Введение к работе
Актуальность проблемы
Несмотря на то, что механизмы регуляции экспрессии генов прокариот изучаются уже несколько десятилетий, все еще остается очень много непонятного в том, каким образом реализуется адаптация клеток к изменяющимся условиям внешней среды. В последнее время появилось много новых данных, которые меняют наше представление о способах опосредованного геномом переключения клеточного метаболизма и вносят значительные поправки в общую схему адаптивных реакций. Первым и, во многом, определяющим этапом реализации генетической информации, является транскрипция. Традиционно считается, что эффективность синтеза РНК контролируется белками — активаторами и репрессорами — общее число которых в бактериальной клетке может быть около 300 [Blattner 1997, Озолинь 2005]. Кроме того, существует еще один класс регуляторов - малые нетранслируемые РНК. Для Е.соїі в настоящее время изучено 87 регуляторних РНК, большая часть которых кодируется независимыми генами. Данные системного анализа позволяют предположить, что их в клетке гораздо больше, чем белковых регуляторов транскрипции [Argaman 2001, Saetrom 2005, Tjaden 2006]. Только 10 известных нетранслируемых РНК транскрибируются из кодирующих последовательностей в антисмысловом направлении. Образуя комплементарные дуплексы с мРНК вблизи инициирующего кодона, они влияют на их ассоциацию с рибосомами и, следовательно, модулируют синтез белкового продукта. При связывании с другими участками матричной РНК, антисмысловые РНК могут изменять их стабильность, поддерживая относительное содержание мРНК на оптимальном для клетки уровне [Storz 2005]. Очевидно, что для создания целостной картины клеточного метаболизма желательно иметь информацию обо всех генах, экспрессия которых может регулироваться по антисмысловому механизму. Однако перекрывание со смысловыми последовательностями затрудняет целенаправленный поиск мест кодирования антисмысловых РНК методами сравнительной геномики. В данном случае, перспективным может быть поиск по сигналам транскрипции, позволивший обнаружить большую часть известных нетранслируемых РНК в межгенных участках [Argaman 2001, Chen 2002].
Для поиска потенциальных промоторов для аРНК мы использовали разработанную в нашей лаборатории компьютерную программу PlatProm,
которая, кроме консервативных элементов, распознаваемых вегетативной а -субъединицей РНК-полимеразы, учитывает ряд других структурных особенностей промоторной ДНК, рассматривая ее как единую платформу для взаимодействия и с РНК-полимеразой, и с регуляторными белками [Brok-Volchanski 2005]. В результате сканирования обеих нитей геномной ДНК Е.соИ с помощь этого алгоритма оказалось, что 1706 генов имеют дополнительные сигналы внутри кодирующих последовательностей, а 997 содержат предсказанные промоторы с антисмысловой ориентацией. Ввиду возможного участия синтезируемых с них РНК в регуляции экспрессии генов, такие промоторы стали предметом первоочередного исследования.
Цель и задачи исследования
Основной целью данной работы было исследование транскрипционной активности в генетических локусах E.coli, содержащих предсказанные PlatProm промоторы для синтеза антисмысловых РНК.
Конкретными задачами были:
Оценка способности PlatProm предсказывать эффективность формирования РНК-полимераза-промоторных комплексов в стандартных условиях in vitro.
Информационный анализ, направленный на выбор репрезентативных промоторов для экспериментального тестирования.
Оценка способности отобранных промоторов к продуктивному взаимодействию с PFtK-полимеразой in vitro.
Тестирование транскрипционной активности промоторов in vivo.
Научная новизна
Впервые установлено, что в гене hns может начинаться синтез антисмысловой РНК, внутриклеточное содержание который зависит от скорости роста, увеличиваясь при переходе к стационарной фазе. Впервые картировано 3 новых промотора перед генами, способных инициировать синтез bglG-, brnQ- и uxuR-мРНК. Обнаружена новая малая РНК (UxuT), транскрипция которой начинается в З'-нетранслируемом участке uxuR.
Научно-практическая ценность
В работе исследована транскрипционная активность 9 генетических локусов,
содержащих в общей сложности 26 потенциальных промоторов. Впервые в
одинаковых условиях была оценена эффективность комплексообразования с а -
РНК-полимеразой E.coli для 35 фрагментов ДНК, содержащих предсказанные
PlatProm промоторы с различной локализацией. Величина коэффициента
корреляции между максимальным показателем промотор-подобия и
эффективностью взаимодействия с РНКП (0.63) говорит о высоком предсказательном потенциале алгоритма, и позволяет использовать его в качестве базовой программы для картирования потенциально транскрибируемых сайтов.
Апробация работы
Результаты работы были представлены на международных конференциях
"Genomes 2008: Functional genomics of microorganisms" (Paris, France, 2008, приз
EMBO за лучший постерный доклад), "4th EMBO Conference: From Functional
Genomics to Systems Biology" (EMBL Heidelberg, Germany, 2008), 34-м съезде
FEBS (Prague, Czech Republic, 2009), 3-м конгрессе FEMS (Gothenburg, Sweden,
2009), "15 Conversation on Biomolecular Structure and Dynamics" (Albany, USA,
2007), "3rd International Moscow Conference on Computational Molecular Biology"
(Москва, 2007), "5th International Conference on Bioinformatics of Genome
Regulation and Structure" (Новосибирск, 2006), школе-конференции
«Перспективные направления физико-химической биологии и биотехнологии»
(Москва 2006, 2007, 2008) и на 10-й международной Пущинской школе-конференции молодых ученых «Биология наука XXI века» (Пущино, 2006).
Публикации
По материалам диссертации опубликовано -/опечатных работ, в том числе, _6 статей в реферируемых журналах и сборниках.
Структура и объём диссертации
Диссертационная работа состоит из введения, обзора литературы, материалов и методов, результатов и их обсуждения, заключения, выводов и списка цитируемой литературы, включающего о?0^источников. Работа изложена на страницах машинописного текста и содержит 55 рисунков и 4 таблицы.
