Введение к работе
Актуальность темы. В настоящее время подавление репликации вируса иммунодефицита человека (ВИЧ) основано на использовании препаратов блокирующих активность вирусных ферментов - обратной/ транскриптазы и протеазы. Основным недостатком этих препаратов является, достаточно высокая токсичность для человека из-за гомологии вирусной протеазы с эукариотическими протеазами и, соответственно, обратной транскриптазы с ДНК-полимеразами клетки. Наиболее! перспективной мишенью для анти-ВИЧ терапии считается третий вирусный фермент -интеграза, которая за счет катализа реакций З'-процессинга и встраивания осуществляет интеграцию провирусной ДНК в геном клетки-хозяина и отличается своей многофункциональностью от клеточных ферментов Однако, найденные к настоящему времени несколько групп ингибиторов интегразы ВИЧ-1 (производные дикетоновой кислоты, производные нуклеотидов, ароматические соединения с гидроксильными группами) также подавляют активность других ферментов, таких как обратная транскригггаза и протеаза ВИЧ-1, эукариотические ДНК-полимеразы, бактериальные рестриктазы Другим препятствием для внедрения в клиническую практику противовирусных препаратов на основе ингибиторов интегразы является низкая корреляция между экспериментальными данными, полученными с использованием рекомбинантного фермента т vitro и данными по ингибированию репликации ВИЧ-1 в культуре клеток Отличия результатов ингибиторного анализа возможны как из-за различий в нуклеотидной последовательности гена, кодирующего фермент из различных штаммов ВИЧ, так и из-за способов определения активности интегразы in vitro.
До настоящего времени основным способом определения активности интегразы ретровирусов in vitro является процедура, основанная на использовании рекомбинантной интегразы и различных радиоактивных двуцепочечных дуплексах длиной 18-36 нуклеотидов, гомологичных концам длинных концевых повторов (long terminal repeat - LTR), в качестве субстратов Ранее было показано, что активность рекомбинантной интегразы in vitro зависит от наличия обоих LTR-концов в активном центре и протяженности субстрата, что не выполняется в случае олигонуклеотидного дуплекса. Использование же полученных на сегодняшний день протяженных ДНК-дуплексов для тестирования ингибиторов интегразы затрудняется сложным многостадийным конструированием, а также невозможностью тестировать активность интегразы в обеих шттгци<№ 3 * процаваипга и
CQC НАЦИОНАЛЬНА»| БИБЛИОТЕКА СПстср 0$ W
гооцавби ПЬНАКІ КА I
встраивания, без дополнительных модификаций субстратов применительно к каждой реакции.
Цель и задачи исследования; Целью данной работы являлось получение, исследование каталитической активности и ингибирование рекомбинатной интегразы ВИЧ-1 штамма Вш с использованием олигонуклеотидного и LTR-содержащих субстратов.
В задачи работы входило:
получить конструкцию для экспрессии в Eichenchia coh рекомбинантной интегразы ВИЧ-1 на основе штамма Bra (ВЙЧ-1/Bru) Выделить рекомбинатную интегразу ВИЧ-1/Bru и определить основные кинетические параметры полученного фермента.
провести поиск ингибиторов рекомбинантной интегразы ВИЧ-1/Bru в реакции 3*-процессинга in vitro среди соединений из химически-различных групп: ' тритерпеновых соединений (глицирризиновой кислоты, глицерретовой кислоты и ее производных, бетулоновой кислоты и ее производных), флавоноидов, кумаринов, синтетических алкалоидов, циклических сулъфонов, сесквитерпеновых лактонов, пространственно затрудненных фенольных соединений, производных полицикланов.
сконструировать протяженные LTR-содержащие субстраты и разработать методы для определения активности рекомбинантной интегразы с их использованием в реакциях З'-процессинга и встраивания in vitro. Провести сравнительное исследование активности и ингибиторный анализ рекомбинатной интегразы ВИЧ-1/Bnr с использованием стандартного субстрата - олигонуклеотидного дуплекса, и сконструированных LTR-содержащих субстратов.
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей
работе получена система определения активности рекомбинантной интегразы в реакциях З'-процессинга и встраивания. Система состоит из впервые полученной и охарактеризованной рекомбинатной интегразы ВИЧ-1 штамма Bra и впервые сконструированных LTR-содержащих субстратов длиной 636 п.н. и 1270 п.н. Данная система позволяет исследовать in vitro реакции, катализируемые интегразой ВИЧ, в условиях максимально приближенных к in vivo и с большей эффективностью осуществлять поиск ингибиторов интегразы ВИЧ-1 для их возможного дальнейшего применения в качестве препаратов для анти-ВИЧ терапии.
В результате „исследования, были найдены 2 'группы новых ингибиторов
интегразы ВИЧ-1 в реакции З'-процессинга: производные бетулоновой кислоты и производные фурил-замещенных полицикланов. Показано, что одним из механизмов анти-ВИЧ действия производных бетулоновой кислоты является ингибирование интегразы ВИЧ-1, что открывает перспективы использования в клинической практике этой группы соединений.
Апробация работы и публикации. По материалам диссертации
опубликовано 6 печатных работ, в том числе 2 статьи, 4 тезиса докладов, а также получено положительное решение о выдаче патента Российской Федерации. Результаты диссертации используются для разработки в ГНЦ ВБ "Вектор" нового анти-ВИЧ препарата на основе дипептида бетулоновой кислоты (рис. 7, 1-Зв), эффективно ингибирующего рекомбинатную интегразу ВИЧ-1/Bru в реакции З'-процессинга.
Материалы диссертации были представлены на следующих международных конференциях: "Human Proteome Organization (HUPO) 2nd Annual & XIX International Union of Biochemistry and Molecular Biology (IUBMB) World Congress (Монреаль, Канада, 2003), "2nd IAS Conference on HIV Pathogenesis and Treatment" (Париж, Франция, 2003), "The 6th international Engelhardt conference on molecular biology" (Санкт-Петербург -Москва, 2003), "28th Meeting of the Federation of European Biochemical Societies (FEBS)" (Стамбул, Турция, 2002).
Структура и объём работы. Диссертация изложена на 118 страницах машинописного текста и состоит из введения, обзора литературы (посвященного структуре, механизмам функционирования и ингибирования ретровирусных интеграз), экспериментальной части, обсуждения результатов, выводов и списка литературы (180 ссылок), содержит 30 рисунков и 9 таблиц.
