Содержание к диссертации
Введение
1. Структуры и функции токсинов - высокоспецифичных ингибиторов никотинового ацетилхолинового рецептора 8
1.1. Никотиновый ацетилхолиновый рецептор 8
1.2. Механизм активации канала 9
1.3. Структура никотинового ацетилхолинового рецептора 11
1.4. Конотоксины 15
1.5. НеЙротоксины из яда змей 18
1.6. Взаимодействие нейротоксинов с никотиновым ацетилхолиновьш рецептором 21
2. Получение а-нейротоксинов in vitro 30
2.1. Введение ЗО
2.2. Экспрессия эукариотических полипептидов в Е. coli 30
2.3. Прямая экспрессия генов нейротоксинов в E.coli 31
2.4. Продукция нейротоксинов в виде гибридов с другими белками в E.coli 33
2.5. Секреция нейротоксинов в E.coli 36
2.6. Твердофазный химический синтез 37
3. Материалы и методы 39
3.1 Материалы 39
3.1.1. Реактивы и ферментные препараты 39
3.1.2. Штаммы 40
3.1.3. Плазмидные вектора 41
3.1.4. Питательные среды для роста бактериальных культур 41
3.1.5. Синтетические олигонуклеотиды 42
3.2. Методы 44
3.2.1. Трансформация клеток coli плазмидной ДНК 44
3.2.1.1. Приготовление компетентных клеток 44
3.2.1.2. Трансформация плазмидной ДНК 45
3.2.2. Выделение плазмидной ДНК 45
3.2.3. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле 45
3.2.4. Количественные определения препаратов ДНК и примесей РНК 46
3.2.5. Выделение ДНК из агарозного геля 46
3.2.6. Олигонуклеотид-направленныймутагенез 46
3.2.7. Полимеразная цепная реакция 47
3.2.8. Экспрессия гена нейротоксина П в виде слитной полипептидной цепи с геном гиоредоксина 47
3.2.9. Анализ локализации гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II в клетках Ecoli 48
3.2.10. Выделение и очистка гибридного белка 49
3.2.11. Выделение и очистка рекомбинантного нейротоксина II 50
3.2.12. Экспрессия гена нейротоксина П в секретирующей конструкции 50
3.2.13. Анализ локализации секретируемых нейротоксинов в клетках Е. coli 51
3.2.14. Выделение и очистка секретируемых нейротоксинов 52
3.2.15. Аналитические методы 52
3.2.15.1. Электрофоретический анализ белков в SDS-ПААГ 52
3.2.15.2. Количественный анализ белковых препаратов 53
3.2.15.3. Определение //-концевой последовательности полипептидов 53
3.2.15.4. Масс-спектрометрический анализ белковых препаратов 53
3.2.16. Методы структурных исследований 54
3.2.16.1. СпектрьГН-ЯМР 54
3.2.16.2. Получение двумерных и трехмерных гетроядерных ЯМР-спектров 54
3.2.17. Методы биологических исследований 55
3.2.17.1. Анализ взаимодействия гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II с никотиновым ацетилхолиновым рецептором из Torpedo californica 55
3.2.17.2. Определение токсичности рекомбинантных токсинов 56
3.2.17.3. Определение константы ингибирования нейрональных нАХР рекомбинантным нейротоксином II и мутантными нейротоксинами 56
3.2.18. Построение молекулярных моделей 58
4. Результаты и обсуждение 59
4.1. Конструирование гена нейротоксина II 59
4.2. Конструирование гена тиоредоксина 60
4.3. Экспрессирующие вектора и биосинтез рекомбинантных токсинов в прокариотической системе (Е. coli) 63
4.3.1.1. Сборка экспрессирующей конструкции для наработки слитного белка тиоредоксин-нейротоксин П 63
4.3.1.2. Биосинтез нейротоксина II в составе слитного белка с тиоредоксином 68
4.3.1.3. Выделение и очистка гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II 69
4.3.1.4. ЯМР-спектроскопия гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II 70
4.3.1.5. Биологические свойства гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II 72
4.3.1.6. Выделение и очистка рекомбинантного нейротоксина II 73
4.3.1.7. Анализ рекомбинантного нейротоксина II 74
4.3.2.1. Экспрессирующая конструкция для секреции рекомбинантного нейротоксина II 75
4.3.2.2. Секреция рекомбинантного нейротоксина II 77
4.3.2.3. Выделение и очистка рекомбинантного нейротоксина II 78
4.3.2.4. Анализ рекомбинантного нейротоксина II 79
4.3.2.5. ЯМР-анализ рекомбинантного нейротоксина II 80
4.3.2.6. Анализ токсичности рекомбинантного нейротоксина II 81
4.3.3.1. Биосинтез изотопно-меченых вариантов нейротоксина II 81
4.3.3.2. Выделение и очистка изотопно-меченых вариантов нейротоксина II 82
4.3.3.3. ЯМР-анализ чистоты и степени мечения препаратов изотопно-меченых вариантов нейротоксина II 82
4.3.3.4. Отнесение ЯМР спектров 84
4.3.3.5. Исследование взаимодействия нейротоксина II с липидными бицеллами (анизотропной средой, моделирующей биологическую мембрану) 87
4.3.4.1. Конструирование мутантных вариантов нейротоксина II 91
4.3.4.2. Получение генов мутантных вариантов нейротоксина II mutl и mutll 94
4.3.4.3. Биосинтез мутантных вариантов нейротоксина II MutI и Mutll 95
4.3.4.4. Выделение и очистка мутантных вариантов нейротоксина II MutI и Mutll 95
4.3.4.5. Анализ рекомбинантных белков MutI и Mutll 95
4.3.4.6. ЯМР-анализ рекомбинантных белков MutI и Mutll 96
4.3.4.7. Анализ биологической активности рекомбинантных белков MutI и Mutll 97
Заключение 100
Выводы 101
- Механизм активации канала
- Экспрессия эукариотических полипептидов в Е. coli
- Методы
- Конструирование гена тиоредоксина
Введение к работе
Актуальность темы. ОС-Нейротоксины - наиболее сильнодействующие компоненты яда змей семейства Elapidae, к которому относятся и кобры (Tsetlin et. al. ,2004). Эти токсины являются высокоспецифичными конкурентными ингибиторами никотинового ацетилхолинового рецептора (нАХР), который представляет собой лиганд-зависимый ионный канал, встроенный в постсинаптическую мембрану нейронов (Hucho et. al, 2001). Высокая специфичность связывания, небольшие размеры и жесткая структура нейротоксинов делают их удобным инструментом для изучения свойств нАХР. Кроме того, наличие большого числа гомологичных аминокислотных последовательностей а-нейротоксинов делает возможным анализ структурно-функциональных взаимосвязей в их молекулах.
Существует два типа а-нейротоксинов: короткие (4 дисульфидных связи, 60-62 а.о.) и длинные (5 дисульфидных связей, 66-75 а.о.). Причем, только длинные а-нейротоксины эффективно связываются с нАХР нейронального типа, которые расположены в нейронах нервной системы, в то время как с нАХР мускульного типа, локализованными в нервно-мышечных соединениях, эффективно взаимодействуют а-нейротоксины обоих типов. Это различие объясняется разным строением центральной петли коротких и длинных а-нейротоксинов (Tsetlin et. al, 1999). Нейротоксин II из яда кобры Naja oxiana принадлежит семейству коротких а-нейротоксинов (Tsetlin et ah, 1982) и является высокоспецифичным конкурентным ингибитором мускульного нАХР. Получение и исследование различных мутантных вариантов нейротоксина II позволит не только понять принципиальные различия между короткими и длинными нейротоксинами, но и выявить механизмы, лежащие в основе взаимодействия молекул нейротоксинов с нАХР.
Данные о структуре и свойствах а-нейротоксинов, понимание механизмов их действия на молекулярном уровне важны не только с точки зрения фундаментальной науки, но и для разработки новых биомедицинских препаратов для лечения ряда заболеваний нервной системы, обусловленньж дисфункцией тех или иньж нАХР, таких как, аутизм (Martin-Ruiz et al, 2004), эпилепсия (Bertrand, 2002), депрессия, никотиновая (Hogg, et. al, 2004) и алкогольная зависимости (Cardoso et al, 1999), болезнь Альцгеймера (Martin-Ruiz et ah, 1999), паркинсонизм (Martin-Ruiz et al., 2002), мышечная дистрофия (Shen et al, 2003).
Цель исследования. Целью настоящей диссертационной работы являлось конструирование, получение и исследование физико-химических и биологических свойств генно-инженерного нейротоксина II и его мутантных вариантов.
Основные задачи исследования.
Получить ген нейротоксина II и вектора для экспрессии в прокариотической системе (Escherichia coli), а также разработать эффективную схему биосинтеза, выделения и очистки рекомбинантного нейротоксина. Наработать генно-инженерный нейротоксин II в необходимых для исследований количествах.
Изучить физико-химические и биологические свойства нейротоксина И.
Осуществить теоретический дизайн мутантных вариантов нейротоксина II из яда кобры Naja oxiana с модифицированной центральной петлей.
Получить гены мутантных вариантов нейротоксина П. Наработать мутантные варианты нейротоксина II в необходимых для исследований количествах.
Исследовать физико-химические и биологические свойства полученных рекомбинантных нейротоксинов и выявить роли конкретных аминокислотных остатков в распознавании мускульного и нейрональных нАХР различных подтипов (а7, аЗр2).
Научная новизна и практическая значимость работы. Все результаты, изложенные в настоящей диссертационной работе, получены впервые.
Разработаны высокопродуктивные экспрессионные системы, позволяющие получать нейротоксины, белки со значительным содержанием дисульфидных связей, в препаративных количествах.
Впервые проведено генно-инженерное конструирование химерного нейротоксина с заданной специфичностью.
Впервые получен 13С-15М-меченый нейротоксин, и проведено полное отнесение его ЯМР сигналов.
Впервые изучено взаимодействие коротких а-нейротоксинов с окружением, моделирующим липидный бислой.
Исследованы биологические свойства рекомбинантных белков. Показано, что гибридный белок тиоредоксин-нейротоксин II обладает активностью по отношению к нАХР мускульного типа, сопоставимой с активностью природного нейротоксина П. Рекомбинантный нейротоксин II практически полностью воспроизводит активность природного токсина. Полученные генно-инженерным путем мутантные варианты нейротоксина II с модифицированной центральной петлей, соответствующей петле нейротоксина I с некоторыми заменами, обладают способностью взаимодействовать с нейрональными нАХР. Причем, активность одного из мутантных вариантов по отношению к нейрональному нАХР а7 типа близка к активности нейротоксина I.
Наличие биологической активности полученных рекомбинантных нейротоксинов позволяет использовать эти белки как инструменты в дальнейших детальных исследованиях механизмов взаимодействия различных типов нАХР со своими лигандами, что, несомненно, представляет большой интерес с точки зрения создания эффективных терапевтических средств для лечения заболеваний нервной системы, обусловленных дисфункцией нАХР.
Апробация работы. Основные материалы диссертационной работы докладывались и обсуждались на следующих российских и международньж конференциях: XLI Научная конференция МФТИ (Москва, 1998); 13th Symposium of The Protein Society (Boston, USA, 1999);
Open Russian-Swedish Conference "NMR in Protein-Protein and Protein-DNA Recognition" (Moscow, Russia 2000); VI International Workshop on Magnetic Resonance (Spectroscopy, Tomography and Ecology) (Rostov-on-Don, Russia, 2002); X International Conference on New Information Technology in Medicine and Ecology (Gurzuf, Ukraine, 2002); XIV Winter International Young Scientist's School "Perspective Directions in Physical-Chemical Biology and Biotechnology", (Moscow, Russia, 2002); XI International Conference on New Information Technology in Medicine, Biology, Pharmacology and Ecology (Gurzuf, Ukraine, 2003); 11 Evropean Congress on Biotechnology, (Basel, Switzerland; 2003); XII International Conference on New Information Technology in Medicine and Ecology (Gurzuf, Ukraine, 2004). Апробация диссертации была проведена на заседании научного семинара лаборатории инженерии белка Института биоорганической химии им. академиков М.М. Шемякина и Ю А. Овчинникова Российской Академии Наук 7 декабря 2004 г.
Публикации. По материалам диссертации опубликовано 11 печатных работ в отечественных и зарубежных научных изданиях.
Структура и объем диссертации. Диссертация изложена на 117 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы, экспериментальной части, результатов и обсуждения, выводов и списка литературы, содержит 7 таблиц и 32 рисунка. Список литературы содержит 172 наименования.
Механизм активации канала
Передача электрических сигналов нервной клетки основана на изменении мембранного потенциала в результате прохождения ионов через управляемые ионные каналы. Ионы перемещаются за счёт энергии, запас которой создаётся благодаря работе Na+ и К+ насоса, поддерживающего высокие градиенты концентрации на мембране нервной клетки. В состоянии покоя равновесный К+ потенциал равен -70 мВ /24/. При воздействии короткого деполяризующего импульса, в результате открытия лиганд-зависимых ионных каналов при связывании с лигандом, открываются потенциал зависимые Na+ каналы, и мембранный потенциал смещается к равновесному Na+ потенциалу - возникает потенциал действия. Таким образом, лиганд-зависимые ионные каналы регулируют синаптическую передачу нервного импульса. С помощью химических синапсов осуществляется большинство связей между нейронами. Химическая передача в синапсах основана на тех же принципах, что и химическая сигнализация с помощью водорастворимых гормонов. Клетка высвобождает вещество-посредник, которое воздействует на другую клетку или группу клеток, связываясь с мембранными белками-рецепторами. Такое вещество-посредник называется нейромедиатором. В отличие от гормона нейромедиатор действует лишь на очень малых расстояниях, размер синаптической щели составляет порядка десятых долей микрометра. Лиганд-зависимые ионные каналы преобразовывают химический сигнал в форме нейромедиатора в электрический сигнал /25/. Рецепторы лиганд-зависимых ионных каналов реагируют лишь с определённым медиатором, который высвобождается из пресинаптического окончания, другие медиаторы не вызывают практически никакого эффекта. Помимо основного передатчика существуют и другие лиганды, способные управлять лиганд-зависимыми ионными каналами. Согласно эффектам, производимым связывающимися веществами, лиганды разделяются на несколько групп: агонисты, вызывающие тот же эффект, что и физиологические лиганды, и антагонисты, производящие противоположный эффект, обычно занимающие те же специфические сайты связывания, что и агонисты. Многие природные токсины растений и животных, например, токсины из ядов змей, являются конкурентными антагонистами лиганд-зависимых ионных каналов /2/, Третья группа лигандов - неконкурентные ингибиторы, необратимо связывающиеся с определёнными местами на поверхности рецептора, таким образом, блокируя ионный поток. К таким веществам относятся природные алкалоиды, например, компоненты из яда лягушек и некоторые наркотики.
Картина ещё более усложняется, с существованием очень интересной с фармацевтической точки зрения, группы веществ, называемых инверсными агонистами. Эти вещества реагируют с теми же участками рецептора, что и агонисты, но вызывают противоположный эффект, например, некоторые эфиры в отношении GABA-рецепторов /2/. Природным агонистом нАХР является ацетилхолин, однако рецептор может быть активирован и более распространённым лигандом - никотином. В ответ на нервный импульс происходит высвобождение нейротрансмиттера ацетилхолина в синаптическую щель (рис.1). Последующая диффузия молекул ацетилхолина приводит к их связыванию с рецепторными молекулами, расположенными на постсинаптической мембране. Вследствие этого лиганд-зависимый канал нАХР оказывается открытым и происходит деполяризация постсинаптической мембраны. Обратное восстановление поляризованного состояния достигается под действием фермента ацетилхолинэстеразы, который гидролизует ацетилхолин до ацетата и холина. Ацетилхолинэстераза, выделяемая мышечными клетками, прикрепляется к базальной мембране, отделяющей нервное окончание от мышечной клетки. Одна молекула ацетилхолинэстеразы способна гидролизовать до 10 молекул ацетилхолина за 1 мс, поэтому нейромедиатор практически полностью удаляется из синаптической щели за десятые доли милисекунды после его высвобождения из нервного окончания. Ацетилхолин удаляется из синаптической щели также в результате диффузии /26,27/. взаимодействия с этим белком до сих пор не совсем ясен. Также на сегодняшний день остается неизученной и пространственная структура нАХР, несмотря на то, что существует множество работ, посвященных этой проблеме, в которых исследовалась пространственная структура этого каналообразующего белка /28-36/. Сложность заключается в невозможности получить достаточные для структурных исследований количеств рецептора с правильной пространственной структурой. Многочисленные попытки экспрессировать ген нАХР в различных системах, включая бактериальные, дрожжевые системы и системы млекопитающих, /37-42/ до сих пор не привели к успеху. Рецепторы семейства нАХР подразделяются на два больших класса: мускульные и нейрональные. Мускульные нАХР расположены в скелетных нейромышечных окончаниях, где они вовлечены в нейромышечную передачу. Нейрональные нАХР находятся в периферической и центральной нервной системе, где они участвуют в быстрой синаптической передаче /21/. Каждый тип рецепторов состоит из пяти гомологичных субъединиц. Функциональное многообразие, наблюдаемое в центральной нервной системе, не является следствием большого количества нейропередатчиков -их число невелико. Такое многообразие объясняется существованием большого числа субъединиц, которые, собираясь в разных комбинациях, образуют функционально различные рецепторы /21,43,44/. В настоящее время для нейрональных нАХР известно 12 гомологичных субъединиц (а2-аЮ, р2-р4), для нАХР мышечного типа - всего 5 ( xl, рі, у, 6, є) /21,44,45,45/. Все субъединицы можно разбить на пять подклассов (а,3,у,5,є) с гомологичностью около 20-30% между различными подклассами, и 70% внутри подкласса. НАХР, выделенный из электрического органа ската Torpedo californica служит примером нАХР мускульного типа высших позвоночных и является источником большинства знаний о структуре и функции этого канала. Его молекулярная масса составляет около 290 кДа, причем 20 кДа из них составляют углеводородные цепи, присоединенные гликозилированием. НАХР мускульного типа представляет собой комплекс, состоящий из четырех типов гомологичных субъединиц 0.1,(51,7,5(8)), входящие в комплекс в соотношении а2(3у5(є) /29/. Пять субъединиц располагаются кольцом вокруг центрального ионного канала в порядке -а1н-у_а1ь-о-Р- по часовой стрелке, если смотреть из синаптической щели (рис.2).
Для мускульного нАХР, выделенного из электрического ската Torpedo californica, были обнаружены два лиганд-связывающих участка, каковыми оказались фрагменты аминокислотной последовательности 192-200 двух идентичных а 1-субъединиц, расположенные на границе субъединиц alL-5 и alH-y и проявляющие различные свойства по отношению к лигандам /46/. Эти участки показаны на рис.1 красным цветом. Анализ структуры мускульного нАХР с помощью электронного микроскопа показал /30,31,47-49/ что ширина центрального входа в канал составляет около 20 А. Предполагается, что вход в ионный канал представляет собой широкую воронку, заполненную молекулами воды. Ширина же самой узкой части канала - 7 А в открытом состоянии. С цитоплазматической стороны размер отверстия 15 А. Около трети рецептора погружено в мембрану, в то время как около 50% находится вне клетки. Каждая субъединица нАХР состоит из большого внеклеточного N-концевого домена, содержащего сайты для гликозилирования, четырех а-спиральных трансмембранных столбов (обозначаемых М1-М4) и трех межстолбовых петель, включая цитоплазматическую петлю между МЗ и М4 столбами, содержащую сайты для фосфорилирования. С-конец молекулы отдельной субъединицы экспонирован во внеклеточное пространство (рис.3). Стенки ионного канала образованы М2 столбом каждой субъединицы /50/, и было показано, что открытие и закрытие канала происходит в результате смещения М2 участков субъединиц (/49/, рис.3). Так как лиганды, в частности змеиные нейротоксины, взаимодействуют именно с внеклеточным доменом рецептора /51,52/, то структура этого домена представляет собой особенный интерес для исследователей. Рис.4. Пространственная структура ацетилхолинсвязывающето белка из Lymnaea stagnalis. а.- ленточная модель субъединицы АХБ. б.- ленточная модель целого АХБ, состоящего из пяти субъединиц. /53-56/. В последнее время был опубликован ряд работ /53-56/, посвященных исследованию пространственной структуры и функций ацетилхолин-связывающего белка (АХБ), выделенного из моллюска Lymnaea stagnalis (рис.4). Этот белок представляет собой пентамер, образованный пятью одинаковыми субъединицами. Анализ аминокислотной последовательности этого белка продемонстрировал гомологичность АХБ с внеклеточным доменом нейронального нАХР а7 типа человека, она оказалась равной 24%, степень гомологичности с другими субъединицами нАХР составила 20-24%. Исследования показали, что АХБ образует комплекс с молекулой ацетилхолина с константой диссоциации, сходной с таковой для комплекса (нАХРгацетилхолин).
Экспрессия эукариотических полипептидов в Е. coli
За последние 30 лет стало возможным проводить контролируемую высокоэффективную экспрессию чужеродных белков в различных продуцентах. Экспрессия белков в бактериях давно уже получила широкое применение, как для фундаментальных исследований, так и для коммерческих целей. Существует несколько причин, по которым для экспрессии чужеродных генов удобно использовать бактерии. Первая причина заключается в том, что выращивать бактерии несравненно проще, чем клетки высших организмов. Вторая, и самая главная причина, это -возможность применения множества молекулярно-генетических методов. Особое место в развитии подобных технологий занимает экспрессия эукариотических генов в прокариотах, таких как Escherichia coll Следует отметить, что в принципе любой ген может быть экспрессирован в Е. coli в достаточном количестве. Однако для достижения больших уровней экспрессии гетерогенных полипептидов в растворимой форме необходимо комплексное использование молекулярной биологии, бактериальной физиологии, белковой биохимии и ферментативной инженерии. Существует несколько подходов для экспрессии чужеродных генов в Е. coli: - прямая экспрессия, при которой конечный продукт накапливается в цитоплазме бактериальной клетки, при этом первым JV-концевым аминокислотным остатком целевого белка всегда является остаток метионина; - экспрессия целевого гена в виде слитной конструкции с геном какого-либо другого белка, чаще всего бактериального происхождения и обладающего какими-либо полезными свойствами, например способностью образовывать дисульфидные связи у целевого белка, или наличием группировок, облегчающими очистку конечного продукта; - секреция, в этом случае трансляция целевого гена происходит в связке с геном так называемого лидерного пептида, функция которого заключается в транспорте целевого белка с нативной ЛГ-концевой последовательностью в периплазматическое пространство бактериальной клетки. 2.3. Прямая экспрессия генов нейротоксинов в E.coli При прямой экспрессии конечным продуктом является полипептидная последовательность самого гена. В Е. coli для инициации трансляции используется последовательность ATG, кодирующая остаток метионина. Этот кодон должен предшествовать кодирующей части гена, поэтому все продукты трансляции имеют на N-кокце остаток метионина. При прямой экспрессии или экспрессии в составе гибрида рекомбинантные белки способны накапливаться в цитоплазме в значительных количествах - до 50% от общего белка. Однако в большинстве случаев экспрессированные белки образуют тельца включения, В настоящее время нет прямого объяснения, почему эукариотические белки образуют тельца включения в цитоплазме Е. coli. Однако, нативные белки Е. coli, синтезированные в больших количествах с использованием технологий рекомбинантных ДНК, также могут образовывать нерастворимые агрегаты, Как было замечено для чужеродных Е. coli белков, тельца включения имеют очень плотную структуру и легко осаждаются при низких скоростях центрифугирования. Применение детергентов или мочевины может привести к преимущественной солюбилизации и получению рекомбинантных белков со степенью чистоты от 30% до 90%. Однако при таком способе выделения целевой белок оказывается в денатурированном состоянии. Попытка ренатурации белка из телец включения не всегда приводит к желаемому результату и является трудоемким процессом. Прямая экспрессия нейротоксинов в бактериальных клетках E.coli затруднена из-за наличия в нейротоксинах большого количества остатков цистеина. В цитоплазме не образуются дисульфидные связи, и поэтому молекула нейротоксина, синтезированная в E.coli и не стабилизированная дисульфидными связями, либо образует тельца включения либо подвергается действию клеточных протеаз.
На данный момент не существует ни одной удачной работы, посвященной прямой бактериальной экспрессии генов нейротоксинов. 2.4. Продукция нейротоксинов в виде гибридов с другими белками в E.coli При прямой экспрессии в Е. coli внутриклеточное накопление эукариотических белков может быть ограничено, вследствие чего они подвержены интенсивной протеолитической деградации. Альтернативным способом цитоплазматической экспрессии генов нейротоксинов является экспрессия в составе слитного гена с белками-носителями, способствующими образованию дисульфидных связей. Технология бактериального синтеза нейротоксинов в виде гибридов с другими белками пользуется в последнее время все большей популярностью. В этом случае в результате экспрессии нарабатывается гибридный белок, состоящий из чужеродного и бактериального белков. Уровень экспрессии гибридного белка может достигать 50% от общего белка, однако, если бактериальный белок значительно больше целевого белка, то количество самого целевого белка будет небольшим. Кроме того, существует множество примеров, когда гибридные белки, несмотря на то, что удельная доля чужеродного белка невелика, все же находились в нерастворимой форме /135/. Создание химерного белка на основе белков, являющихся шаперонами, позволяет получать гибридные белки в растворимой форме. Ярким примером таких белков является тиоредоксин, бактериальный белок, отвечающий за образование правильных дисульфидных связей /136-138/. Тиоредоксин -широко распространенный и участвующий во многих клеточных процессах белок. Тиоредоксин характеризуется активным центром Cys32-Gly-Pro-Cys35, содержащим два цистеиновых остатка. Обратимое окисление этих цистеиновых остатков с образованием дисульфидной связи позволяет рассматривать активный центр тиоредоксина как окислительно-восстановительную пару в ряде биохимических реакций. Впервые окислительно-восстановительные свойства тиоредоксина были обнаружены в дрожжах при восстановлении сульфоксида метионина /139/. Цистеиновые остатки, входящие в активный центр тиоредоксина обладают различной реакционной способностью. Cys-32 легко вступает в реакции тиол-дисульфидного обмена с другими -SH и -S2 группами, в то время как Cys-35 реагирует примущественно с Cys-32, образуя внутримолекулярный дисульфидами мостик. Предполагаемый механизм действия тиоредоксина включает нуклеофильную атаку более реакционноспособной тиольной группой Cys-32 одного из атомов серы субстрата, в результате чего образуется нестабильный промежуточный дисульфид. Затем тиольная группа Cys-35 замещает атом серы субстрата, образуется окисленная форма (тиоредоксин-Бг), а субстрат восстанавливается /139/. Окисленная форма (тиоредоксин-Зз) восстанавливается до (тиоредоксин-(8Н)2) с помощью тиоредоксин-редуктазы в присутствии кофактора NADPH, причем переход от окисленной формы к восстановленной происходит с изменением конформации молекулы.
Методы
Несколько свежих колоний, выращенных на чашке со средой SOB, ресуспендировали в 1 мл среды SOB и засевали в 100 мл той же среды. Клетки инкубировали при 37С и хорошей аэрации до достижения культурой ранней логарифмической фазы роста. Культуру переносили в пробирки и охлаждали во льду в течение 15 мин, затем осаждали центрифугированием в течение 15 мин при 1000 g и 4С и тщательно удаляли супернатант. Осадок ресуспендировали в 1/3 от исходного объема клеточной суспензии буфера RF1: ЮОмМ LiCl, 50 мМ MnCl2j 30 мМ ацетата калия, 10 мМ СаС12, 15 % (вес/объем) глицерин, рН 5.8. Инкубировали 15 мин во льду и повторно осаждали при тех же условиях. Далее клетки ресуспендировали в 1/12 от исходного объема клеточной суспензии буфера RF2: 10 мМ MOPS, 10 мМ LiCl, 75 мМ СаСЬ, 15% (вес/объем) глицерин, рН 6.8 и выдерживали во льду 15 мин. Полученные компетентные клетки разливали по 200 мкл и замораживали в жидком азоте. Приготовленные компетентные клетки хранили при -70С в течение 6-9 месяцев, при этом существенного снижения эффективности трансформации не наблюдалось. 3.2.1.2. Трансформация плазмидной ДНК К 200 мкл компетентных клеток добавляли 5-20 нг плазмидной ДНК, хорошо перемешивали и инкубировали во льду в течение 30 мин. Затем клетки подвергали тепловому шоку в течение 90 сек при 42С, после чего вновь помещали в лед и инкубировали 4-5 мин. К клеточной суспензии добавляли 300 мкл среды SOB и растили в течение 60 мин при 37С и хорошей аэрации. Затем клетки высевали по 100 мкл на чашки с селективной средой. 3.2.2. Выделение плазмидной ДНК Выделение и очистку плазмидной ДНК проводили с использованием набора "QIAprep Spin МІпіргер Kit" (QIAGEN, Германия). Все манипуляции осуществляли согласно протоколу фирмы изготовителя. Выход ДНК с 5 мл ночной культуры составлял примерно 10 мкг. 3.2.3. Электрофоретический анализ ДНК в агарозном геле Электрофоретический анализ плазмидной ДНК и ее фрагментов проводили в 0.8-1.2% агарозных гелях в присутствии бромистого этидия с конечной концентрации 0.5 мкг/мл /153/. Электрофорез проводили при напряженности электрического поля 3-6 В/см, в качестве электродного буфера использовался трис-боратный буфер (89 мМ трис, 89 мМ борной кислоты, 2.5 мМ ЭДТА, рН 8.2). По окончании электрофореза пластину просматривали в трансиллюминаторе ATM (BioTecMed, Швеция). 3.2.4. Количественные определения препаратов ДНК и примесей РНК Количественные определения препаратов ДНК проводили 1) спектрофотометрически и 2) путем сравнения интенсивности флуоресценции бромистого этидия в исследуемом образце и в стандартном образце с известной концентрацией /153/, В первом случае измеряли поглощение растворов при длине волны 260 нм, что позволяло рассчитать концентрацию ДНК в образце. При этом считали, что оптическая плотность D=l соответствует 50 мкг/мл двуцепочечной ДНК и 20 мкг/мл олигонуклеотидов.
С помощью отношения величин D, измеренных при 260 и 280 нм определяли степень загрязненности препаратов ДНК примесями РНК и белков. Реакционная смесь в объеме 50 мкл содержала 50 нг матричной (плазмидной) ДНК, по 125 нг олигонуклеотидных праймеров, по 10 нмоль каждого из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов и 2.5 ед. акт. Pfu ДНК-полимеразы. Проводили 20 циклов реакции амплификации по следующей схеме: денатурация матричной ДНК при 95С (30 сек), отжиг при 55С (60 сек) и элонгация при 68С (12 мин). После завершения реакции к смеси добавляли 10 ед. акт. рестриктазы Dpn I и инкубировали в течение 60 мин при 37С. Далее аликвоты полученной смеси использовали для трансформации суперкомпетентных клеток E.coli XL-1 Blue по стандартной методике. 3.2.7. Полимеразная цепная реакция Для проведения ПЦР использовали праймеры, приведенные в табл.7. Реакционная смесь в объеме 50 мкл содержала 1 пмоль матричной ДНК, по 10 пмоль праймеров, по 10 нмоль каждого из четырех дезоксинуклеозидтрифосфатов и 1 ед. акт. Pfu ДНК-полимеразы в буфере для /Уи-полимеразы: 20 мМ Трис-НСІ, рН 8.75, 2 мМ MgS04, 10 мМ КС1, 10 мМ (NHt)2S04, 0.1 % тритон Х-100, 200 мкг/мл бычьего сывороточного альбумина. Цикл амплификации включал в себя денатурацию ДНК при 95 С (1 мин), отжиг при 56С (1 мин), и элонгацию при 70С (30 сек). Всего проводили 30 циклов реакции. Реакционную смесь наносили на агарозный гель для разделения электрофорезом и нужные фрагменты выделяли из геля с помощью QIAquick Gel Extraction Kit (Qiagen, Германия). 3.2.8. Экспрессия гена нейротоксина П в виде слитной полипептидной цепи с геном тиоредоксина Клетки штамма Е. соїі BL21(DE3)(py&$) трансформировали рекомбинантным вектором и рассевали на чашки с антибиотиками: ампициллином и хлорамфениколом. Для наращивания клеточной массы с поверхности чашек собирали примерно 0.5-2.0 колонии/мл и суспендировали их в среде ТВ, содержащей ампициллин (100 мкг/мл). Культивирование проводили при 12С и постоянном перемешивании до достижения оптического поглощения культуры на длине волны 600 нм величины 1 о.е. (примерно 24ч). После этого добавляли IPTG до концентрации 0.025 мМ, и выращивание продолжали в тех же условиях в течение ночи. 3.2.9. Анализ локализации гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II в клетках Е. coli Клетки E.coli, трансформированные соответствующими плазмидами, выращивали в питательной среде ТВ с необходимыми антибиотиками при температуре 12С и хорошей аэрации до достижения оптической плотности Абоо=ЬО о.е. Экспрессию рекомбинантных генов индуцировали добавлением И11ТГ, после чего клетки культивировали при температуре 12С и хорошей аэрации в течение ночи. Приготовление образцов для электрофоретического анализа в SDS-ПААГ суммарного клеточного белка. Образец полученной клеточной суспензии центрифугировали при 12 000 g в течение 2 мин. Осадок суспендировали в равном объеме буфера, содержащего 50 мМ Трис-HCl, рН 6.8,1 мМ ЭДГА и 1 % SDS, и прогревали на водяной бане при 95С в течение 5 мин. Водонерастворимый осадок отделяли центрифугированием при 12 000 g в течение 5 мин; супернатант смешивали с равным объемом буфера для нанесения на гель следующего состава: 50 мМ Трис-HCl, рН 6.8, 8 % SDS, 40 % Р -меркаптоэтанол, 20 % глицерин, 0.01 % кумасси R-250, и прогревали на водяной бане в течение 5 минут при 95С.
Приготовление образцов для электрофоретического анализа фракции водорастворимых цитоплазматических белков. Образец полученной клеточной суспензии центрифугировали при 12 000 g в течение 2 мин, осадок ресуспендировали в 1/8 от исходного объема буфера следующего состава: 50 мМ Трис-HCl, рН 8.0, 5 мМ ЭДГА, 100 мМ NaCl, 0.1 мМ PMSF, лизоцим 1 мг/мл. Полученную суспензию инкубировали во льду в течение 30 мин, затем добавляли до исходного объема буфер 20 мМ Трис-HCl, рН 7.0, 1 мМ ЭДГА, 0.1 % Triton Х-100. Полученную суспензию инкубировали во льду в течение 30 мин, затем центрифугировали при 12000g в течение 10 мин. Аликвоту полученного супернатанта смешивали с равным объемом буфера для нанесения на гель и прогревали на водяной бане при 95С в течение 5 мин. 3.2.10. Выделение и очистка гибридного белка Клетки собирали центрифугированием (2500 g, 45 мин., 4С) и суспендировали в фосфатном лизисном буфере (20 мМ КагНРСЦ 0.1 М NaCl, рН 8.0). Суспензию переносили в стеклянный стакан, предварительно поставленный в баню со льдом, после чего добавляли PMSF до конечной концентрации 1 мМ. Клетки разрушали ультразвуком на приборе УЗДН-2Т (10 импульсами по 20-30 с с перерывами по 3 мин). Клеточный дебрис отделяли центрифугированием (4000 g, 90 мин, 4С). Осветленный клеточный лизат наносили на Ni-NTA-SF-колонку, уравновешенную 50 мМ Na2HP04, 0.1 М NaCl, ІмМ имидазола, рН 7.6. Белки элюировали возрастающим градиентом концентрации имидазола (от 0.001 до 0.1 М). Гибридный белок выходил с колонки при концентрации имидазола примерно 0.012 М. Удалив избыток соли при помощи диализа и сконцентрировав белок ультрафильтрацией, его дочищали на анионообменной колонке Mono-Q HR 10/10 (FPLC, Pharmacia, Швеция), уравновешенной 20 мМ Трис-HCl, рН 7.6, в возрастающем градиенте концентрации NaCl (от 0 до 1 М). Гибридный белок TRX/SpHl/SpH2/Leu-Met/NT II элюировался с колонки при концентрации NaCl 0.12 М, Выделенный таким образом белок диализовали против воды МІШ-Q и лиофилизовали. 3.2.11. Выделение и очистка рекомбннантного нейротоксина II Расщепление гибридного белка бромцианом с целью получения целевого рекомбннантного NTII проводили в 70% трифторуксусной кислоте с 300-кратным мольным избытком BrCN в расчете на количество остатков метионина и концентрацией гибридного белка 0.5-1.0 мг/мл.
Конструирование гена тиоредоксина
Тиоредоксин - широко распространенный и участвующий во многих клеточных процессах белок /139/. Способность к обратимому окислению активного центра Cys-Gly-Pro-Cys тиоредоксина с образованием дисульфидной связи позволяет рассматривать его как окислительно-восстановительную пару в ряде биохимических реакций. Тиоредоксин обладает рядом полезных свойств для создания на его основе гибридных белков. Во-первых, тиоредоксин способен накапливаться в цитоплазме Е. coli до 40% от общей массы клеточных белков, оставаясь при этом в растворимой форме. Кроме того, благодаря своим небольшим размерам (11675 кДа), тиоредоксин не увеличивает чрезмерно массу гибридного белка, созданного на его основе. Расположение на поверхности белковой молекулы N- и С- концов тиоредоксина удобно для присоединения других белков. Также тиоредоксин можно рассматривать как своеобразный шаперон, отвечающий за формирование правильных дисульфидных связей. Это свойство особенно важно для экспрессии гена нейротоксина II, так как молекула этого токсина содержит четыре дисульфидных связи, восстановление которых приводит к потере биологической активности токсина /101/. Применение экспрессирующей системы, в которой используется тиоредоксин в качестве JV-концевого партнера, привело к получению в растворимой форме и с хорошим выходом одиннадцати факторов роста и цитокинов млекопитающих /136/, а также фрагментов полипептидной цепи у-интерферона человека /163/. Клонирование гена тиоредоксина Е. coli проводили при помощи метода ПНР на основании известной нуклеотидной последовательности /164/. Источником хромосомной ДНК служил штамм Е. coli TGI. Для амплификации гена использовали два праймера ptr5 и ptr3, фланкирующих кодирующую часть гена белка с 5 - и 3 -концов соответственно (табл.7). Нуклеотидная последовательность праймеров включала сайты рестрикции, необходимые для последующего клонирования в экспрессирующем векторе: олигонуклеотид ptr5 содержал сайт рестрикции JVtfel, aptr3 - Nael. Фрагмент ДНК, синтезированный в ходе ПЦР, фосфорилировали с помощью полинуклеотидкиназы фага Т4, и затем ген, кодирующий тиоредоксин, клонировали в вектор pBluescript II SK(-), предварительно расщепленный рестриктазой Smal и дефосфолированный (рис.11а). Секвенирование по методу Сенгера продемонстрировало идентичность клонированного гена тиоредоксина последовательности гена, известной из литературы. Полученная плазмида получила название pBluescriptIISK(-)/trx. Сборка экспрессирующей конструкции была осуществлена в три этапа. Из плазмиды pBluescript II SK(-)/trx с помощью рестриктаз Ndel и ВатШ был вырезан фрагмент ДНК, содержащий ген тиоредоксина. Далее этот фрагмент подвергался трехкомпонентному лигированиго с двумя фрагментами вектора pGEMEX-h Aatll - ВатШ и Aatll - Ndel. В результате получили конструкцию, в которой под контролем промотора РНК-полимеразы фага Т7 находится ген тиоредоксина. Вектор получил название pGEMEX-1/trx (рис.12). Для последующего отделения нейротоксина II от белка-носителя был предусмотрен специальный линкер (Gly-Ser)5-Gly-(Asp)4-Lys, получивший название SpHl/SpH2.
Его аминокислотная последовательность содержит сайт (Asp)4-Lys, узнаваемый высокоспецифичной протеиназой -энтеропептидазой, которая селективно гидролизует пептидную связь, находящуюся непосредственно после остатка лизина. При расщеплении полипептидной цепи энтеропептидазой можно получить целевой белок, не содержащий на ІУ-конце дополнительных аминокислот. С JV-конца к сайту узнавания энтеропептидазы примыкала последовательность из чередующихся остатков глицина и серина, что придавало линкеру гибкость и гидрофильность, а также уменьшало вероятность возникновения стерических затруднений при работе фермента (Mw -ISO кДа). Нуклеотидная последовательность SpHl/SpH2 проектировалась с таким расчетом, чтобы обеспечить подсоединение гена нейротоксина II к 3 -концу гена тиоредоксина, сохраняя, во-первых, рамку считывания гена нейротоксина, а во-вторых, исключая попадание между сайтом узнавания энтеропептидазы и началом последовательности неиротоксина II лишних аминокислотных остатков. Для соединения нуклеотидных последовательностей линкера и гена тиоредоксина повторно применялось трехкомпонентное лигирование, подобно тому, как это было сделано ранее. В данном случае использовались следующие компоненты: а) фрагмент вектора pGEMEX-1/trx, обработанного рестриктазами Aatll и Nael, содержащий ген тиоредоксина, 2) два отожженных олигонуклеотида (SpHl/SpH2)5 и (SpHl/SpH2)3 (см. табл.7), формирующих линкер SpHl/SpH2 и обработанных рестриктазой Hindlll, 3) меньший из фрагментов вектора pGEMEX-І, полученных с помощью рестриктаз Аай\ и НіпбШ.. В результате реакции лигирования был получен вектор на основе pGEMEX-1, в котором за последовательностью гена тиоредоксина располагалась последовательность линкера. Было просеквенировано шесть клонов, и плазмида с правильной нуклеотидной последовательностью гена тиоредоксина и линкера была названа pGEMEX-l/trx/SpHl/SpH2 (рис.12). На третьем этапе необходимо было ввести в получившуюся конструкцию ген нейротоксина II. Для этого также была выбрана стратегия трехкомпонентного лигирования. Плазмидная ДНК pBluescript 11 SK(-)/ntll (рисі 16) была обработана рестриктазой Xbal, а образовавшиеся липкие концы частично достроены dTTP и dCTP с помощью фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I. Далее этот вектор обрабатывался рестриктазой ВатШ, и таким образом был получен фрагмент, содержащий ген ntlL Параллельно вектор pGEMEX-l/trx/SpHl/SpH2 (рис.12) подвергали расщеплению рестриктазой НітхШІ, и образовавшиеся липкие концы были частично достроены с помощью фрагмента Кленова в присутствии dATP и dGTP. Потом ДНК была обработана рестриктазой AatW, и таким образом был получен фрагмент, содержащий ген тиоредоксина с последовательностью линкера. В результате частичных достроек Xbal- и #mdIII-KOHU.OB получились двухзвенные комплементарные концы. В качестве третьего компонента реакции лигирования выступал меньший фрагмент, получающийся при расщеплении плазмиды pGEMEX-1 рестриктазами АаШ и ВатШ (рис.12).
Правильность сборки проверялась рестриктным анализом с использованием ферментов, применявшихся в конструировании. ДНК выделенных клонов секвенировали с использованием двух праймеров SP6 и 77 (Promega, USA). При этом не было обнаружено никаких отклонений от запланированной последовательности. Полученный в результате экспрессирующий вектор получил KSi3BSLimepGEMEX-l/trx/SpHl/SpH2/ntIL Введение мутаций ЕЗОН, Q62H в ген тиоредоксина. В нашей работе использовалась мутантная форма тиоредоксина Е. соїі (ЕЗОН, Q62H), в которой боковые цепи трех остатков гистидина, включая природный His6, пространственно сближены, что позволяет проводить высокоэффективную очистку гибридного белка тиоредоксин-нейротоксин II с помощью металлохелат-аффинной хроматографии /165/. Мутации вводили последовательно при помощи ПЦР. Сначала осуществили замену ЕЗОН, затем в мутантний ген ввели вторую мутацию Q62H. Схема мутагенеза включала два этапа. На первом этапе нарабатывали фрагменты ДНК, располагающиеся по обе стороны от места введения мутации. Для этого использовали пару мутагенных праймеров (E30R/E30L или Q62R/Q62L, табл.6) и пару фланкирующих праймеров (77 или SP6). Последняя пара праймеров специфически отжигается на последовательностях, фланкирующих гибридный ген с 5 - и 3 -концов, соответственно. На втором этапе фрагменты ДНК рекомбинировали по перекрывающимся последовательностям при помощи ПЦР. Полученный полноразмерный ген, кодирующий гибридный белок с мутациями ЕЗОН, Q62H, расщепили рестриктазами Ndel и /ftwdlll и клонировали в вектор pGEMEX-І по образовавшимся липким концам. ДНК выделенных клонов секвенировали в пределах вставки методом Сенгера, используя для этого 77- и ХРб-праймеры. В результате генно-инженерных манипуляций был получен вектор для экспрессии нейротоксина II в составе гибридного белка с тиоредоксином. Ген гибридного белка в этом векторе находился под контролем Т7-промотора. Введение в линкер аминокислотных остатков Leu-Met. Были получены аналитические количества гибридного белка с линкером SpHl/SpH2, однако расщепить энтеропептидазой такой гибридный белок не удалось. Вероятно, причиной этому является дисульфидная связь между 3-ми 23-м остатками нейротоксина II, которая может создавать стерические затруднения при работе энтеропептидазы. Для решения этой проблемы линкер был удлинен еще на две аминокислоты: Leu-Met. Использование гибридного белка с таким линкером могло позволить, во-первых, получить нейротоксин II с нативным концом при расщеплении связи Leu-Met бромцианом, а, во-вторых, в этом случае "мешающая" дисульфидная связь отодвигалась на два аминокислотных остатка, что могло ослабить стерические затруднения для работы энтеропептидазы.
