с помощью других методов [155].
В настоящее время разработано несколько подходов, позволяющих определить структуру белков в растворе, используя метод малоуглового рентгеновского рассеяния или рассеяния нейтронов. Во-первых, это метод сферических гармоник [156], позволяющий непосредственно из кривой рассеяния рассчитать форму белка в растворе. Этот метод позволяет определить форму белков без знания его структуры в кристалле и может применяться как для однодоменных, так и для многодоменных белков. Метод хорошо развит [156-159] и показано, что, при определенных условиях, форма молекулы из кривой рассеяния рассчитывается единственным способом [160]. Однако этот метод ограничен тем, что не применим для белков со значительными внутренними впадинами и отверстиями. Другой метод расчета кривых рентгеновского рассеяния используется, когда известны координаты атомов белка из рентгеноструктурного анализа или ЯМР. При этом рассчитывают теоретические кривые рентгеновского или нейтронного рассеяния для всех возможных положений доменов в молекуле белка и выбирают те положения, которые наилучшим образом согласуются с экспериментальной кривой рассеяния [155,161,162]. Такое моделирование применимо, если предполагается, что форма доменов не меняется или меняется незначительно (по сравнению с кристаллической) а, в основном, изменяется расположение доменов друг относительно друга. Этот подход был применен при исследовании алкогольдегидрогеназы [163] и рибонуклеазы А [164]. Для этих белков оказалось, что экспериментально измеренная в растворе и рассчитанная от кристаллической структуры кривые рассеяния не отличаются друг от друга в пределах погрешности эксперимента. Такой результат подтверждает надежность используемого подхода. В тоже время, рассчитанная от кристаллической структуры кривая рентгеновского рассеяния фосфоглицераткиназы существенно отличалась от экспериментально измеренной в растворе кривой рассеяния, что объяснялось движением доменов этого белка [165]. В настоящей работе малоугловое диффузное рентгеновское рассеяние в сочетании с моделированием кривых рассеяния применялось для анализа внутренней структуры сольвент - белковых ассоциатов.
Разворачивание расплавленной глобулы карбоангидразы В гуанидингидрохлоридом
Карбоангидраза В - белок, с высоким содержанием Р-структуры, состоящий из одной полипептидной цепи, включающий 260 аминокислотных остатков и имеющий молекулярную массу 29 кДа. Пространственная структура этого белка была получена с высоким разрешением [180] (Рис.8 ).
При рН=8.0-4.0 он сохраняет нативную структуру. Конформационное состояние, реализующееся в интевале 3.0 рН 3.9, идентифицировано как состояние «расплавленной глобулы» [84, 118, 178]. Так же, как и в случае а-лактальбумина переход в это состояние сопровождается исчезновением спектров ближнего КД, при наличии ярко выраженного спектра дальнего КД [83, 84], что свидетельствует о наличии развитой вторичной структуры. Спектр спиновой диффузии карбоангидразы В, в состоянии «расплавленной глобулы» не содержит вторичных химических сдвигов но, вместе с тем, указывает на наличие эффективной внутримолекулярной спиновой диффузии (Рис.9). Следовательно, компактность данного промежуточного состояния определяется наличием развитой вторичной структуры.
Показано, что под воздействием денатурантов «расплавленная глобула» карбоангидразы В разворачивается с почти таким же узким переходом, как и нативный белок [119]. Тот факт, что кооперативность (ширина) равновесных денатурационных переходов хорошо коррелирует со степенью структурированности белковой молекулы даёт возможность утверждать, что процессы денатурации нативной глобулы и разворачивания «расплавленной глобулы» карбоангидразы В аналогичны.
Наблюдая спиновую диффузию можно охарактеризовать компактность молекулы в целом после потери или до приобретения её нативных свойств. Кроме того, способность белков в состоянии расплавленной глобулы связывать молекулы растворителя позволяет следить за составом сольватной оболочки белка и ее изменением в процессе денатурации или ренатурации.
Оба эти утверждения иллюстрирует рис. 9-В. 1) Можно видеть, что эффективность внутримолекулярной спиновой диффузии для карбоангидразы В в состоянии расплавленной глобулы в присутствии 3.2 Моль/л GuHCl существенно снижается. Наблюдается лишь незначительный перенос намагниченности с пула метальных протонов на ароматические аминокислотные остатки, сигналы которых находяться при « 7,2 м.д. Более эффективная спиновая диффузия наблюдается для протонов, входящих в однотипную спиновую систему (аминокислотный остаток). Такое изменение ССД отражает декомпактизацию «расплавленной глобулы» карбоангидразы В в писутствии GuHCl. 2) Оба спектра содержат сигналы поглощения воды при 4,76 м.д. (Рис.9 А,В) и GuHCl при 6,94 м.д. (Рис.9-В). Этот факт отражает наличие близких и достаточно долго существующих контактов части молекул воды и денатуранта с белком [32, 129]. Время их контакта с молекулами белка должно быть равным или более времени корреляции белка как целого тс, определяемого из соотношения со2хс2»1, где со - рабочая частота спектрометра [69].
При изменении концентрации денатуранта интегральные интенсивности (ИИС) сигналов воды и GuHCl изменяются. Отношения ИИС GuHCl к ИИС воды, полученные из СО, достаточно хорошо аппроксимируются линейной функцией рис. 10-1. Однако отношения ИИС гуанидина к ИИС воды, полученные из ССД, имеют, нелинейный характер. Таким образом, поведение молекул свободного растворителя отличается от поведения, молекул растворителя, находящимися в контакте с молекулами белка.
Похожие диссертации на Исследование ненативных форм глобулярных белков методом ЯМР
