Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 10
1.1. Клеточные культуры как модель экспериментальной онкологии 10
1.2. Разработка адресованных противоопухолевых препаратов 13
1.2.1. Создание новых противоопухолевых препаратов, влияющих на передачу митогенных сигналов 16
1.2.2. Молекулярные мишени для антиангиогенной терапии 20
1.2.3. Теломераза - потенциальная мишень противоопухолевой терапии 22
1.2.4. Противоопухолевые препараты - индукторы апоптоза 25
1.3. Тритерпеновые соединения 33
1.3.1. Глицирризиновая кислота 36
Противоопухолевая активность 38
1.3.2. Бетулин, бетулиновая кислота 39
Противоопухолевая активность 40
2. Материалы и методы 44
2.1. Материалы 44
2.1.1. Реактивы, используемые в работе 44
2.1.2. Исследуемые соединения 44
2.1.3. Клеточные линии 46
2.1.4. Олигодезоксирибонуклеотиды 46
2.1.5. Буферные растворы 47
2.2. Методы 47
2.2.1. Исследование цитотоксической активности соединений в опухолевых клетках в культуре (МТТ-тест) 47
2.2.2. Анализ апоптоза методом проточной цитометрии 49
2.2.3. Выделение суммарной клеточной РНК 49
2.2.4. Определение концентрации РНК в образце 50
2.2.5. Реакция обратной транскрипции 50
2.2.6. Полимеразная цепная реакция 51
2.2.7. Анализ продуктов ПЦР 52
2.2.8. Флуоресцентная гибридизация in situ с последующим анализом на проточном цитометре (flow-FISH) 52
2.2.9. Статистическая обработка данных 53
3. Результаты и их обсуждение 54
3.1. Исследование цитотоксической активности производных высших тритерпенов in vitro 54
3.1.1. Исследование цитотоксической активности производных бетулина in vitro 54
3.1.2. Исследование цитотоксической активности производных глицирризиновой кислоты in vitro 58
3.2. Исследование способности тритерпенов вызывать апоптоз в опухолевых клетках in vitro 61
3.3. Изучение молекулярных механизмов противоопухолевого действия производных тритерпеновых соединений 68
3.3.1. Исследование влияния производных тритерпенов на экспрессию гена ВЫ-2 в опухолевых клетках 69
3.3.2. Исследование влияния производных тритерпенов на экспрессию гена Cyclin D1 в опухолевых клетках 72
3.3.3. Исследование влияния производных тритерпенов на экспрессию гена hTERT в опухолевых клетках 75
Заключение 80
Выводы 85
Список литературы
- Разработка адресованных противоопухолевых препаратов
- Олигодезоксирибонуклеотиды
- Исследование цитотоксической активности производных бетулина in vitro
- Изучение молекулярных механизмов противоопухолевого действия производных тритерпеновых соединений
Введение к работе
Рост онкологической заболеваемости в XX веке происходил такими быстрыми темпами, что это дало основание для его сравнения с эпидемией. Ежегодно во всём мире от злокачественных опухолей умирает около 7 млн человек. По данным Всемирной организации здравоохранения в 2006 году в мире от рака умерло свыше 7 млн человек и диагностировано 10 млн новых случаев онкологических заболеваний. В большинстве развитых стран они занимают второе место среди причин смерти. По оценкам Всемирной организации здравоохранения онкологические заболевания к 2020 году выйдут на первое место в мире по смертности в структуре всех заболеваний, обогнав при этом «традиционного лидера» - сердечно-сосудистые заболевания. К 2030 году число новых диагнозов может возрасти до 27 млн, а число живущих с раком пациентов достигнет 75 млн.
Таким образом, поиск и создание эффективных лекарственных противоопухолевых препаратов является актуальной задачей в современной науке.
Национальный институт рака (National Cancer Institute) осуществляет программу по разработке противоопухолевых препаратов. В рамках этой программы ежегодно проводится тестирование in vitro более 10000 соединений как природного, так и синтетического происхождения. NCI Drug Information System располагает информацией о 400000 соединениях, протестированных на сегодняшний день. Важное место в таких исследованиях занимает поиск возможных молекулярных мишеней или модуляторов для этих лекарств. Число таких мишеней составляет уже более 100, и их число постоянно растет (Dai Z. et al., 2007).
Особенный интерес вызывают те соединения, о противоопухолевой активности которых уже есть данные. Давно известно, что глицирризиновая кислота (ГК), глицирризин, активные компоненты корня солодки (Glycyrrhiza sps.) обладают антиканцерогенным и антимутагенным действием (Tanaka М. and Мапо N., 1987). Позднее было показано, что глицирризин, глицирризиновая кислота и некоторые ее производные способны избирательно ингибировать рост опухолевых клеток в культуре (Rossi Т. et al., 2003).
Бетулиновая кислота (БК) - растительный пентациклический тритерпеноид, выделенный из коры березы (Кислицын А. Н., 1994), обладает избирательным цитотоксическим действием в отношении различных опухолевых клеток, противовирусными свойствами, такими как анти-ВИЧ активность, противомалярийным, антибактериальным, а также системным противовоспалительным действием (Kashiwada Y. et al., 1996).
Противоопухолевая активность была показана на клеточной линии меланомы (Liu W. et al., 2004), а таюке на модели in vivo, на бестимусных мышах, несущих человеческую меланому (Pisha Е. et al., 1995). Противоопухолевое действие БК и некоторых ее аналогов связывают с избирательной индукцией апоптоза в опухолевых клетках (Eiznhamer D. et al., 2004). В 2000 году БК была включена в программу RAID (Rapid Access to Intervention Development) Национального института рака, как потенциальный противоопухолевый агент (http://dtp.nci.nih.gov/docs/small mol/status small mol.html). В настоящее время препарат на основе бетулиновой кислоты проходит клинические исследования в США в качестве средства для лечения злокачественной меланомы (http://clinicaltrials.gov/show/NCT00346502).
Данные последних исследований свидетельствуют о том, что БК, ГК и другие природные тритерпены ингибируют пролиферацию опухолевых клеток, индуцируют их апоптоз (Urech К. et al., 2005; Essaady D. et al., 1996; Rossi T. et al., 2003), либо усиливают его индукцию при действии лучевой или химиотерапии (Sawada N. et al., 2004; Wick W. et al., 1999; Fulda S. et al., 1997), подавляют процессы ангиогенеза и метастазирования (Melzig М. et al., 1998). Однако, несмотря на значительное количество данных о противоопухолевой активности растительных тритерпенов, на настоящий момент не до конца понятны механизмы их действия в клетке. Показано, что основной противоопухолевый механизм действия тритерпенов связан с индукцией апоптоза в опухолевых клетках, запуск которого под действием ГК, БК в раковых клетках осуществляется независимо от «рецепторов смерти» (CD-95/Fas) и белка р53. С другой стороны, из литературных данных известно, что при действии бетулиновой кислоты на опухолевые клетки происходит активация каспазы 9, но не каспазы 8, что может говорить о Bcl-2-зависимом пути индукции апоптоза (Fulda S. et al., 1997; 1999; Zuco V. et al., 2002).
Изложенное выше определило цель настоящей работы: изучение противоопухолевой активности производных тритерпенов in vitro и исследование возможных молекулярных механизмов их противоопухолевого действия в опухолевых клетках человека in vitro.
Для достижения цели решались следующие задачи:
1) Исследовать цитотоксическую активность высших терпеноидов амиранового и лупанового рядов (глицирризиновой кислоты, глицирретовой кислоты, бетулина, бетулиновой кислоты и их производных) в культурах опухолевых клеток, выявить наиболее активные.
2) Изучить с помощью метода проточной цитометрии способность наиболее активных производных тритерпеновых соединений индуцировать апоптоз в опухолевых клетках человека (линии МТ-4, MOLT-4, СЕМ, Hep G2, HeLa). 3) Исследовать влияние наиболее активных производных тритерпенов на экспрессию гена апоптоза Bcl-2 и клеточного цикла Cyclin D1 в опухолевых клетках человека в культуре.
4) Исследовать с помощью метода флуоресцентной гибридизации in situ с последующим анализом на проточном цитометре возможное влияние производных наиболее активных тритерпенов на экспрессию гена каталитической единицы теломеразы (hTERT) в опухолевых клетках in vitro.
Апробация работы и публикации. Результаты исследования были представлены на 10-ой международной школе-конференции для молодых ученых «Биология - наука XXI века» (Пущино, 2006), на 14-й, 15-ой, 16-ой международных конференциях «СПИД, рак и общественное здоровье» (Санкт-Петербург, 2005, 2006, 2007), на 8-ом международном симпозиуме «Biology of Disease - A Molecular Battlefield» (Гейдельберг, Германия, 2006), на 10-ом международном симпозиуме европейского общества медицинской химии (EFMC) и американского химического общества (ACS) «International Symposium on Advances in Synthetic and Medicinal Chemistry ASMC 07» (Санкт-Петербург, 2007). По результатам работы опубликовано 8 печатных работ, из них 2 статьи и 6 тезисов докладов.
Личный вклад автора. Все эксперименты были выполнены и проанализированы автором, часть измерений на проточном цитометре была проведена сотрудниками Института клинической иммунологии СО РАМН Борисовым В. И. и Пронкиной Н. В.
Научная новизна и практическая значимость работы. Впервые проведено тестирование на противоопухолевую активность 25 соединений тритерпенового ряда на 5 опухолевых клеточных линиях человека. Определены 50% ингибирующие дозы для этих клеток (ИД50). Выявлены наиболее активные. С помощью метода проточной цитометрии получены новые данные, характеризующие способность природных тритерпенов лупанового ряда и их производных индуцировать апоптоз в опухолевых клетках in vitro. Исследованы молекулярные механизмы действия тритерпенов лупанового ряда в клетке. Впервые показано, что механизм действия производных бетулиновой кислоты связан со снижением экспрессии гена апоптоза Bcl-2, клеточного цикла Cyclin D1, каталитической субъединицы теломеразы hTERT.
Оригинальный фактический материал, полученный в процессе экспериментальных исследований, представляет собой ценную информацию для дальнейшего изучения противоопухолевого действия тритерпенов с целью направленного создания производных с повышенной специфичностью воздействия на молекулярные мишени опухолевых клеток. Приведенные исследования также являются стимулом для дальнейшего доклинического исследования производных бетулиновой кислоты в системах in vivo их противоопухолевой активности и создания на их основе перспективных препаратов со специфической противоопухолевой активностью.
Разработка адресованных противоопухолевых препаратов
Использование систем in vitro стало основным методом скрининга возможных противоопухолевых соединений с самого начала клинической химиотерапии рака в 1946 году. Система тестирования in vitro была в последствии включена в программу скрининга Национального института рака (Holbeck S. L., 2004). С практической точіси зрения важным является применение культуры клеток опухолей человека для отбора потенциальных противоопухолевых соединений. Воздействие на такие клетки различными лекарствами может помочь в выявлении механизма действия лекарств, а также установить эффективность их действия (Yamori Т., 2003). Безусловно, закономерности протекания данных процессов в клетках в культуре, могут весьма отличаться от таковых in vivo, что следует иметь в виду при интерпретации полученных результатов. Тем не менее, опыты in vitro позволяют получить достаточно информации о клеточных и молекулярных механизмах действия противоопухолевых веществ. Важность и значимость таких экспериментальных данных не вызывает сомнения. Клеточные культуры также используют для всестороннего изучения биохимических процессов, пролиферативного статуса, ангиогенной способности раковых клеток, обеспечивающего информацию о метастатическом потенциале опухоли in vivo (Ross D. Т. et al., 2001). Изучение механизмов прогрессии модельных клеточных линий является фундаментальной проблемой современной онкологии и может способствовать разработке новых методов терапии злокачественных новообразований. Следует заметить, что многие фундаментальные открытия в области онкологии были сделаны с использованием клеточных культур (Kim J. В. et al., 2004).
Сейчас все больше выявляется необходимость использования систем in vitro. Исследования цитотоксичности препаратов с использование систем in vivo осложняется наличием структурной и функциональной гетерогенности клеток опухоли, ограниченностью применения результатов, полученных на животных, к человеку, вследствие значительного количества видовых различий в метаболизме, и, кроме того, экспериментальные системы in vivo не могут быть использованы для раскрытия точных молекулярных механизмов действия препаратов (Davila J. et al., 1998).
По сравнению с исследованиями in vivo использование в качестве объектов культур клеток имеет ряд преимуществ: высокая стандартность объектов эксперимента, поскольку культуры представляют собой генетически однородную популяцию клеток, растущих в постоянных условиях; высокая чувствительность клеточных культур к изменениям условий существования при воздействии химических и других факторов; возможность оценки жизнеспособности клеток на протяжении всего эксперимента; возможность использования относительно малого количества биологического материала вместо дорогостоящих линейных животных, что позволяет одновременно проводить испытание нескольких препаратов в различных дозах, а также различных схем их применения. Исчезает необходимость учета метаболизма исследуемых соединений печенью, их экскреции почками, кумуляции мышцами и в жировой ткани (Builles N. et al., 2007).
В связи с этим, клеточные культуры сегодня рассматриваются, как альтернативная модель экспериментам на животных. С этой целью разрабатываются клеточные культуры сопоставимые с фенотипом опухолевых клеток человека in vivo (Satyamoorthy К. et al., 2004; Walter-Yohrling J. et al., 2004; Duss S. et al., 2007). Например, был создан ряд систем комбинированных культур (линии MCF-7) для рака молочной железы таким образом, что они составляют трехмерную (3D) структуру, сопоставимую с солидной опухолью in vivo (Dhiman Н. К. et al., 2005; Lee G. Y. et al., 2007). Следует особо подчеркнуть, что использование клеточных культур человека на доклиническом этапе создает уникальную возможность уменьшения вероятных ошибок и отрицательных результатов при клинических испытаниях, поскольку некоторые параметры у лабораторных животных и человека отличаются не только в физиологическом, но и в патогенетическом аспектах. Поэтому, важна разработка моделей in vitro, а также цитогенетическая характеристика уже имеющихся клеточных культур (Mehta J. P. et al., 2007), что также позволит уменьшить количество животных, используемых для биологического тестирования.
Наиболее простыми и доступными системами на сегодня являются опухолевые клеточные линии (Dhiman Н. К. et al., 2005). В настоящее время получено и охарактеризовано большое количество опухолевых линий человека, культивируемых in vitro. Кроме того, постоянные клеточные линии используются в качестве основы для получения новых мутантных линий с направленным, необходимым исследователю изменением свойств. С помощью современных методов молекулярной биологии и биотехнологии стало возможным получение модельных систем клеточных культур, стабильно экспрессирующих те или иные онкогены. Получены клеточные линии резистентные к различным противоопухолевым препаратам, при изучении которых возможно получение информация о генах и белках, ассоциированных с приобретением лекарственной устойчивости (Watson М. В. et al., 2007).
По мере развития науки, стало совершенно очевидным, что создание лекарственных препаратов должно базироваться на выявлении биологически активных веществ, участвующих в процессах жизнедеятельности, изучении патофизиологических и патохимических процессов, лежащих в основе развития раковых заболеваний, а также углубленном исследовании молекулярных механизмов противоопухолевого действия.
Олигодезоксирибонуклеотиды
Среди производных ГК наряду с традиционными противовоспалительными и противоязвенными, иммунорегуляторными и противовирусными свойствами (Abe N. et al., 1982; Pompei R. et al., 1979), обнаружено противоопухолевое свойство в системах in vitro и in vivo (Shiota G. et al., 1999; Wang Z. Y. et al, 2001; Rossi T. et al, 2003).
Результаты экспериментальных исследований свидетельствуют, что солодка и выделенная из этого растения глицирризиновая кислота (ГК) обладает разнообразной биологической активностью. В мировой литературе достаточно широко представлена эффективность применения глицирризиновой кислоты. Препараты ГК применяются в традиционных медицинах Китая, Японии и Кореи при хронических воспалительных заболеваниях, вирусном гепатите и циррозе печени, а также как профилактическое средство карциномы печени (Acharya S. et al., 1993; Shibata S. et al., 2000).
Высокая противовирусная активность ГК в отношении вируса герпеса симплекс, вируса гепатита А, ВИЧ была показана многими авторами (Dargan D. et al, 1994; Soler E. et al, 1996; Плясунова О. А. и др., 1992). Механизмы в частности анти-ВИЧ активности связаны с блокированием ранних стадий вирусной репродукции - проникновением вирусных частиц в клетку, а также ингибирование обратной транскриптазы вируса (Ильина Т. В. и др., 2002).
Солодка в эксперименте проявляет выраженные противовоспалительные свойства сравнимые с диклофенаком, ингибирует активность как циклооксигеназы, так и липооксигеназы, подавляет продукцию простагландина Е2 (Herold A. et al, 2003; Aly A. et al., 2005; Furuhashi I. et al., 2005). Экспериментально доказано, что в основе механизма противовоспалительного действия солодки лежит структурное сходство молекулы основного действующего вещества - ГК с кортикостероидами (Bernardi М. et al., 1994; Kuroda М. et al., 2003; Мае Т. et al, 2003).
Противоопухолевая активность. В экспериментах на животных выяснилось, что ГК, а также глицирретовая кислота оказывают защитное действие в отношении различных злокачественных процессов. В опытах на мышах ГК предотвращает образование кожных опухолей, вызываемых химическими канцерогенами. ГК тормозит развитие опухолей, вызванных 7,12-диметил-бенз(а)антраценом и 12-О-тетрадеканоилфорбол-13-ацетатом (Wang Z. et al, 2001). Оральное введение динатриевой соли глицирретовой кислоты также приводит к ингибированию роста кожных опухолей мышей. Механизм действия связывают торможением метаболизма фосфолипидов и транспортом З-О-метил глюкозы, которые происходят под действием канцерогенов (Nishino Н. et al, 1986; Kitagawa К. et al, 1986).
Более поздние исследования показали, что ГК обладает антипролиферативной активностью в отношении опухолевых клеток человека. По данным МТТ теста установлено антипролиферативное действие ГК на рост клеток в культуре MCF-7 (аденокарцномы молочной железы). С помощью TUNEL метода было обнаружено значительное увеличение доли апоптотических клеток в культуре MCF-7 после обработки ГК (Rossi Т. et al., 2003).
Интересны исследования, показывающие, что антипролиферативный эффект ГК носит не только прямой характер, но также является следствием дифференцировки клеток in vitro, при которой они теряют способность к пролиферации. ГК вызывает дифференцировку клеток меланомы (линия В16), вызывая морфологические изменения и, стимулируя меланогенез (Abe Н. et al., 1997), механизм действия связан с остановкой перехода клеток из G1 в S фазу клеточного цикла и увеличением экспрессии мРНК белка TRP-2, необходимого для нормального морфогенеза и дифференцировки меланоцитов (Jung G. et al, 2001).
Бетулин, бетулиновая кислота (рис. 3), также как и ГК, обладают весьма разнообразной биологической активностью. Гепатопротекторную, противовоспалительную, антиоксидантную, иммуномодулирующую, антивирусную и антиканцерогенную активность различных извлечений из березы связывают, прежде всего, с присутствием в составе листьев и коры березы тритерпеноида бетулина и его производного - бетулиновой кислоты, проявляющих аналогичную биологическую активность (Флетчер О. Б. и др., 2002).
Тритерпеновий диол бетулин, который является основным природным соединением, содержащимся в березовой коре, в последние годы привлекает внимание возможностью получения из него бетулиновои кислоты (Толстиков Г. А. и др., 2005; Флетчер О. Б. и др., 2002). Особый интерес вызывают БК и ее производные (Baglin I. et al., 2002; Cichewicz R. H. et al., 2004, Einzhamer D. A. et al., 2004; Yogeeswari P. et al., 2005).
В США проходит предварительные клинические испытания новый препарат для лечения СПИДа, получивший название РА-457, представляющий собой производное бетулиновои кислоты. Противовирусный механизм РА-457 связан со способностью взаимодействовать с протеинами капсида (белковой оболочки) вируса, предотвращая проникновение вируса в клетку (James J. S., 2005; Sakalian M. et al, 2006).
Иммуностимулирующую активность БК связывают с повышением концентрации ИЛ-1 и TNF-a. БК также усиливает функциональную активность макрофагов, которые играют ключевую роль в усилении специфического противоопухолевого иммунного ответа (Yun Y. et al, 2003).
Противоопухолевая активность. Ранее накоплен богатый материал, свидетельствующий о лечебных и профилактических свойствах БК. Установлено, что введение БК мышам отодвигало сроки развития спонтанных и индуцированных опухолей, снижало скорость их роста и частоту возникновения, а также увеличивало продолжительность жизни животных (Yusukawa К. et al, 1991).
Позднее многими исследованиями было показано, что БК является экспериментальным антинеопластическим агентом, который индуцирует апоптоз в клетках меланомы in vitro и in vivo (Pisha E. et al, 1995; Eiznhamer D.A. et al, 2004), а также в лейкозных, нейроэктодермальных и эпителиальных опухолевых клетках in vitro (Ehrhardt Н. et al, 2004; Fulda S. et al, 1999). В настоящее время препарат на основе бетулиновой кислоты походит II стадию клинических исследований в США в качестве противоопухолевого средства для лечения злокачественной меланомы (http://clinicaltrials.gov/show/NCT00346502).
Было выяснено, что БК активируют апоптоз независимо от «рецепторов смерти» (CD-95/Fas) и белка р53. Бетулиновая кислота не изменяет экспрессию рецептора CD-95 или CD-95-L, не влияет на их взаимодействие, проявляя апоптозиндуцирующую активность как в клетках с «дикой» формой белка р53, так и в клетках с мутантной формой этого белка (Fulda S. et al, 1997; Zuco V. et al, 2002). Однако интересен тот факт, что БК усиливает TNF-индуцированный апоптоз (Yasunari Т. et al, 2003).
Также показано, что бетулиновая кислота не только вызывает апоптоз опухолевых клеток, но и повышает их чувствительность к лучевой и химиотерапии (Sawada N. et al., 2004), что может быть использовано в случаях лекарственной устойчивости (Wick W. et al., 1999; Fulda S. et al., 1997), а также в комбинации с лучевой (Selzer Е. et al., 2000) и химиотерапией (Selzer Е., 2002). Важно отметить, что клетки нейробластомы резистентные к CD95- и доксорубицин опосредованному апоптозу были чувствительны к действию бетулиновой кислоты, что также предполагает использование бетулиновой кислоты в некоторых случаях лекарственной устойчивости (Fulda S. et al., 1997).
Исследование цитотоксической активности производных бетулина in vitro
Для исследования действия тритерпеновых соединений, на клеточный рост в культуре использовали стандартный МТТ-тест, который используется для оценки цитотоксичности потенциально противоопухолевых соединений в эксперименте и основан на способности дегидрогеназ живых клеток восстанавливать неокрашенные формы 3-4,5 диметилтиазол-2-ил-2,5-дифенилтеразолиумбромида до голубого кристаллического формазапа, растворимого в изопропаноле. В качестве критерия противоопухолевой активности in vitro использовали показатель ИД5о (50 % ингибирующая доза) исследуемых веществ (Mosmann Т., 1983; Wilson J. et al., 1990; Kasugai S. et al., 1990).
Было исследовано противоопухолевое действие немодифицированных растительных тритерпенов ГК, глицирретовой кислоты, бетулина и БК в культуре опухолевых клеток человека. Известно, что очень часто модифицированные природные соединения по активности значительно превосходят исходные вещества (Толстиков Г. А. и др., 2002). В связи с этим, изучение модифицированных аналогов высокоактивных природных соединений является весьма перспективным. Поэтому была изучена противоопухолевая активность новых модифицированных производных растительных тритерпенов in vitro.
Было проведено тестирование на ингибирующую активность экспериментальных препаратов, представленных на рисунке 4А (производных бетулина (І, 1а-б, III, IV, IVa-л), на жизнеспособность опухолевых клеток человека в культуре (линии МТ-4, MOLT-4, СЕМ, Hep G2 и HeLa).
Количественная характеристика цитотоксической активности (50 % ингибирующие дозы, ИД5о) растительных тритерпенов и их модифицированных производных приведена в таблице 2.
Из результатов, представленных в таблице, видно, что клеточные линии оказались в разной степени чувствительны к действию тритерпенов данного ряда. Гетерогенность ответа между разными популяциями опухолевых клеток in vitro является одним из критериев, говорящим в пользу специфической противоопухолевой активности, нежели о неспецифической токсичности, где в разных популяциях клеток ответы сходны (Freshney R. I., 1989).
Ингибирующая доза (ИД5о) исследованных соединений находилась в интервале между 5,5 ± 0,5 и 390,5 ± 2,2 мкМ. Амиды и дипептид бетулоновой кислоты (IVa-r) явились более активными ингибиторами роста опухолевых клеток МТ-4, MOLT-4, Hep G2, HeLa, они ингибировали жизнеспособность клеток в меньших концентрациях (ИД50 составила 5,5 ± 0,5 - 89,4 ± 2,1 мкМ), чем БК (III) (ИД50 составила 11,6 ± 1,7 - 120,5 ± 1,4 мкМ) или бетулоновая кислота (ИД5о составила 21,8 ± 1,5 - 108,3 ± 3,5 мкМ), хотя в клетках СЕМ БК (III) оказалась более активной, чем амиды бетулоновой кислоты (IVa-в). С28-Моносукцинат ацетата бетулина (16) обладал более выраженной ингибирующей активностью на клетки линий МТ-4, MOLT-4, СЕ М, Hep G2 и HeLa, чем бетулин (I). Необходимо отметить, что в других исследованиях, в частности на клетках меланомы (линия В16), также показана слабая активность бетулина, для этого соединения ИД5о показатель на этих клетках составлял 100 мкг/мл (277 мкМ) (Liu W. К. et al., 2004). Также из литературных данных известны примеры высокоактивных цитотоксичных ацетоксилупанов, содержащих также С28-карбоксильную группу (Sarec J. et al., 2003). Высокой ингибирующей активностью на рост опухолевых клеток обладали амиды и дипептид бетулоновой кислоты (IVa-r). При этом соединения (IVa-r) оказались более активными ингибиторами жизнеспособности некоторых опухолевых клеток, чем бетулиновая кислота (III). Наиболее активным соединением оказался дипептид бетулоновой кислоты (IVr). Длина метиленового звена (СН2)П (п=7,8,10) в амидном остатке незначительно изменяет ингибирующую активность этих производных, однако введение второго амидного остатка приводило к увеличению ингибирования жизнеспособности опухолевых клеток СЕМ, MOLT-4, МТ-4, HeLa, Hep G2 (соединение IVr). Таким образом, длины спейсер-метиленового звена оказывают влияние на цитотоксическую активность соединений в отношении опухолевых клеток. Слабую противоопухолевую активность in vitro проявили соединения (IVA-Л), показатель ИД50 составил 100,4 ±1,9 мкМ и более. Можно предположить, что это связано с наличием неполярных заместителей в С-28 положении этих соединений, отсутствием концевой карбоксильной группы в этом положении.
Таким образом, исследования, проведенные на этом этапе, показывают, что существует определенная связь между химической структурой и противоопухолевой активностью исследованных тритерпеновых гликозидов in vitro. Ранее показано, что противоопухолевая активность тритерпеновых гликозидов в малой степени зависит от химической структуры агликона, а в основном определяется количеством и местом присоединения к агликону боковых радикалов (Baglin I. et al., 2003). Замечено, что модификации бетулиновой кислоты по положению С-20 не приводят, по данным МТТ-теста, к усилению ее ингибирующих свойств на клетки различных опухолевых линий человека (НСТ-116, РС-3, M14-MEL, SK-MEL-2, UAACC-257) (Kim J. Y. et al., 2001).
Изучение молекулярных механизмов противоопухолевого действия производных тритерпеновых соединений
Как видно из рисунка 13, инкубирование клеток СЕМ в течение 48 ч с соединениями (IVa-r) в концентрации 10 мкг/мл приводит к уменьшению экспрессии гена Cyclin Dl в 1,6 - 2 раза по сравнению с клетками, инкубируемыми без экспериментальных препаратов (контролем) (р 0,05). Как оказалось, бетулиновая кислота (III) не влияла на уровень мРНК Cyclin Dl в исследуемых лейкозных клетках СЕМ.
Подобные результаты были получены при анализе изменения содержания мРНК Cyclin Dl под действием производных тритерпенов (III, IV, IVa-r) в лейкозных клетках MOLT-4 (рис. 14).
Рисунок 14 показывает, что амиды бетулоновой кислоты (IVa-в), а также ее дипептид (IVr), приводит к снижению содержания мРНК Cyclin Dl в клетках MOLT-4 в 1,9-2,1 раза по сравнению с контролем (р 0,05). Однако, не было отмечено изменения уровня мРНК Cyclin Dl действием бетулоновой кислоты (IV). Так же как и в случае действия БК (III) на клетки СЕМ (рис. 13), БК не влияла на содержание мРНК Cyclin Dl в клетках MOLT-4.
Известно, что основной этиологический фактор острых Т-клеточных лейкозов является онкогенный вирус Т-клеточной лейкемии человека I (HTLV-I) семейства ретровирусов (Yip М. Т. et al., 1990). HTLV-1 обладает способностью влиять на злокачественное перерождение Т-лимфоцитов. Один из трансформирующих факторов является стимуляции вирусами клеточного цикла - прямая активация комплексов Cyclin D-Cdk (Cyclin-dependent kinase). Например, известен онкобелок Tax вируса HTLV-I, который активирует транскрипцию генов Cyclin D1 и Cdk6 (Neuveut С. et al., 2000). Повышенная продукция Cyclin D1 способствует инициации клеточного деления. Избыток комплексов Cyclin Dl/Cdk6(4) позволяет реализоваться транскрипционным факторам пролиферации, стимулирует переход клетки из состояния GO в фазу G1 клеточного деления и затем клетка переходит в S-фазу клеточного цикла (Williams М. Е. et al., 2005). Безусловно, этот белок в высоких количествах обладает онкогенными свойствами, поскольку влияет на контроль клеточного роста, темп клеточного цикла и экспрессию генов (Sutherland R. L. et al., 2002). С другой стороны отмечено, что ингибирование экспрессии Cyclin D1 приводит к остановке клеточного деления и выходу клетки в фазу апоптоза.
Таким образом, проведенные эксперименты наглядно свидетельствуют о том, что механизм противоопухолевого действия амидов и дипептида бетулоновой кислоты в клетках Т-клеточных лейкозов человека (СЕМ, MOLT-4) связан со снижением экспрессии гена Cyclin D1 в этих клетках, что может обуславливать остановку деления клеток и выход в фазу апоптоза.
Следующим шагом в изучении возможных механизмов противоопухолевого действия тритерпенов стало исследование влияния соединений на уровень мРНК hTERT (каталитической единицы теломеразы) в лейкозных клетках MOLT-4.
Показано, что активность теломеразы тесно ассоциирована с экспрессией мРНК ее каталитической субъединицы hTERT. Гиперэкспрессия гена hTERT обнаруживается во многих опухолевых клетках (Yang Y. et al., 2002). Определение уровня мРНК hTERT используется для диагностики, прогноза и оценки эффективности терапии онкологических заболеваний (Burger A. et al., 2005), и рассматривается многими исследователями как перспективная мишень для потивоопухолевых препаратов (Pendino F. et al., 2006).
Изменение содержания мРНК hTERT было определено с помощью метода флуоресцентной гибридизации in situ с последующим анализом на проточном цитометре (flow-FISH). Приведенный рисунок (рис. 15) показывает осуществление автоматического анализа клеток MOLT-4 в потоке.
Типичная точечная диаграмма отображения клеток показана на рисунке 15А (регион R1), где каждая клетка фигурирует как отдельная светящаяся точка. Последующая автоматическая количественная обработка сигналов позволила строить функции распределения клеток из исследуемой популяции регион R1 в зависимости от сигнала интенсивности флуоресценции по первому каналу FL1 (рис. 15Б). Следующий рисунок (рис. 16) характеризует сравнительный анализ полученных данных с помощью метода flow FISH, относительное содержания мРНК hTERT в клетках MOLT-4 в контроле (клетки необработанные соединениями) (100%) и обработанных соединениями (III, IVa-r), процентное содержание мРНК hTERT относительно контроля.
