Содержание к диссертации
Стр.
ВВЕДЕНИЕ 5
ОБЗОР ЛИТЕРАТУРЫ
І. ОЩИЕ ЗАКОНОМЕРНОСТИ СТРОЕНИЯ И ФУНКЦИИ ПРОМОТОРОВ
ПРОКАРИОТОВ 8
I.I. ОЩИЕ ЧЕРТЫ СТРУКТУРЫ ПРОМОТОРОВ ПРОКАРИОТОВ 8
-
Структурная гомология рамки Прибнова-Шаллера у промоторов, узнаваемых РНК-полимеразой Б. coli 9
-
Область нуклеотида -35 19
-
Другие функционально-значимые участки в нуклео-тидной последовательности промотора 24
I.II. ОСОБЕННОСТИ СТРУКТУРЫ ПРОМОТОРОВ ПРОКАРИОТОВ . . 33
-
Особенности структур промоторов, узнаваемых РНК-полимеразами бактериофагов и РНК-полимеразой бактерий, модифицированных бактериофагом ... 33
-
Особенности структуры промоторов, узнаваемых РНК-полимеразой е. coli 36
П. ИСПОЛЬЗОВАНИЕ ПЯАЗМИДНЫХ ВЕКТОРОВ В ИЗУЧЕНИИ СТРУК
ТУРЫ И ФУНКЦИИ ПРОМОТОРОВ ПРОКАРИОТОВ 41
III. БАКТЕРИОФАГ 0X174 И ЕГО ТРАНСКРИПЦИЯ 45
МАТЕРИАЛЫ И МЕТОДЫ 51
РЕЗУЛЬТАТЫ И ОБСУЖДЕНИЕ 70
I. ВЫДЕЛЕНИЕ И КЛОНИРОВАНИЕ ФРАГМЕНТОВ ДНК, СОДЕРЖАЩИХ
ПРОМОТОРЫ А, В И D БАКТЕРИОФАГА 0X174 70
-
Выделение фрагментов ДНК, содержащих промоторы 70
-
Клонирование фрагментов ДНК, содержащих промоторы,
в плазмиде pBRH4 74
3. Клонирование фрагментов ДНК, содержащих промоторы,
в плазмиде -pHD68-17 77
II. ИЗУЧЕНИЕ АКТИВНОСТИ ПРОМОТОРОВ БАКТЕРИОФАГА 0X174 . . 81
-
Определение активности промоторов по экспрессии tet-оперона (плазмида pBRH4) 81
-
Определение активности промоторов по экспрессии gal-оперона (плазмида pHD68-17 ) 88
-
Влияние числа копий промотора на экспрессию gal -оперона 101
III. ЛОКАЛИЗАЦИЯ ПРОМОТОРА В БАКТЕРИОФАГА 0X174 107
ВЫВОДЫ 116
ЛИТЕРАТУРА 117
ПРИНЯТЫЕ СОКРАЩЕНИЯ
Сокращения нуклеотидов и полинуклеотидов общепринятые
сАМР - циклический 3 ,5 -аденозинмонофосфат
САР - белок, активатор катаболитных генов
ЭДТА - этилендиаминтетраацетат
Ас - ацетат
М.В. - молекулярный вес в дальтонах
ПААГ - полиакриламидный гель
УФ - ультрафиолет
РФ - двуцепочечная репликативная форма ДНК
РФІ - ковалентно замкнутая суперспирализованная РФ ДНК
п.о. - пары оснований
Ар - ампициллин
Тс - тетрациклин
ЭМС - эозин и метиленовый синий
Введение к работе
Ключевой стадией транскрипционного цикла является взаимодействие молекулы РНК-полимеразы с промотором, расположеннъм в начале каждой единицы транскрипции (транскриптона). Это взаимодействие предшествует стадии инициации, и от него зависит, начнется или нет синтез РНК на транскриптоне. При этом, скорость инициации зависит от нуклеотидной последовательности промотора, и, следовательно, эффективность транскрипции, а в целом и экспрессия гена или группы генов определяется главным образом структурой промотора.
Взаимодействие РНК-полимеразы с различными промоторами лежит в основе почти всех известных механизмов позитивного контроля транскрипции и во многих случаях обусловливает избирательность транскрипции, одним из проявлений которой является дифференциальная активность генов в онтогенезе. Более того, многие механизмы негативного контроля транскрипции реализуются путем нарушения или полного предотвращения контакта РНК-полимеразы с промотором.
С момента возникновения проблемы избирательной транскрипции генов наиболее пристальное внимание ученых привлекают этапы взаимодействия РНК-полимеразы с промотором. После появления надежных методов расшифровки нуклеотидных последовательностей ДНК первостепенное значение приобрел аспект структуры промотора и её связи с функциями. Уже определена первичная структура большого числа разнообразных промоторов, выведены общие закономерности строения промотора, начинают складываться представления о связи между первичной структурой и эффективностью промотора. До недавнего времени об этой связи судили на основании экспериментов в очищенных бесклеточных системах. Однако, появление методов генной инженерии дало возможность достоверно оценивать сравнительную "силу" промоторов in vivo.
Основной задачей данной работы является сравнительная оценка in vivo, с применением методов генной инженерии, эффективности трех главных промоторов: А, В и d бактериофага 0ХЇ74 и сопоставление её с эффективностью хорошо изученных промоторов-: G2 фага fd и lacUV5 Е. coli. С помощью этих же методов предстояло проверить локализацию на карте ДНК фага 0ХЇ74 функционально активного промотора В. Кроме того, на примере одного из промоторов (промотора В фага 0X174) было намечено изучить влияние различного числа его копий на эффективность экспрессии контролируемого им оперона.
В результате проделанной работы в двух векторных системах (плазмиды pBRH4 и рНБб8-17 ) получен набор рекомбинантных молекул, содержащих перед -feet- и gal-оперонами промоторы А, В и d фага 0ХЇ74, G2 фага fd и iacUV5 Е. coli. Сопоставление относитель« ной активности исследуемых промоторов in vivo позволило установить, что все промоторы обладают значительной биологической активностью. Наибольшую активность, из всех исследуемых промоторов, проявил промотор d бактериофага 0ХЇ74. Поэтому промотор D может быть рекомендован для экспрессии генов в генетической инженерии.
Уточнена локализация на карте хромосомы фага 0X174 промотора В и показано, что из двух предполагаемых промоторов BI и ВП, локализованных в области фрагментаїш , in vivo функционально активным является только один из них - промотор ВП.
При изучении влияния на экспрессию gal-оперона (плазмида pHD 68-17) числа копий промотора В фага 0ХЇ74 было установлено, что экспрессия gal-оперона в клетках E.coli KS1366 возрастала прямо пропорционально числу встроенных промоторов. При этом, необходимым условием экспрессии gal-оперона является правильная ориентация всех копий промотора.
Практическое значение имеет также созданный в ходе работы новый штамм Е. coli К12 KS1366 (F~",*gal, recA, Tcr), предназначенный для клонирования рекомбинантных ДНК с последующим выявлением функционирующего gal-оперона. Кроме того, разработан новый метод выделения ДНК-полимеразы I Bacillus subtilis, препараты которой целесообразно использовать в работах по генной инженерии вместо фрагмента Кленова ДНК-полимеразы І Е. coli.
