Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Введение 5
1.1. Актуальность проблемы 5
1.2. Цели и задачи исследования 8
1.3. Основные положения, выносимые на защиту 8
1.4. Научная новизна 9
1.5. Теоретическое и практическое значение работы 10
1.6. Финансовая поддержка 10
1.7. Публикации 10
1.8. Апробация работы 10
1.9. Объем и структура диссертации 11
ГЛАВА 2. Обзор литературы 12
2.1. Убиквитин-протеасомный путь деградации белков 12
2.1.1. Протеасомы 12
2.1.2. Ферментативные активности протеасом 27
2.1.3. Убиквитин-зависимый протеолиз 31
2.1.4. Участие протеасом в важнейших клеточных процессах 36
2.1.5. Ингибиторы протеасом 42
2.2. Молекулярные механизмы регуляции апоптоза 47
2.3. Вовлечение убиквитин-протеасомного пути в апоптоз 50
2.3.1. Протеасомные ингибиторы как индукторы апоптоза 53
2.3.2. Ингибиторы протеасом могут также ингибировать апоптоз 57
2.3.3. Ингибиторы протеасом в терапии рака 59
ГЛАВА 3. Материалы и методы 64
3.1. Культивирование клеток 64
3.2. Анализ фрагментации клеточной ДНК 64
3.3. Флуоресцентная окраска хроматина 65
3.4. Выделение препаратов цитоплазматических РНК 65
3.5. Выделение препаратов ядерных и цитоплазматических протеасом 66
3.6. Флуориметрическое измерение протеолитической активности протеасом 67
3.7. Электрофорез РНК в нативных условиях 68
3.8. Электрофорез РНК в денатурирующих условиях 68
3.9. Обработка протеасом щелочной фосфатазой кишечника теленка (CIAP) 69
ЗЛО. Обработка РНК с помощью протеасом 69
3.11. Транскрипция in vitro 69
3.12. Анализ содержания субъединиц протеасом и их статуса фосфорилироваиия методом вестерн-блотинг 70
3.13. Диск-электрофорез белков по Лэммли 71
3.14. Двумерный электрофорез белков 71
3.15. Л/атсриалы 72
ГЛАВА 4. Результаты 73
4.1. Диэтилмалеат и доксорубицин вызывают апоптоз в клетках К562 73
4.2. Воздействие на клетки К562 индукторов апоптоза вызывает изменения в субъединичном составе цитоплазматических протеасом 76
4.3. Популяция протеасом в клетке гетерогенна 78
4.4. После индукции апоптоза в клетках К562 субъединицы протеасом модифицируются 80
4.4.1. Цитоплазматические протеасомы 80
4.4.2. Ядерные протеасомы 83
4.5. При индукции апоптоза в клетках К562 измененяются ферментативные активности протеасом 83
4.5.1. Воздействие на клетки К562 индукторов апоптоза изменяет специфичность протеолитической активности протеасом 88
4.5.2. При индукции апоптоза в клетках К562 изменяется специфичность эндорибонуклеазной активности протеасом 90
4.6. После индукции апоптоза в клетках К562 наблюдается модифицирование
субъединиц протеасом, ответственных за ферментативные активности протеасом:
а5, аб и р2 95
4.7. При индукции апоптоза в клетках К562 изменяется статус фосфорилироваиия протеасом 97
4.8. Дефосфорилирование субъединиц протеасом специфическим образом изменяет ферментативные активности протеасом, выделенных из клеток К562 100
4.8.1. Протеолитическая активность протеасом 101
4.8.2. Механизм регуляции протеолитической активности протеасом при индукции апоптоза связан с фосфорилированием (дефосфорилированием) протеасом 101
4.8.2. Эндорибонуклеазная активность протеасом 103
ГЛАВА 5. Обсуждение 106
5.1. Изменения субъединичного состава протеасом при апоптозе в клетках К562108
5.2. Изменения ферментативных активностей протеасом при апоптозе в клетках К562 ПО
5.3. Изменение статуса фосфорилирование протеасом при апоптозе в клетках К562 112
5.4. Неспецифическое дефосфорилирование белковых субъединиц протеасом изменяет специфичность их ферментативных активностей 114
Выводы 116
Список сокращений
- Основные положения, выносимые на защиту
- Ферментативные активности протеасом
- Флуоресцентная окраска хроматина
- Воздействие на клетки К562 индукторов апоптоза вызывает изменения в субъединичном составе цитоплазматических протеасом
Введение к работе
Апоптоз, или программированная клеточная гибель, является важнейшим механизмом контроля над качеством и численностью клеточной популяции в многоклеточном организме. Он обеспечивает равновесие в пролиферации клеток, элиминации поврежденных (например, радиацией), пораженных вирусом и неопластических клеток, а также селекцию лимфоцитов, при которой удаляются аутоиммунные клоны. Неспособность клеток претерпевать апоптоз - это один из ключевых моментов в опухолеобразовании. Молекулярные механизмы, задействованные в этом процессе, до сих пор окончательно не исследованы.
Апоптоз представляет собой сложно регулируемый клеточный процесс, который принято подразделять на две стадии: запуск и выполнение программы (Earnshaw, 1995). Известно, что запуск программы, приводящей к смерти клетки, может осуществляться как специфическими сигналами (например, цитокинами или гормонами), так и неспецифическими, такими как радиация, повышение температуры или действие окислителей (например, проокислитель - глутатион-истощающий агент диэтилмалеат (ДЭМ)).
Стадия выполнения инициируется активацией каспаз (семейство цитоплазматических цистеиновых протеаз), которые деградируют специфические клеточные белки, такие как поли-(АДФ-рибоза)-полимераза (PARP (Martin, Green, 1995). Это приводит к серии определенных метаболических изменений, характерных для апоптоза (в том числе, ядерной фрагментации, образование апоптотических телец).
В настоящее время широко изучается участие в апоптозе протеасом. При использовании ингибиторов протеасом обнаружили как про-апоптозное, так и анти-апоптозное функционирование протеасом в клетке (Grimm et al., 1996; Lopes et al., 1997; Don et al., 1999; Wojcik, DeMartino, 2003; Yang et al., 2006). Такие противоположные роли протеасом в регуляции апоптоза, по-видимому, обусловлены пролиферативным статусом клетки (Naujokat, Hoffmann, 2002; Wojcik, DeMartino, 2003; Chen, Lin, 2004; Sohn et al., 2006; Vinketal.,2006).
Для осуществления разнообразных функций в клетке протеасомы должны быть подвержены строгому регуляторному контролю. Фосфорилирование регуляторных белков (например, киназ) является ключевым моментом в передаче сигнала, продвижении клетки по клеточному циклу и в апоптозе (Bandyopadhyay et al., 2004; Sabatini et al., 2004; Contri et al, 2005; Jin et al., 2005; Wang et al., 2005; Ptacek, Snyder, 2006). Фосфорилирование субстратов и ферментов также играет важную роль в убиквитин-протеасомном пути (Glickman, Ciechanover, 2002; Wojcik, DeMartino, 2003). Известно также, что 26S протеасомы посттрансляционно модифицируются в различных случаях как фосфорилированием (Bose et al., 1999, 2004; Fernandez Murray et al., 2002; Iwafune et al., 2002), так и N-ацетилированием (Arendt, Hochstrasser. 1999; Kimura et al., 2000; Tokunaga et al., 1990; Claverol et al., 2002), гликозилированием (Schmid et al., 1993, Zachara, Hart, 2004; Sumegi et al., 2003) и 4-гидрокси-2-ноненил-алкилированием (Farout et al., 2006). Обнаружены сайты потенциального фосфорилирования на субъединицах 20S протеасомы и 19S регуляторных комплексов, и исходя из этого, выдвинуто предположение о возможном контроле протеолитической активности протеасом посредством фосфорилирования (Bose et al., 1999; Fernandez Murray et al., 2002). Так, например, дефосфорилирование аЗ и а7 субъединиц протеасом приводило к снижению двух пептидазных активностей протеасом (Mason et al., 1996). Кроме того, фосфорилирование субъединиц протеасом ответственно за ассоциацию 20S протеасомы и 19S регуляторных комплексов (Rivett et al., 2001). Известно, что в зависимости от стадии клеточного цикла, изменялся статус фосфорилирования протеасом (Iwafune et al., 2002) и что некоторые клеточные сигналы вызывают изменения в фосфорилированности субъединиц протеасом (Bose et al., 2001; Rivett et al., 2001; Bardag-Gorce et al., 2004). Однако воздействие индукторов апоптоза на изменение статуса фосфорилирования протеасом не исследовалось. Основываясь на том, что при индукции апоптоза в дифференцированных клетках изменялся субъединичный состав и протеолитическая активность протеасом, было сделано предположение, что такие изменения в протеасомах могут приводить к усилению деградации по протеасом-убиквитиновому пути определенных клеточных белков, приводящих к апоптозу (Naujokat, Hoffmann, 2002). Однако до сих пор нет данных об изменении субъединичного состава и регуляции активностей протеасом в быстро пролиферирующих клетках при индукции апоптотической гибели. Кроме того, при индукции апоптоза в клетках не было исследовано изменение эндорибонуклеазной активности протеасом. Не исследовано влияние изменения статуса фосфорилирования протеасом на их протеолитическую и эндорибонуклеазную активности при индукции апоптоза как в дифференцированных, так и в быстро пролиферирующих клетках. Одним из актуальных и наименее исследованных, кроме всего прочего, является вопрос о гетерогенности популяции протеасом в клетке (в том числе, в отдельных клеточных компартментах), о назначении множественных форм протеасом. Так, например, нет данных об исследованиях субъединичного состава, статуса фосфорилирования и ферментативных активностей ядерных протеасом при индукции апоптоза в клетках.
В свете вышесказанного, представляется весьма актуальным исследование специфических изменений субъединичного состава и статуса фосфорилирования протеасом, очищенных из цитоплазмы и ядер клеток проэритролейкемии человека линии К562 при индукции программированной клеточной гибели при помощи диэтилмалеата (ДЭМ) или доксорубицина (ДР). Кроме того, валено проанализировать воздействие данных индукторов апоптоза на протеолитическую и эндорибонуклеазную активности протеасом, а также влияние дефосфорилирования протеасомных субъединиц на ферментативных активностей протеасом при индукции апоптоза в клетках К562. 1.2. Цели и задачи исследования
Целью настоящей работы явилось исследование субъединичного состава и ферментативных активностей протеасом при индукции апоптоза в клетках проэритролейкемии человека линии К562. Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:
1. На модели индукции апоптоза в быстро пролиферирующих клетках К562 с помощью противоопухолевого препарата доксорубицина и глутатион-истощающего агента диэтилмалеата провести сравнительный анализ субъединичного состава и протеолитическои активности ядерных и цитоплазматических протеасом.
2. Исследовать влияние индукторов апоптоза на эндорибонуклеазную активность протеасом из ядер и цитоплазмы клеток К562.
3. Оценить изменения в статусе фосфорилирования по треонину, серину и тирозину субъединиц ядерных и цитоплазматических протеасом при индукции апоптоза в клетках К562.
4. Исследовать влияние дефосфорилирования белковых субъединиц изучаемых частиц на протеолитическую и РНКазную активности протеасом, выделенных из ядер и цитоплазмы клеток К562 в контроле и при индукции апоптоза.
1.3. Основные положения, выносимые на защиту
1. При индукции апоптоза с помощью ДЭМ или ДР в клетках К562 наблюдаются специфические изменения субъединичного состава протеасом и статуса фосфорилирования, то есть перепрограммирование популяции цитоплазматических протеасом.
2. При индукции апоптотической гибели в клетках К562 происходит также перепрограммирование популяции ядерных протеасом.
3. Воздействие на клетки К562 индукторов апоптоза (ДЭМ и ДР) приводит к изменению специфичности ферментативных (протеолитическои и эндорибонуклеазной) активностей протеасом. 4. Изменение статуса фосфорилирования протеасом при индукции апоптоза в клетках К562 регулирует как протеолитическую, так и эндорибонуклеазную активности исследуемых частиц.
1.4. Научная новизна
В настоящей работе впервые показано, что индукция апоптоза в быстро пролиферирующих клетках (на примере клеток проэритролейкемии человека линии К562) вызывает изменения субъединичного состава цитоплазматических и ядерных протеасом и их протеолитической активности. Причем при действии на клетки К562 индукторов апоптоза наблюдается изменение специфичности протеолитической активности протеасом: выявлено селективное изменение трипсин- и химотрипсин-подобных типов протеолитической активности как цитоплазматических, так и ядерных протеасом.
Впервые при индукции апоптотической программы выявлены изменения статуса фосфорилирования по треонину, серину и тирозину ядерных и цитоплазматических протеасом, а также их эндорибонуклеазной активности. Наблюдается дифференциальная регуляций РНКазной активности протеасом при действии индукторов апоптоза на клетки К562. Полученные результаты свидетельствуют также о существовании пока не исследованной системы регуляции статуса фосфорилирования протеасом (причем различной в ядре и цитоплазме) в составе программы ответа клетки на действие индукторов апоптоза.
Выявлено, что при индукции апоптотической программы в клетках К562 наблюдаются модификации субъединиц 20S протеасомы, в том числе каталитических, ассоциированных с протеолитической активностью трипсин-подобного типа (Р2) и РНКазной активностью (a5/zeta и аб/iota).
Впервые исследован механизм регуляции протеолитической и эндорибонуклеазной активностей протеасом при индукции апоптоза, а именно обнаружена зависимость исследуемых активностей от дефосфорилирования белковых субъединиц протеасом. 1.5. Теоретическое и практическое значение работы
Полученные результаты свидетельствуют об изменениях субъединичного состава, ферментативных активностей и статуса фосфорилирования, то есть о перепрограммировании популяции цитоплазматических и ядерных протеасом при индукции апоптоза в клетках К562. Результаты работы имеют большое значение для дальнейшего углубленного изучения молекулярных механизмов, задействованных в апоптозе; могут служить теоретической основой для разработки терапевтических подходов в лечении лейкемии, так как индукцию апоптоза используют для терапии рака. Протеасомы человека могут быть использованы в качестве новых фармакологических мишеней (Wojcik, 2002). Так, ингибиторы протеасом уже сейчас активно исследуются в качестве агентов противоопухолевой терапии (Vink et al., 2006). Однако результаты экспериментов с использованием ингибиторов протеасом должны соответствовать данным по сравнительному анализу структуры и функций протеасом в норме и при патологии.
1.6. Финансовая поддержка
Работа выполнена при финансовой поддержке Российского фонда фундаментальных исследований (проекты 02-04-49621, 05-04-49606), гранта Президента РФ по поддержке ведущих научных школ (НШ-523.2006.4), Санкт-Петербургского Научного Центра 2005 и 2006 годов и с использованием оборудования ЦКП «Материаловедение и диагностика в передовых технологиях».
1.7. Публикации По теме диссертации опубликовано 11 печатных работ (6 статей).
1.8. Апробация работы
Материалы диссертации были представлены на Всероссийских симпозиумах «Клеточная биология на пороге XXI века» (Санкт-Петербург, 2000); «1-ый съезд Общества клеточной биологии» (Санкт-Петербург, 2003), «Биология клетки в культуре» (Санкт-Петербург, 2006); на XV Всероссийском совещании «Структура и функции клеточного ядра» (Санкт 11
Петербург, 2005), а также на Международных Конгрессах по молекулярной биологии и генетике (Киев, 2003), по внутриклеточному сигналингу (Дубровник, 2004), по биологии клетки в культуре "Стволовые клетки, регенерация, клеточная терапия" (Санкт-Петербург, 2004) и 30-ый конгресс Европейского биохимического общества "The Protein World. Proteins and Peptides: Structure, Function and Organization" (Будапешт, 2005).
1.9. Объем и структура диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов исследования, изложения экспериментальных данных, обсуждения результатов, выводов и списка цитируемой литературы. Работа изложена на 143 страницах машинописного текста, иллюстративный материал содержит 17 рисунков.
Основные положения, выносимые на защиту
Целью настоящей работы явилось исследование субъединичного состава и ферментативных активностей протеасом при индукции апоптоза в клетках проэритролейкемии человека линии К562. Исходя из этого, были поставлены следующие задачи:
1. На модели индукции апоптоза в быстро пролиферирующих клетках К562 с помощью противоопухолевого препарата доксорубицина и глутатион-истощающего агента диэтилмалеата провести сравнительный анализ субъединичного состава и протеолитическои активности ядерных и цитоплазматических протеасом.
2. Исследовать влияние индукторов апоптоза на эндорибонуклеазную активность протеасом из ядер и цитоплазмы клеток К562.
3. Оценить изменения в статусе фосфорилирования по треонину, серину и тирозину субъединиц ядерных и цитоплазматических протеасом при индукции апоптоза в клетках К562.
4. Исследовать влияние дефосфорилирования белковых субъединиц изучаемых частиц на протеолитическую и РНКазную активности протеасом, выделенных из ядер и цитоплазмы клеток К562 в контроле и при индукции апоптоза.
1. При индукции апоптоза с помощью ДЭМ или ДР в клетках К562 наблюдаются специфические изменения субъединичного состава протеасом и статуса фосфорилирования, то есть перепрограммирование популяции цитоплазматических протеасом.
2. При индукции апоптотической гибели в клетках К562 происходит также перепрограммирование популяции ядерных протеасом.
3. Воздействие на клетки К562 индукторов апоптоза (ДЭМ и ДР) приводит к изменению специфичности ферментативных (протеолитическои и эндорибонуклеазной) активностей протеасом. 4. Изменение статуса фосфорилирования протеасом при индукции апоптоза в клетках К562 регулирует как протеолитическую, так и эндорибонуклеазную активности исследуемых частиц.
В настоящей работе впервые показано, что индукция апоптоза в быстро пролиферирующих клетках (на примере клеток проэритролейкемии человека линии К562) вызывает изменения субъединичного состава цитоплазматических и ядерных протеасом и их протеолитической активности. Причем при действии на клетки К562 индукторов апоптоза наблюдается изменение специфичности протеолитической активности протеасом: выявлено селективное изменение трипсин- и химотрипсин-подобных типов протеолитической активности как цитоплазматических, так и ядерных протеасом.
Впервые при индукции апоптотической программы выявлены изменения статуса фосфорилирования по треонину, серину и тирозину ядерных и цитоплазматических протеасом, а также их эндорибонуклеазной активности. Наблюдается дифференциальная регуляций РНКазной активности протеасом при действии индукторов апоптоза на клетки К562. Полученные результаты свидетельствуют также о существовании пока не исследованной системы регуляции статуса фосфорилирования протеасом (причем различной в ядре и цитоплазме) в составе программы ответа клетки на действие индукторов апоптоза.
Выявлено, что при индукции апоптотической программы в клетках К562 наблюдаются модификации субъединиц 20S протеасомы, в том числе каталитических, ассоциированных с протеолитической активностью трипсин-подобного типа (Р2) и РНКазной активностью (a5/zeta и аб/iota).
Впервые исследован механизм регуляции протеолитической и эндорибонуклеазной активностей протеасом при индукции апоптоза, а именно обнаружена зависимость исследуемых активностей от дефосфорилирования белковых субъединиц протеасом. 1.5. Теоретическое и практическое значение работы
Полученные результаты свидетельствуют об изменениях субъединичного состава, ферментативных активностей и статуса фосфорилирования, то есть о перепрограммировании популяции цитоплазматических и ядерных протеасом при индукции апоптоза в клетках К562. Результаты работы имеют большое значение для дальнейшего углубленного изучения молекулярных механизмов, задействованных в апоптозе; могут служить теоретической основой для разработки терапевтических подходов в лечении лейкемии, так как индукцию апоптоза используют для терапии рака. Протеасомы человека могут быть использованы в качестве новых фармакологических мишеней (Wojcik, 2002). Так, ингибиторы протеасом уже сейчас активно исследуются в качестве агентов противоопухолевой терапии (Vink et al., 2006). Однако результаты экспериментов с использованием ингибиторов протеасом должны соответствовать данным по сравнительному анализу структуры и функций протеасом в норме и при патологии.
Ферментативные активности протеасом
Посттрансляцноннные модификации протеасомных субъединиц. В качестве таких модификаций субъединиц протеасом согласно существующим для различных видов организмов литературным данным, могут выступать фосфорилирование, гликозилирование (Sumegi et al.,. 2003; Zachara, Hart, 2004), N-ацетилирование, 4-гидрокси-2-ноненил-алкилирование (Farout et al., 2006).
Из всех возможных модификаций чаще всего исследуется фосфорилирование, т.к. оно играет важнейшую роль в регуляции многих биологических процессов. В настоящее время известно, что ряд субъединиц как 20S протеасом, так и регуляторных комплексов 19S и РА28 находятся в клетке в фосфорилированном состоянии. Впервые эти данные были получены на препаратах 20S протеасом, выделенных из личинок дрозофилы, где были обнаружены четыре фосфорилированные субъединицы протеасом в (Haass et al., 1989). Впоследствии было показано, что, по крайней мере, две субъединицы 20S протеасом млекопитающих фосфорилирируются in vitro цАМФ-зависимой лротеин-киназой, соочищающейся с препаратами бычьих протеасом. Также было обнаружено фосфорилирование in vitro субъединицы протеасом с молекулярной массой 30 кДа с помощью СК2 (казеин-киназа II), соочищающейся с протеасомами эритроцитов человека (Ludemann et al., 1993). Было показано, что субъединица аб, выделенная из" клеток риса, фосфорилируется серин/треониновой киназой, активность которой подавляется специфическими ингибиторами СК2 (Umeda et al., 1997). Кроме этого, еще были найдены три фосфорилированные субъединицы а-типа (а2, а4 и а7) в дрожжах, четыре субъединицы у млекопитающих (а2, аЗ, а5 и а7) и одна субъединица а4 в ооцитах лягушки Xenopus (Tokumoto et al., 1999; Iwafune et al., 2000).
Исследование фосфорилированных аминокислот из печени крыс и плаценты человека показало, что субъединица о2 содержит фосфотирозин и фосфотреонин, а в составе субъединиц 36, а7, аЗ и а5 был обнаружен фосфосерин. В дрожжах белки а2 и а4 фосфорилированы по серину и треонину, а а7 - по тирозину (Iwafune et al., 2002). У археона Haloferax volcanii р-субъединица содержит фосфосерин (Humbard et al., 2006).
Регуляторные комплексы протеасом (РА28 и РА700) также содержат фосфорилированные субъединицы. Так фосфорилированные субъединицы были найдены в 11S регуляторах, полученных из лизатов ретикулоцитов кролика. Анализ фосфоаминокислот в составе РА28 комплексов эритроцитов человека показал, что фосфорилирование происходит по сериновым основаниям. Ряд субъединиц 19S комплекса, включая одну из АТФаз (S4), тоже фосфорилируется in vivo (Mason et al., 1998).
Фосфорилирование белков является наиболее распространенным способом изменения активности регуляторных белков и играет важную роль практически во всех клеточных процессах: в контроле клеточного цикла, в передаче сигнала, в транскрипции и апоптозе. Фосфорилирование белков также участвует в регуляции деградации белков по АТФ- и убиквитин-зависимому пути (Mason et al., 1996). Предполагается, что фосфорилирование/дефосфорилирование субъединиц протеасом участвует в регуляции ферментативных активностей протеасом через конформационные изменения. Так, было обнаружено, что дефосфорилирование субъединиц протеасом а7 и аЗ приводит к снижению двух пептидазных активностей (трипсин-подобной и постглутамилгидролазной активностей) (Mason et al., 1996).
Кроме того, фосфорилирование/дефосфорилирование различных субъединиц как 20S, так и 26S протеасомы может контролировать присоединение регуляторных белков к концам коровой частицы и являться одним из механизмов изменения соотношения этих двух форм, а также гибридной (PA700-20S-PA28) протеасомы и иммунопротеасомы (Rivett et al., 2001; Boseetal., 2003). Фосфорилирование протеасомных субъединиц регулируется также при изменении функционального состояния клеток. Так в ооцитах лягушки Xcnopus уровень фосфорилирования субъединицы а4 изменяется в зависимости от фазы клеточного цикла, она гиперфосфорилирована в фазе G2, а в митозе, наоборот, находится в дефосфорилированном состоянии (Tokumoto et al., 1999; Wakata et al., 2004).
N-ацетилирование было выявлено у субъединиц протеасом, выделенных из клеток дрожжей (Arendt, Hochstrasser, 1999; Kimura et al., 2000) и гепатоцитов крыс (Tokunaga et al., 1990). Кроме того, было показано наличие N-ацетилирования а7 субъединицы протеасом эритроцитов человека (Claverol et al., 2002), ацетилирование al и a2 субъединиц археона Haloferax volcanii (Humbard et al., 2006).
Локализация протеасом в клетке. Первоначально полагали, что убиквитин-зависимый протеолиз происходит только в цитоплазме. Позже оказалось, что протеасомы обнаруживаются также и в ядрах клеток (von Mikecz, 2006). Так, например, в гепатоцитах крысы 16 % протеасом локализованы в ядре, 14 % связаны с эндоплазматическим ретикулумом (ЭР), а остальные 70 % - с цитоплазматическим матриксом (Rivett et al., 1992). Однако процентное соотношение содержания протеасом изменяется в зависимости от типа клеток. Так, в клетках центральной нервной системы крыс наблюдается высокое содержание протеасом в ядре (Rivett, 1998). При ухудшении условий существования клетки, количество протеасом в ядре резко уменьшается, тогда как в цитоплазме, напротив, увеличивается (Wojcik, DeMartino, 2003).
В цитоплазме протеасомы ассоциированы с цитоскелетом: промежуточными филаментами (это взаимодействие регулируется в зависимости от стадии клеточного цикла) (Olink-Coux et al., 1994), актиновыми филаментами (Галкин и др., 1998а, 19986) и актомиозиновыми комплексами (Ryabova et al., 1994). А также протеасомы ассоциированы с цитоплазматической стороной гладкого ЭР и цис-стороной аппарата Гольджи (Palmer et al., 1996; Rivett, 1998; Wojcik, DeMartino, 2003).
Флуоресцентная окраска хроматина
РНК выделяли методом фенольно-термического фракционирования (Георгиев, Мантьева, 1962). На холоду готовили гомогенат клеток линии К562 в 0.14 М NaCl и добавляли к нему равный объем водонасыщенного фенола, рН 6.0. Экстракцию проводили при комнатной температуре в течение 15 мин при мягком встряхивании. После экстракции суспензию центрифугировали (К23, 4 С, 4 тыс. об/мин, 30 мин). Собирали водную фазу, содержащую цитоплазматическую РНК. Далее полученную водную фазу подвергали фенольно-хлороформной депротеинизации, которую проводили следующим образом: добавляли SDS до конечной концентрации 0.5 % и равный объем фенола рН 8.0. Смесь в течение 15 мин перемешивали, после чего центрифугировали (К23, 4 С, 4 тыс. об/мин, 30 мин). Этот этап повторяли еще дважды, первый - в присутствии смеси из равных объемов фенола рН 8.0 и хлороформа, второй - в присутствии только хлороформа. РНК после последней депротеинизации осаждали 2.5 объемами охлажденного этанола. Осадки собирали центрифугированием (К23, 4 С, 4 тыс. об/мин, 45 мин), растворяли в небольшом объеме воды и повторно осаждали 2.5 объемами охлажденного этанола с 0.3 М ацетатом натрия. Растворенную в минимальной объеме деионизованной воды РНК очищали от примеси низкомолекулярной РНК, добавляя NaCI до конечной концентрации 2.5 М и оставляя на холоду на несколько часов. Собранные центрифугированием осадки, содержащие высокомолекулярные РНК, растворяли в воде и несколько раз переосаждали 2.5 объемами этанола в присутствии 0.3 М ацетата натрия. Препараты РНК хранили под 75 %-ным этанолом при -20 С. 26S протеасомы выделяли из постмитохондриального супернатанта цитозоля клеток и ядерного экстракта с помощью ультрацентрифугирования в градиенте концентрации сахарозы (15-30%) и ионообменной хроматографии на DE-52 целлюлозе (Hough et al., 1987).
Ядерный экстракт и цитозоль выделяли, согласно методу, описанному Константиновой и соавторами (Константинова и др., 1995) с некоторыми модификациями.
Клетки размораживали в ледяной бане, ресуспендировали в 0.14 М растворе NaCl, после чего добавляли 2.2 М раствор сахарозы, содержащий 10 мМ Tris-HCl, рН 7.5, 3.3 мМ MgCl2 и 0.1 мМ PMSF, до конечной концентрации сахарозы 1.7 М. Измельчали на гомогенизаторе и центрифугировали (4 С, 13 тыс. об/мин, 120 мин) в угловом роторе на центрифуге К24 (MLW, Германия). Полученный осадок ядер последовательно промывали в растворах 0.34 М сахарозы, 0.35 М NaCl, 0.14 М NaCl и 0.01х SSC, каждый раз гомогенизируя осадки в плотно притертом гомогенизаторе Поттера и центрифугируя после этого суспензию (К23, 4 С, 2-2.5 тыс. об/мин, 8 мин).
При выделении ядер получали ядерный экстракт, собранный из супернатанта после серии промывки ядер, и супернатант цитозоля, который диализовали на холоду против воды (две смены воды через 12 часов) до достижения концентрации сахарозы порядка 250 мМ и центрифугировали (К24; 4 С, 12 тыс. об/мин, 30 мин) для осаждения митохондрий и микросом. Содержащиеся в супернатанте и экстракте белки высаливали 70 %-ным сульфатом аммония и оставляли при 4 С для формирования осадка. Осадок собирали центрифугированием (К24; 4 С, 12 тыс. об/мин, 30 мин) и растворяли в минимальном объеме буферного раствора, содержащего 10 мМ Tris-HCl, рН 7.5, 1 мМ MgCl2, 1 мМ АТФ, 2 мМ DTT. Полученные пробы в объеме 500-700 мкл наносили на линейный градиент плотности сахарозы (15
ЗО %), приготовленный с использованием градиентатора фирмы LKB (Швеция), и подвергали ультрацентрифугированию (4 С, 34 тыс. об/мин, 18.5 ч) в бакетном роторе центрифуги Beckman (США).
После ультрацентрифугирования, градиенты разделяли на фракции по 300 мкл, оценивая в каждой пробе оптически при помощи рефрактометра концентрацию сахарозы. В дальнейшей работе использовали только фракции, соответствующие по оптической плотности константам Сведберга, равным 20S и 26S. Эти фракции объединяли и очищали посредством хроматографии на анионообменной целлюлозе DE52.
Анионообменную колонку заполняли взвесью целлюлозы и промывали сначала буферным раствором, содержащем 10 мМ Tris-HCl, рН 7.5, затем 4 мл буфера I, содержащего 10 мМ Tris-HCl, рН 7.5, 1 мМ MgCb, 1 мМ АТФ, 2 мМ DTT, 83 мМ КС1, 17 мМ NaCl. Далее на колонку наносили пробу, концентрация белка в которой не превышала 3 млгр, после чего последовательно пропускали 4 мл буфера I, 4 мл буфера II, содержащего 10 мМ Tris-HCl, рН 7.5,1 мМ MgCl2,1 мМ АТФ, 2 мМ DTT, 300 мМ КС1,17 мМ NaCl и 4 мл буфера III, содержащего 10 мМ Tris-HCl, рН 7.5, 1 мМ MgCb, 1 мМ АТФ, 2 мМ DTT, 500 мМ КС1, 17 мМ NaCl.
На уровне нанесения буфера II начинали собирать фракции по 500 мкл, оценивая количество материала в каждой фракции спектрофотометрически (при длине волны 230 нм). Пробы из зон с константой седиментации 20S и 26S осаждали пятью объемами охлажденного этанола и оставляли при -20 С для формирования осадка, который собирали центрифугированием (К23; 4 С, 4 тыс. об/мин, 30 мин). Препараты протеасом хранили под 80 %-ным этанолом при -20 С.
Воздействие на клетки К562 индукторов апоптоза вызывает изменения в субъединичном составе цитоплазматических протеасом
Концентрацию белка в очищенных препаратах 26S протеасом определяли спектрофотометрически методом Брэдфорд (Bradford, 1976) и уравнивали пробы по количеству белка между собой. Электрофоретическое разделение белков проводили в 10-12%-ном плоском ПААГ на трис-глициновом буфере в присутствии 0.1% SDS в стандартной системе Лэммли (Laemmli, 1970). В качестве маркеров молекулярного веса использовали окрашенные белки (Fermentas Life Sciences, Литва). Электрофорез вели в течение 5 часов при 40мА. Белки переносили из геля на нитроцеллюлозную мембрану Hybond С (Amersham-Pharmacia-Biotech, Швеция) (или PVDF мембрану (BioRad, США)) в течение 1.5-3 часов в аппарате для электроблотинга (Sigma, США) при ICOnst= 48 мА (0.7 mA/см ) в буферном растворе Т, содержащем 47.9 тМ Трис-НС1, 38.6 тМ глицин (рН 8.3), 0.0385% SDS, 20%) (V/V) метанол. Для предупреждения неспецифической сорбции мембраны со связанными на них белками несколько раз промывали в буферном растворе TTBS (10 мМ трис-НС1, рН 7.5, 100 мМ NaCl, 0.1% tween 20) и один раз в течении 60-120 мин в 5% обезжиренном молоке (или 1-5% бычьем сывороточном альбумине (BSA)), приготовленном на TTBS. После этого мембраны инкубировали в TTBS, содержащем 1% BSA и соответствующие специфические антитела в течение ночи при 4 С. Далее их промывали в TTBS три раза по 10 минут и инкубировали 1 час в TTBS с 5% молоком, содержащим вторые антитела, конъюгированные с пероксидазой хрена, при комнатной температуре. Мембраны промывали в TTBS три раза по 10 минут. Белки на мембранах выявляли методом усиления хемолюминесценции (ECL), согласно инструкции фирмы-изготовителя (ICN, США) или SuperSignal West Femto Maximum Sensitivity Substrate (Pierce, США), и экспонировали с рентгеновской пленкой Kodak X-Omat К (США) при комнатной температуре. Компоненты ECL-смеси: 1.25 мМ люминол, 0.1 М трис-HCl (рН 8.5), 6.8 мкМ раствор кумаровой кислоты в DMSO (диметилсульфоксид), 0.02 % Н2О2.
В качестве специфических антител использовали антитела к субъединицам протеасом al, a2, a3, а4, а5, аб, а7, (32, рз и 37 (все BioMol, Англия). Также были использованы антитела к фосфорилированным аминокислотам: Туг (BD, США), Thr (Cell Signaling, США) и Ser (Sigma, США). В качестве вторых антител были использованы антитела кролика против иммуноглобулинов мыши или антитела козла против иммуноглобулинов кролика (Sigma, США).
Электрофоретический анализ белков проводили по Лэммли (Laemmli, 1970) в вертикальном аппарате. Разделение белков производилось в 10-12% ПААГ (соотношение акриламид : метилен-бис-акриламид составляло 30 : 1) на трис-глициновом буфере (25 мМ трис, 0.192 М глицин, рН 8.3) в присутсвии 0.1% SDS. Предварительно белковые пробы, растворенные в 1х буфере для проб (50 мМ трис-HCl (рН 6.8), 1% SDS, 100 мМ 2-меркаптоэтанол, 10% глицерин, 0.00125% бромфеноловыйсиний), кипятили в течение 5 минут.
Двумерный электрофорез белков проводили согласно инструкциям фирмы изготовителя (Bio-Rad, США). Предварительно белковые пробы растворяли в 230 мкл буфера для проб, содержащего 9М мочевины, 2% CHAPS, 1.2% Distreak solution и 2% IPG-buffer, рН 3-Ю (Amersham Pharmacia Biotech, Англия). Электрофорез в первом направлении проводили на приборе Protean IEF system (Bio Rad, США). Готовые полоски геля длиной 11 см рН 3-Ю (IPG strips, Bio-Rad, США) регидратировали в буфере для проб при 50 В в течение 15 часов и затем при 250 В в течение 15 мин. Далее пробы фокусировались в течение 2.5 ч при вольтовом линейном градиенте в диапазоне 250 - 8000 В, после чего электрофорез вели в течение 20 кВч. Перед вторым направлением готовые полоски IPG strips инкубировали последовательно в течение 15 мин в буфере, содержащем 50мМ трис- НС1, рН 6.8, 6М мочевину, 30% глицерин, 2% SDS и 1% DTT, и в течение 15 мин в том же самом буфере, где DTT заменили на 2.5% иодацетамид. Электрофорез во втором направлении проводили в 12% ПААГ в стандартной системе Лэммли (Laemmli, 1970). Белки визуализировали окрашиванием серебром.
3.15. Материалы
В работе использовали среду RPMI 1640, сыворотку крови крупного рогатого скота (Биолот, Россия); гентамицин (KRKA, Югославия); хлороформ, этанол, уксусную кислоту, КС1, NaH2P04 (Россия); акриламид, дитиотрейтол (DTT), глицерин, глицин, АТФ (ICN Pharmaceuticals, США); эмбриональную телячью сыворотку, метилен-бисакриламид, трис-гидроксиметиламинометан, ЭДТА, апротинин, леупептин, пепстатин, ацетат магния, М,Ы,М ,Ы -тетраметилэтилендиамин (ТЕМЕД), персульфат аммония, мочевину, борную кислоту, морфолинопропансульфонат натрия (MOPS), фенол, ДНКазу I, проназу Е, протеиназу К, актиномицин Д (Sigma, США); додецилсульфат натрия (USBiolabs, США); бромистый этидий, фенилметил-сульфонилфторид (PMSF) (Serva, Германия); NaCl, СНЗСООЫа (Merck, Германия); HEPES (Biochrom KG, Германия); полинуклеотидкиназу фага Т4, РНК лигазу фага Т4, набор для мультипраймерного мечения ДНК, набор для транскрипции in vitro, РНК-полимеразы фагов ТЗ, Т7 и SP6, ингибитор РНКаз, щелочную фосфатазу кишечника теленка, маркеры ДНК, РНК и белков, эндонуклеазы рестрикции BamHI, HindlH, EcoRI (MBI Fermentas, Литва), Сефадекс G50 medium, нуклеозидтрифосфаты, нитроцеллюлозные мембраны Hybond N (Amersham-Pharmacia-Biotech, Швеция); рентгеновскую пленку Kodak X-Omat К (Kodak, США); [а-32Р] УТФ, [а-32Р] дАТФ, [у-32Р] АТФ, [а-32Р] ЦТФ, [а-32Р] 3 ,5 -ЦДФ (НПО ГИПХ, Санкт-Петербург, Россия); мРНК люциферазы Renilla sp. (Promega, США).
