Содержание к диссертации
Введение
Культура трансформированных клеток, как модель для изучения биологической активности веществ 7
Индуцированная гибель и изменение количества трансформированных клеток 10
Понятие цитолитического процесса 10,
Механизмы клеточной гибели 11
Цитолитические процессы 13
Понятие пролиферативного процесса 14
Регуляция пролиферативных процессов в многоклеточном организме 75
Механизмы рецепторной передачи сигнала, 17
Белки, регулирующие пролиферацию 18
Факторы роста 18
Цитокины 20
Гены, регулирующие пролиферативные и цитолитические процессы 21
Действие "классических" регуляторных пептидов на трансформированные клетки 24
Опиоидные пептиды : .' 25
Бомбезин и бомбезинподобные пептиды 27
Соматостатин и его аналоги 29
Вазоактивный интестинальный пептид и его аналоги 31
Лигандыгастрин/холецистокининовых рецепторов 33
Нейротензин и его аналоги 34
Веществор 36
Кальцитонин 37
Лютеинизин высвобождающий гормон (lh-rh) и его аналоги 37
Гонадотропин-высвобождающий гормон (gh-rh) 38
Вазопрессин 39
Заключение 40
Фрагменты протеолитической деградации функциональных белков 40
Происхождение фрагментов функциональных белков 40
Фрагменты протеолитической деградации функциональных белков, выделенные из экстрактов тканей животных 41
Фрагменты функциональных белков, секретируемые клетками in vitro 42
Фрагменты, образующееся в результате протеолитической обработки различных белков и тканей in Vitro 42
Синтетические фрагменты функциональных белков 43
Биологическая активность фрагментов функциональных белков 44
Механизмы действия фрагментов функциональных белков 46
Рецепторные мишени фрагментов протеолитической деградации фугікциогіальньгх белков 46
Действие фрагментов функциональных белков на ионные каналы , 47
Действие фрагментов функциональных белков на систему внутриклеточной передачи сигнала 48
Действие фрагментов протеолитической деградации функциональных белков на культуры трансформированных и нормальных клеток 48
Эффекты фрагментов протеолитической деградации функциональных белков на культурах нормальных клеток 48
Эффекты фрагментов протеолитической деградации функциональных белков на культурах трансформированных клеток 50
Заключение 51
Результаты и обсуждение 52
Протеолиз гемоглобина in vivo 53
Внутриэритроцитарный протеолиз гемоглобина 53
Фрагменты гемоглобина, секретируемые эритроцитами 54
Протеолиз гемоглобина в тканях 55
Заключение 55
Первичная оценка биологической активности фрагментов гемоглобина, присутствующих в различных тканях млекопитающих . 59
Биологическая активность вргутриэритроцитарных пептидов 62
Биологическая активность фрагментов гемоглобина, экскретируемых эритроцитами 65
Биологическая активность фрагментов гемоглобина, представленных в экстрактах тканей млекопитающих 66
Заключение 70
Эффекты пептидов стимулирующих пролиферацию трансформированных клеток 71
Стимуляция пролиферации трансформированных клеток в присутствии факторов роста 71
Восстановление пролиферации клеток костного мозга после обработки цитостатическим препаратом 72
Исследование антипролиферативньгх эффектов пептидов семейства геморфинов 75
Цитотоксическая активность геморфинов в культуре трансформированных клеток 75
Изучение цитолитического и антипролиферативного действия уу*-геморфина-5 методом проточной цитофлюориметрии 80
Сравнение противоопухолевой активности \л/-геморфина-5, с эффектами селективных лигандов опиатных рецепторов 83
Изучение пролонгированного онколитического действия уу-геморфина-5 84
Изучение суммарной онколитической активности уу-геморфина-5 при неоднократном добавлении препарата 86
Противоопухолевая активность w-геморфина-5 в панели трансформированных клеток 87
Биологическая активность геморфинов в первичной культуре нормальных клеток 89
Заключение 91
Материалы и методы 97
Используемые линии клеток 97
Культивирование клеток 98
Исследуемые вещества 99
Общая характеристика исследуемых веществ 99
Концентрации исследуемых веществ 700
Приготовление раствора исследуемого вещества 700
Растворы исследуемых пептидов (фрагменты гемоглобина, met-энкефалин и tnf (фактор некроза опухолей)).. 100
Расгторзтафубицщіаинейротокстаїап^'іадакобримаіаїлазаохіапа) \00
Определение цитолитической активности 100
Определение цитолитической активности в отношении клеток линии к562 700
Определение цитолитической активности в культуре трансформированных клеток l929 707
Определение изменения количества клеток 101
Определение изменения количества клеток визуально под микроскопом 707
Определение количества клеток при окрашивании мтт 702
Определение количества клеток при окрашивании сульфородамином б. 102
Клоногенный тест 103
Определение активности фрагментов гемоглобина в культурах нормальных клеток 104
Выделение клеток селезенки и костного мозга мыши 104
Определение аюпивности фрагментов гемоглобина в перелсиеающей культуре клеток костного мозга
Мыши 104
Определение активности фрагментов гемоглобина в перелсиеающей культуре клеток костного мозга
Мыши 105
Определение активности фрагментов гемоглобина в перелсиеающей культуре сплепоцитов мыши... 105
Определение фрагментации днк 106
Определение количества клеток и анализ днк с помощью проточного флуориметра 107
Определение количества клеток. 707
Определение содержания днк. 70s
Статистическая обработка результатов 108
Выводы 109
Список литературы
- Механизмы клеточной гибели
- Вазоактивный интестинальный пептид и его аналоги
- Фрагменты, образующееся в результате протеолитической обработки различных белков и тканей in Vitro
- Эффекты фрагментов протеолитической деградации функциональных белков на культурах трансформированных клеток
Введение к работе
Биологически активные пептиды принимают значимое участие в регуляции функционирования живых организмов, опосредуя передачу сигнала в целом ряде биологических систем - нервной, гормональной, иммунной и т. д. В настоящее время из различных природных источников выделено около 10000 пептидных молекул, обладающих биологической активностью самой различной направленности и еще большее количество пептидных и пептидомиметических аналогов синтезировано во многих лабораториях.
Все исходные эндогенные биологически активные пептиды условно можно разделить на две основные группы.
К первой группе могут быть отнесены пептиды, образующиеся в результате специфического протеолиза (процессинга) белковых молекул-предшественников, для которых не показано собственной биологической активности, в высокоспециализированных клетках. Эти пептиды в дальнейшем секретируются из клеток в околоклеточное пространство (парагомональная регуляция) или непосредственно в кровоток (классические гормоны) или в синаптическую щель (нейротрансмиттеры). Все они имеют специфические рецепторы и обладают высоким регуляторным потенциалом (как наиболее изученные примеры можно назвать опиоиды, нейромедины, кинины и т.д.) [1]. Биологическая активность пептидов, относящихся к первой группе, может реализовываться как гормональная, парагормональная, иммуно- и нейрорегуляторная. Содержание таких пептидов в ткани, как правило, невелико и редко превышает 1-10 пикомоль/г [2]. Этих веществ, которые можно обозначить как "классические" регуляторные пептиды [2-7], идентифицировано несколько тысяч в самых разных биологических источниках. Большинство этих веществ достаточно хорошо изучены. Для них прежде всего характерно наличие широкого спектра различных проявлений биологической активности (полифункциональность) в различных тестах как in vivo, так и in vitro. Тем не менее во многих случаях остаются вопросы о соотношении эндогенных функций "классических" регуляторных пептидов и свойств, проявляемых этими веществами в произвольно выбранных тестах.
Ко второй группе можно отнести пептиды, образующиеся в результате протеолитической деградации функциональных белковых молекул, т.е. белков, обладающих собственной функцией, например, ферментативной (цитохром-с-оксидаза), защитной (иммуноглобулины), транспортной (гемоглобин). Содержание пептидов, относящихся к этой группе, может составлять до 10 нмоль/г ткани [8-Ю]. К настоящему времени идентифицировано более 600 подобных эндогенных пептидных биорегуляторов. Для целого ряда таких веществ было показано наличие биологической активности в различных тестах, однако, полный спектр активности подавляющего большинства подобных соединений остается неизвестным.
Основной проблемой при первичном изучении биологической активности эндогенных соединений является полифункциональность действия этих веществ. Большинство известных пептидных гормонов проявляют значимо отличные от контрольного уровня эффекты в большинстве стандартных тестов, используемых при рутинных исследованиях как in vivo, так и in vitro. Тем не менее достаточно трудно предположить, что одно из основных функций гормонов гипофиза (окситоцина и вазопрессина) является сокращение мышечных стенок матки или гладкомышечного препарата кишечника. С другой стороны, при неадекватном выборе системы тестирования можно даже для высокоэффективных пептидов не детектировать никакого эффекта.
Нам представляется, что наиболее перспективной системой первичной оценки биологической активности является оценка их действия непосредственно на клетки. В том случае, если биологически активные вещества вызывают какие-либо (т.е. любые) изменения в клетках при совместной инкубации, эти эффекты должны отражаться на общем состоянии клеточной культуры. Серьезным возражением может служить довод о различном содержании специфических рецепторных молекул на поверхности клеток различного типа в зависимости от их функции. Можно допустить, что некоторые типы рецепторов пептидных лигандов попросту отсутствуют у данных клеток. Не отрицая обоснованности этого аргумента мы считаем, что наилучшим выходом может стать использование для первичной оценки биологической активности пептидных соединений культур трансформированных клеток in vitro.
Механизмы клеточной гибели
В процессе развития и дальнейшего функционирования организма высших животных происходит как образование новых клеток, с последующей дифференцировкой, так и гибель уже закончивших свой жизненный цикл или неспособных к нормальному функционированию клеток. Элиминирование нежизнеспособных клеток, связанное как с необратимым повреждением клеточной мембраны, так и с необратимой фрагментацией генного материала, представляет собой процесс, называемый цитолитическим или цитолизом [17].
Процессы цитолиза наиболее характерны для эмбрионального этапа развития, где в ходе дифференцировки и органообразования элиминируется большая часть клеток. В постнатальном периоде лизис клеток происходит как в норме, так и при патологии [18-20].
В норме лизируются в основном клетки не способные к нормальному функционированию, в частности, клетки иммунной системы не прошедшие дифференцировку [18-20]. При патологиях различной природы также происходит гибель клеток, прямо или опосредованно связанная как с защитными функциями организма (лизис опухолевых клеток, клеток, пораженных вирусами, спонтанный лизис при остром воспалении и т.д.) так и с соматическими нарушениями (ряд хронических воспалительных заболеваний, аутоимунные и тканедегенеративные заболевания). В последнем случае такие процессы приводят к радикальному нарушению функционирования ткани как, например, при болезни Альцгеймера.
Начало и дальнейшее развитие эндогенного цитолитического процесса, в отличие от искусственных моделей клеточной гибели, связанных с непосредственным повреждением мембраны (осмотический шок, воздействие детергентов) или необратимым ингибированием ферментативных систем клетки (цитостатики) опосредованы специфическим воздействием сигнальных молекул.
Ранее цитолитичекие свойства предполагались лишь для белков иммунной системы [12-13, 21-23], однако, на сегодняшний день установлено, что широкий спектр белков и пептидов, самого различного спектра действия обладают способностью специфически индуцировать гибель как нормальных, так и трансформированных клеток.
Это дает возможность предполагать, наличие множества механизмов регуляции количества клеток в организме.
Механизмы клеточной гибели
В настоящее время выделяют два основных механизма специфической гибели клетки: некроз и апоптоз [17].
Апоптотический механизм гибели играет основную роль в процессе эмбриогенеза и является наиболее распространенным механизмом регуляции количества клеток в организме. Элиминирование трансформированных клеток и гибель клеток при тканедегенеративных заболеваниях в большинстве случаев также подразумевает этот механизм [18-20] [19,24].
Основными морфологическими особенностями апоптоза являются конденсация цитоплазмы и хроматина на ранних стадиях процесса и образование апоптотических тел на более поздних стадиях [17]. Отличительным признаком апоптотической гибели в настоящее время принято считать наличие специфического расщепления геномной ДНК на нуклеосомальные фрагменты, кратные 180-200 пар оснований (Ьр) [15,17]. Причем необратимые изменения проницаемости цитоплазматической мембраны, характеризующие гибель клеток, отстают по времени от процесса специфической фрагментации ДНК и появления морфологических признаков апоптоза.
Процессы, характеризующиеся фрагментацией ДНК на крупные (более 50 kbp) фрагменты, при отсутствии дальнейшего специфического расщепления геномного аппарата, в настоящее время также относят к апоптотическому типу гибели [24].
Апоптотические процессы, несмотря на их различия имеют ряд общих стадий, включающих изменение мембранного потенциала митохондрий, высвобождение цитохрома с и апоптоз-индуцирующего фактора, видимо действующего на ранних стадиях процесса. Высвобождение этих факторов приводит к каскадной активации семейства цистеиновых протеиназ, каспаз, осуществляющих расщепление белков после остатка аспарагиновой кислоты. В настоящее время известно более десятка ферментов этой группы, отличающихся субстратной специфичностью и в норме отвечающих за процессинг белков. При апоптозе каспазы осуществляют деградацию набора регуляторных клеточных белков, что служит сигналом к фрагментации генома [25]. Так как апоптоз -процесс, который может быть индуцирован в результате воздействия на самые различные как рецепторные так и внутриклеточные процессы, механизмы его развития, при сохранении общих свойств, описанных выше, значительно различаются в деталях.
Считается, что механизм гибели клетки - некротический или апоптотический -зависит от уровня АТФ. Апоптотический сигнал передается из цитоплазмы в ядро путем активного транспорта, для которого необходим гидролиз АТФ. Было показано, что снижение нормального уровня АТФ в клетке приводит к ингибированию апоптоза. Как оказалось, АТФ-зависимыми событиями апоптоза является активация каспазы 3, обеспечивающей передачу апоптотического сигнала в ядро клетки. При нехватке АТФ не активируется каспаза 3 и апоптоза не происходит [25].
Вазоактивный интестинальный пептид и его аналоги
Вазоактивный интестинальный пептид (VTP) - нейропептид, состоящий из 28 аминокислотных остатков, впервые был выделен из желудочно-кишечного тракта свиньи [123]. Рецепторы к этому пептиду широко представлены в центральной и периферической нервной системе, включая нейроны, иннервирующие гастроинтестинальный тракт. Было показано, что VBP вовлечен в регуляцию некоторых гастроинтестинальных функций, таких как вазодилятация, секреция и мышечная релаксация.
Действие VTP как нейротрансмиттера и нейромодулятора обусловлено рецепторным взаимодействием, с последующей активацией аденилатциклазы и протеинкиназы А [124]. Существует два подтипа рецепторов вазоактивного интестинального пептида: VTPi и VIP2. VTP і -рецепторы представлены в основном на нейронах коры головного мозга и в гипокампе, a VTP2 - в областях мозга, связанных с нейроэндокринной функцией [125].
Рецепторы к вазоактивному интестинальному пептиду широко представлены на многих опухолях, таких как нейробластомы [124-128], феохромоцитомы, мелко-клеточные и не мелко-клеточные опухоли легкого [132-135], карциномы молочной железы, яичников, эндометрия, раки простаты, гастроинтестинальные опухоли [132-135] и аденокарциномы толстого кишечника [136-139].
Было показано, что VTP выполняет роль фактора роста при развитии нервной ткани, но пока неизвестно является ли данное действие эффектом самого пептида или связано с VIP-индуцированным высвобождением других факторов роста, таких как эпидермальный фактор роста и фактор роста нервов [128]. Существует предположение о действии данного пептида как регулятора пролиферации нервных клеток, основанное на его способности индуцировать дифференцировку и ингибировать пролиферацию опухолевых нейробластов [126], кроме того, было показано, что данные клетки секретируют VTP и экспрессируют рецепторы к нему. Так из 15 протестированных клеточных линий нейробластом -12 экспрессируют рецептор к \ТР [126]. Действие экзогенного вазоактивного интестинального пептида на клеточные линии IMR32, SKNSH, LA-N-5 и NMB приводит к уменьшению скорости клеточного роста [124], индуцируя в клетках линий IMR32, LA-N-5 и SKNSH дифференцировку [126]. При действии на клетки линии SKNSH, кроме описанных эффектов, VIP индуцирует апоптоз [140]. Было показано, что VIP замедляет пролиферацию клеток тем сильнее, чем медленнее он расщепляется клеточными протеиназами, а индукция дифференцировки коррелирует с увеличением числа экспресированных рецепторов. Основываясь на рассмотренных данных можно предположить, что VTP является аутокринным фактором роста нормальной нервной ткани и нейробластом. При этом, увеличение экспрессии или амплификации генов клеточных протеиназ при трансформации приводит к быстрому гидролизу VTP.
Было показано, что VTP ингибирует пролиферацию T98G клеток (глиобластома человека), экспрессирующих УГР2-рецептор, ингибируя синтез ДНК [125]. Подобным эффектом обладает полипептид активирующий аденилатциклазу (РАСАР), взаимодействуя с УГР2-рецептором [125].
Экспрессия рецепторов к VTP характерна для некоторых гастроинтестинальных опухолей [132]. Активация данных рецепторов приводит к повышению уровня цАМФ и ингибированию деления клеток. Так, при взаимодействии пептида с AGS клеточной линией (рак желудка человека) происходит ингибирование пролиферации, с одновременным уменьшением уровня экспрессии с-мус протоонкогена, участвующего в регуляции пролиферации и дифференцировки [132]. Действие на раковые клетки кишечника (НСТ 116, GEO, НТ29) связано с ингибированием клеточного роста и индукцией дифференцировки [136,137]. Подобными эффектами на трансформированные клетки гастроинтестинального тракта обладает 8-бромо-цАМФ и дибитурил-цАМФ (dbcAMP) [136,137]. Кроме ингибирования роста гастроинтестинальных опухолей, VIP стимулирует цитотоксичность мононуклеарных клеток крови против клеток рака толстого кишечника человека (СаСо-2) [139].
Однако, VTP не всегда обладает однонаправленным действием и может индуцировать пролиферацию, как это было показано при тестировании опухолевых клеток печени, поджелудочной железы и немелко-клеточного рака легких человека[141-144].
Неодинаково действие VTP на различные линии лимфобластоидных клеток. При действии на лимфобластоидные В-клеточные линии (GM-1056) VTP индуцирует пролиферацию и продукцию иммуноглобулинов [145]. В то время как взаимодействие пептида с Т-клеточными лимфобластоидными культурами (Molt-4) приводит к ингибированию их пролиферации [112].
На основании вышеизложенных данных, можно заключить, что VTP и его аналоги принимают активное участие в регуляции пролиферации и дифференцировки нормальных и трансформированных клеток, являясь аутокринными факторами роста для некоторых видов опухолей.
Лиганды гастрин/холецистокининовых рецепторов Гастрин, холецистокинин (ССК) и холецистокинин-высвобождающие пептиды, относятся к семейству гормонов, характеризующемуся общей С-концевой пентапептидной последовательностью, обусловливающей взаимодействие пептида с гастрин/холецистокининовыми рецепторами.
Гастрин и ССК взаимодействуют с двумя типами рецепторов ССК А и ССКв [146]. Причем ССКв-рецептор, распространенный в основном в центральной нервной системе и гастроинтестинальном тракте имеет примерно одинаковое сродство к гастрину и холецистокинину, в то время как ССКА рецептор в 500 раз эффективнее связывает ССК чем гастрин [147].
В норме, гастрин выполняет трофическую функцию в отношении слизистой оболочки желудочно-кишечного тракта, стимулирует желудочную секрецию. Известно также, что гастрин является аутокринным фактором роста для многих опухолей желудочно-кишечного тракта (раков желудка, поджелудочной железы и толстого кишечника) [148-157], секретирующих данный пептид и экспрессирующих рецепторы к нему. Для холецистокинина и его аналогов также характерна стимуляция пролиферации многих других трансформированных клеток [146,147,158-160]. Данные эффекты пептидов связаны с увеличением концентрации внутриклеточного кальция, который, вероятно, выполняет роль вторичного мессенжера при передачи пролиферативного сигнала. Увеличение внутриклеточной концентрации кальция является результатом активации фосфолипазы С и запуском инозитолфосфатного цикла.
Кроме желудочно-кишечного тракта рецепторы к гастрину и холецистокинину представлены на многих опухолях, включая опухоли нервной системы (астроцитомы, нейробластомы) [159,160], легких (мелкоклеточные раки легкого) [147] и опухоли системы крови (лейкемии, лимфобластомы). Для всех пептидов, данного семейства, показана способность индуцировать рост опухолей, экспрессирующих гастрин/холецистокининовые рецепторы, за исключением нескольких астроцитарных опухолевых линий (U373, T98G), рост которых ингибируется гастрином [146].
Фрагменты, образующееся в результате протеолитической обработки различных белков и тканей in Vitro
Протеолитическая деградация функциональных белков, приводящая к образованию биологически активных пептидов является источником регуляторных молекул, значительно отличающихся от "классических" регуляторных пептидов.
Происхождение фрагментов функциональных белков Очевидно, что процесс протеолитической деградации функциональных белков происходит в организме под действием ферментов, в результате чего образуется определенный набор пептидных продуктов. В настоящее время, существует несколько подходов к изучению процесса протеолиза функциональных белков и образующихся в результате данного процесса пептидных фрагментов [289].
Фрагменты протеолитической деградации функциональных белков, выделенные из экстрактов тканей животных Скрининговые исследования состава низкомолекулярных фракций экстрактов различных тканей (головного и костного мозга крупного рогатого скота [8], эритроцитов [229,230] и мозжечка человека [231,232]) показали, что основная масса пептидов в анализируемом биологическом материале представлены фрагментами функциональных белков. Были проведены исследования количественного состава пептидных фракций биологических экстрактов, установление первичной структуры составляющих их компонентов, а также границ изменчивости набора пептидов. Исследованные пептиды были получены из различных источников: уксуснокислых экстрактов головного и красного костного мозга крупного рогатого скота, головного мозга суслика и крысы, лизата эритроцитов, спинномозговой жидкости человека и плазмы крови крысы и человека [7-10, 229-232].
В результате проведенных работ по определению количественного состава эндогенных компонентов экстрактов различных тканей было показано присутствие сравнительно небольшого количества веществ пептидной природы во всех исследованных образцах. Набор пептидных компонентов составляет от нескольких десятков до 200-400 различных веществ, в зависимости от исследуемой ткани [8].
Ограниченное количество веществ пептидной природы в биологических экстрактах может свидетельствовать о специфичности протеолиза функциональных белков.
С целью определения состава компонентов низкомолекулярных фракций биологических экстрактов был проведен скрининг составляющего их пептидного материала [8,230,233,234]. На основании установленных структур большинства пептидов, содержащихся в экстракте мозга крупного рогатого скота, был сделан вывод о том, что основная масса пептидных компонентов является фрагментами функциональных белков. Причем число предшественников тканевых пептидов ограничено, к ним относятся гемоглобин, основной белок миелина, фибронектин, сывороточный альбумин, у-глобулины, клеточные ферменты или неизвестные к настоящему времени предшественники. Основную часть пептидных компонентов ткани составляют фрагменты гемоглобина. Некоторые из них присутствуют в количестве 50-80 нмоль/гр. ткани.
Фрагменты функциональных белков, секретируемые клетками in vitro
Наличие внутриклеточного протеолиза функциональных белков in vitro свидетельствует, с большой долей вероятности, о том, что подобные процессы протекают in vivo.
В результате специальных исследований, in vitro, было выявлено, что протеолиз некоторых функциональных белков может протекать внутри клетки. Так, например, при действии на сывороточный амилоидный аполипопротеин (hSAA) лизосомальных ферментов полиморфноядерных лимфоцитов человека образуются пептиды, чья аминокислотная последовательность соответствует (28-36) и (99-104)-фрагментам этого белка [224]. Некоторые клетки в культуре in vitro секретируют биологически активные пептидные фрагменты функциональных белков. Так при добавлении в культуральную среду с макрофагами гемоглобина в супернатанте было зафиксировано присутствие опиоидного фрагмента гемоглобина - УУ-геморфина-7 [225]. Клетки карциномы простаты человека при добавлении к ним плазминогена секретируют ангиостатин [226]. Известно, что некоторые опухолевые клетки секретируют фрагменты нейротензина [227], тучные клетки - альбутензины [228].
Исходя из перечисленных данных можно предположить, что образование пептидных фрагментов функциональных белков на тканевом уровне in vivo происходит в клетках богатых протеолитическими ферментами, таких как иммунные или трансформированные. Фрагменты, образующееся в результате протеолитической обработки различных белков и тканей in vitro Как уже упоминалось, экзогенными являются пептиды полученные в результате процесса протеолиза функциональных белков in vitro. Под процессом протеолиза in vitro понимают процесс, при котором на определенный белок действуют каким-либо определенным ферментом (или ферментами), с последующим изучением образовавшихся пептидов. Впервые подобного рода исследование было проведено в 1941 году, когда было показано, что при пепсиновом гидролизе белков плазмы образуются вещества, обладающие способностью индуцировать выброс гистамина из тучных клеток [196]. В 1979 году Brantl et. al. показали, что при протеолитической обработке (З-казеина образуется группа пептидов, названных Р-казоморфинами, обладающих опиоидоподобной активностью [197]. Впоследствии Brantl et. al провели серию подобных работ, подвергнув протеолитической обработке in vitro гемоглобин и цитохром, и также как и в случае с (3-казеином, получили биологически активные пептиды [198]. В настоящее время идентифицированно около 300 подобных пептидов. Они представленны фрагментами таких белков как гемоглобин [198-201], казеины[202,203], основной белок миелина [204,205], глютен [206,207], сывороточный альбумин [208,209], лактоферин [210-213] и др. Для большинства из них показано наличие биологической активности в тестах in vivo и in vitro.
При протеолитической обработке биологических тканей in vitro, исследователем выбирается фермент или группа ферментов и исследуется их действие на определенные ткани - это дает возможность изучить мишени на которые в данной ткани действует этот фермент. К настоящему времени такое моделирование проведено на тканях желудочно-кишечного тракта, плазме и цельной крови млекопитающих. Определение первичной структуры некоторых из выделенных пептидов указывает на происхождение их из функциональных белков.
Так, обработка плазмы крови трипсином приводит к образованию коротких пептидов - фрагментов альбумина, обладающих брадикинин- и кинин-потенциирующим действием [208,214,215]. Обработка пепсином препаратов кишечника и плазмы крови млекопитающих приводит к образованию нейротензинподобного и энкефалинподообного иммунореактивного материала пептидной природы [216-219]. Пептиды, обладающие опиоидоподобными свойствами, - фрагменты гемоглобина, альбумина и цитохрома b -были выделены из катепсин-пепсиновых и пепсиновых препаратов компонентов цельной крови млекопитающих [9,216,220].
Эффекты фрагментов протеолитической деградации функциональных белков на культурах трансформированных клеток
Достоверность полученных результатов оценивалась по t-критерию Стьюдента, а воспроизводимость с помощью коэффициента вариации (CV) представляющее собой процентное отношение стандартного отклонения к среднему значению активности.
Биологическая активность внутриэритроцитарных пептидов Анализ пептидных компонентов лизата эритроцитов человека показал, что внутри красных клеток крови присутствуют преимущественно длинные (более 20 аминокислотных остатков) фрагменты гемоглобина. Таким образом, можно предположить, что первичные стадии протеолиза гемоглобина протекают непосредственно в эритроцитах.
Задачей этой части исследования было изучение влияния наиболее представленных в эритролизате фрагментов гемоглобина на пролиферацию трансформированных клеток L929 in vitro. В рамках исследования была определена активность 39 наиболее представленньгх фрагментов гемоглобина (табл. 2).
Как следует из Таблицы 3, 9 из 14 проанализированных пептидов обладают статистически значимой пролиферативной активностью в культуре трансформированных клеток. Наличие эффекта соответствует структурным группам пептидов, образующихся в результате первичной стадии протеолиза а-глобина по аминокислотным остаткам Leu33-Leu34 и Leu -Leu106. Образующиеся в результате строго специфичного расщепления по этим сайтам вещества а-глобин-(І-ЗЗ) и а-глобин-(106-141) подвергаются дальнейшей деградации с N- и С- концевых аминокислотных остатков образуя «лесенку» характерную для большинства эндогенных фрагментов функциональных белков. В дальнейшем представляется логичным разделить биологические эффекты пептидов соответствующих сегментам а-глобина-(І-ЗЗ) и а-глобина-(106-141) и Р-глобина-(1-45).
В результате исследования этой группы пептидов установлено, что 4 из пяти пептидов образующихся из фрагмента а-глобина-(І-ЗЗ) обладают активностью в культуре трансформированных клеток. Пептиды а-глобин-(І-ЗІ), а-глобин-(1-32) и а-глобин-(2-32) стимулируют пролиферацию опухолевых клеток (на 30% и более) при высоких действующих концентрациях (КУМО М) и незначительно подавляют пролиферацию при низких (10"9-10-10М). При этом величина биологического эффекта напрямую зависит от аминокислотной последовательности и отщепление одного аминокислотного остатка, может привести как к снижению активности, так и к полному ее исчезновению. Так пептид ос-глобин-(І-ЗЗ), наиболее представленный в эритроцитах, незначительно уменьшает количество живых клеток, последующая деградация этого пептида с С- и N-концов приводит к образованию фрагментов стимулирующих пролиферацию опухолевых клеток (а-глобин-(І-ЗІ), а-глобин-(1-32) и а-глобин-(2-32)), в то время как пептид а-глобин-(1-29) полностью не активен.
Самый длинный пептид а-глобин-(1-49??), очевидно, соответствующий участкам первичного щеплення гемоглобина, аналогично большинству исследованных веществ также не активен. Из полученных результатов следует, что величина и направленность действия пептидов в культуре трансформированных клеток напрямую зависит от их структуры и действующей концентрации.
В рамках данного исследования изучались структурно-функциональные взаимоотношения в группе внутриэритроцитарных фрагментов перекрывающих С-концевой сегмент (106-141) а-глобина. Исследование биологической активности пептидов в отношении трансформированных клеток проводили по схеме, описанной выше.
Максимальный эффект (40-50%) проявили самый длинный (а-глобин-(106-141)) и самый короткий (а-глобин-(110-141)) пептиды этого семейства. При этом последовательное укорочение пептида а-глобина-(10б-141) приводит сначала к значительному снижению стимуляции пролиферации (более чем в два раза), а затем к увеличению активности до 55% в случае а-глобина-(110-141), проявившего максимальную активность. Таким образом, также как и в случае групп пептидов, описанных ранее, выраженность эффекта напрямую зависит от наличия или отсутствия концевых аминокислотных остатков. Аналогично пептидам из а-глобина-(І-ЗЗ), пролиферативная активность пептидов детектировалась исключительно в бессывороточной среде.
Аналогично длинным С-концевым фрагментам а-глобина, два коротких пептида, детектируемых в лизате эритроцитов, неокиоторфин (а-глобин-( 137-141)) и его укороченный фрагмент а-глобин-(137-140), обладают пролиферативным эффектом, хотя и менее выраженным, чем у наиболее активных представителей семейства С-концевых фрагментов ос-цепи.
Исследование биологической активности N-концевых фрагментов 3-глобина в культуре трансформированных клеток проводили по схеме, описанной выше. Как следует из табл. 3, оба пептида, в отличие от большинства фрагментов а-цепи, практически не влияют на пролиферацию клеток.
Проведенное исследование биологической активности внутриэритроцитарных пептидов показало, во-первых, что большая часть из них активна в культурах клеток, и во-вторых, что все, за исключением одного пептида, а-глобина-(І-ЗЗ), стимулируют пролиферацию трансформированных клеток в бессывороточной среде, т.е., обладают однонаправленным эффектом. Наиболее длинные внутриэритроцитарные пептиды, такие как а-глобин-(1-49), (3-глобин-(1-45) и 3-глобин-(1-41) практически не активны, в то время как пептиды, образующиеся из а-глобина-(І-ЗЗ) и а-глобина-(106-141) проявили высокий пролиферативный потенциал. Таким образом, наличие биологической активности напрямую коррелирует с первичной деградацией по связям а-глобина Leu -Leu 4 и Leu -Leu106, а величина эффекта регулируется за счет отщепления концевых аминокислотных остатков.
