Содержание к диссертации
Введение
Обзор литературы 9
1. Инициация транскрипции вЕ.соїі 10
1.1. Структура РНК-полимеразы. Разнообразие а-субъединиц и их роль в регуляции экспрессии генов 10
1.2. Основные стадии процесса инициации транскрипции 12
1.3. Элементы структуры промоторов, узнаваемых Ест70 14
1.4. Регуляция промоторов, узнаваемых Ес70 19
1.5. Промотор лактозного оперона 21
2. Современные методы конструирования бесплазмидных штаммов-продуцентов 27
2.1. Гомологичная рекомбинация в Е.coli 29
2.2. Интеграция линейных молекул ДНК в гесП и гесВС sbcBC штаммах E.coli 32
2.3. Методы интеграции линейных молекул ДНК в хромосому штамма дикого типа 35
2.4. Использование плазмидной интеграции для введения мутаций в хромосому E.coli 36
2.5. Red- и RecET-зависимая интеграция линейных молекул ДНК 39
2.6. Использование систем сайт-специфической рекомбинации для интеграции, клонирования фрагментов ДНК и удаления генетических маркеров 48
Материалы и методы 55
Бактериальные штаммы, плазмидные и фаговые ДНК 55
Генно-инженерные методики 56
Проведение полимеразной цепной реакции 57
Оценка силы промоторов по устойчивости клеток к хлорамфениколу.Определение активности (3-галактозидазы в экстрактах бактериальных клеток 57
Электрофорез клеточных белков 58
Mu-зависимая интеграция промотора Рь-tac 58
Р1-трансдукция 59
Интеграция линейной ДНК в хромосому штамма E.coli recBC'sbcBC'...60
Электротрансформация клеток E.coli 61
Red-зависимая интеграция линейных фрагментов ДНК 61
Удаление антибиотического маркера из хромосомы E.coli К12 с
использованием функций Int/Xis фага X 62
Результаты и обсуждение 63
1. Клонирование известных и создание новых регуляторных элементов E.coli и
исследование их свойств 63
1.1. Создание вектора для клонирования промоторов 63
1.2. Клонирование промоторов, узнаваемых РНК полимеразой (Еа70) E.coli, и оценка их силы 65
1.3. Молекулярное клонирование и оценка относительной эффективности р-независимых терминаторов транскрипции - terjhrL и ter rrnB 67
1.4. Конструирование новых промоторов и исследование их свойств 70
1.4.1. ПрОМОТОрЫ Ptoc-ideal И Pfrc-ideal 70
Конструирование гибридных промоторно-операторных элементов .71
Исследование свойств новых промоторов 72
1.4.2. Промотор PL-/0C 83
1.5. Создание плазмид-помощников pACYCPiaclacI и PACYCPLCIIS 85
2. Создание и использование удобных интегративных систем 87
2.1. Удаление генетического маркера с использованием функций Int и Xis фага Я 87
2.2. Получение немаркированных делеций с использованием продуктов генов Red-системы и int/xis бактериофага А, 92
2.3. Модификация нативной регуляторной области целевого гена в бактериальной хромосоме с использованием раз Int/Xis-Red-зависимой системы 96
2.3.1. Замена нативной регуляторной области на известный прокариотический промотор 97
2.3.2. Оптимизация экспрессии целевого хромосомального гена путем использования синтетического промотора с вырожденной последовательностью области «-35» 99 Определение коэффициента репрессии новых промоторов, полученных в результате варьирования области «-35» промотора Р/ас .104
Выводы 107
Список цитируемой литературы 108
- Структура РНК-полимеразы. Разнообразие а-субъединиц и их роль в регуляции экспрессии генов
- Оценка силы промоторов по устойчивости клеток к хлорамфениколу.Определение активности (3-галактозидазы в экстрактах бактериальных клеток
- Клонирование промоторов, узнаваемых РНК полимеразой (Еа70) E.coli, и оценка их силы
- Оптимизация экспрессии целевого хромосомального гена путем использования синтетического промотора с вырожденной последовательностью области «-35» 99 Определение коэффициента репрессии новых промоторов, полученных в результате варьирования области «-35» промотора Р/ас
Структура РНК-полимеразы. Разнообразие а-субъединиц и их роль в регуляции экспрессии генов
Промоторы - участки ДНК, с которых РНК-полимераза инициирует транскрипцию. На эффективность этого процесса влияет последовательность участка ДНК длиной порядка 100 нуклеотидов. Основные участки, присутствующие в промоторах, узнаваемых Ее , и схема их контактов с РНК полимеразой изображены на Рис 1. Внутри промоторной ДНК принято выделять "ядро" промотора, включающее старт инициации транскрипции (позиция +1) и два консервативных гексамера (так называемые области "-10" и "-35"), разделенные спейсером.
В результате статистического анализа последовательностей примерно 300 промоторов E.coli, узнаваемых Ее70 (Harley, Reynolds, 1987; Lisser, Margalit, 1993) было показано, что большинство промоторных последовательностей имеет от 7 до 12 совпадений с консенсусными гексамерами "-10" (ТАТААТ) и "-35" (TTGACA), и были определены частоты встречаемости указанных нуклеотидов в рассматриваемых позициях. In vivo сила промотора, т.е. количество транскриптов, синтезируемых с него в единицу времени, коррелирует со степенью гомологии данного промоторного элемента консенсусным последовательностям. В данном контексте, т.е. при неизменных фланкирующих последовательностях, мутации, увеличивающие степень гомологии промотора с консенсусными гексамерами, приводят к увеличению силы промоторов и наоборот (Harley, Reynolds, 1987; Szoke, et al, 1987).
В то же время, степень гомологии с консенсусом является далеко не единственным фактором, определяющим силу промотора. Широко используемый в биотехнологии гибридный промотор Ptac имеет консенсусные области "-10" и "-35", однако это не самый сильный промотор. Промотор А1 фага Т7 в несколько раз сильнее, чем Ptac, хотя в трех позициях не совпадает с консенсусом (Deuschle et al., 1986). Известна группа промоторов E.coli, для функционирования которых не требуется наличие области "-35" (Ponnambalam et al, 1986; Keilty, Rosenberg, 1987). Такие промоторы имеют консенсусную область "-10" и основания Т и G в положениях -15 и -14 соответственно {Burr et al, 2000). В этой работе путем вариации последовательности, расположенной непосредственно перед областью "-10" было показано, что присутствие TG в указанных положениях приводит к увеличению силы промотора. Наличие дополнительной TG последовательности в положениях -17 и -16 усиливало этот эффект. Правильно расположенный "TG-мотив" обнаруживается примерно в 20% промоторов E.coli. По-видимому, с участком ДНК, содержащим "TG-мотив" взаимодействует область 2.5 а70-субъединицы (Вате et al, 1997).
Длина спейсера между "-10" и "-35" может сильно изменять эффективность инициации транскрипции (Ayers et al, 1989; Mulligan et al., 1985). Длина спейсера у разных промоторов варьирует от 15 до 21 п.н. и чаще всего составляет 17 нуклеотидов. Влияние на силу промотора оказывает не только длина, но и нуклеотидная последовательность спейсера. Так, в работе (Jensen, Hammer, 1998) осуществлено создание библиотеки промоторов с консенсусними областями "-10" и "-35" и рандомизированной последовательностью спейсера, имеющего длину 17 п.н. Показано, что вариация последовательности спейсера приводит к изменению силы промотора по крайней мере в 400 раз.
У многих промоторов сайт инициации транскрипции имеет последовательность С(-1)А(+1)Т(+2) (Hawley, McCluer, 1983).
Предпочтительным началом транскрипции являются АТФ или ГТФ, но не ЦТФ. Использование ЦТФ в качестве стартового нуклеотида может приводить к снижению уровня транскрипции или к смещению сайта инициации транскрипции на одну позицию (Liu, Turnbough, 1994). По-видимому, этот эффект связан со сниженным сродством РНК-полимеразы к ЦТФ (Wu, Goldthwait, 1969). Указанный эффект компенсируется в условиях высокого пула ЦТФ в клетке. На этом основана регуляция экспрессии некоторых генов. Так, промоторы генов pyrC E.coli (Liu, 1994) и ругС и pyrD Salmonella typhimurium (Sorensen, et al, 1993) инициируют транскрипцию с ЦТФ в случае высокого внутриклеточного пула пиримидинтрифосфатов, а при низком пуле - с ГТФ, смещенного на несколько позиций в область "downstream". Инициацитранскрипции этих генов с ЦТФ приводит к образованию шпильки на 5 -конце мРНК, которая в свою очередь мешает трансляции.
Оценка силы промоторов по устойчивости клеток к хлорамфениколу.Определение активности (3-галактозидазы в экстрактах бактериальных клеток
В работе были использованы следующие бактериальные штаммы E.coli К12: MG1655 - штамм E.coli дикого типа с полностью установленной первичной структурой хромосомальной ДНК (Blattner F.R.. et al, 1997; htpp://www.genetics.wisc.edu/ и htpp://mol.genes.nig.ac.jp/ecoli/) из коллекции ВКПМ; НВ101 (supE44, /шШ0(гв", mBl, гесАІЗ, ara-14, proA2, lacYl, galKl, ІеиВб, rpsL20, xyl-5, mtl-1), Y1084 (araD, supF, trpCr.TnlO, mcrA, rglA, MlacI-lacZYA)), TGI (supE, hsd, tin, Mlac-proAB), J[traD36, proAB+, lacft, /acZAM15]) -хорошо известные лабораторные штаммы, полученные из коллекции ВКПМ, и использованные для создания и изучения свойств рекомбинантных плазмид; JM110 {dam, dcm, supE44, hsdRU, thi, leu, rpsL, lacY, galK, galT, ara, tonA, thr, tsx, A(lac-proAB), V\traD36, proAB+, lacft, lacZAM15] - штамм из коллекции лаборатории, используемый в качестве реципиента в том случае, когда для работы с соответствующими молекулами рекомбинантных плазмид требовалось иметь ДНК, неметилированную системой dam E.coli; DB1979 (lacZ: :Tn5) - из коллекции ВКПМ; RR1 {supE44, hsdS20(rB , mBl, ara-14, proAl, galKl, ІеиВб, rpsL20, xyl-5, mtl-1) - из коллекции ВКПМ; RRl-lacZ (supE44, /isrf520(rB , гав"), ara-14, proA2, galKl, ІеиВб, rpsL20, xyl-5, mtl-1, lacZv.TnS) - создан путем стандартного переноса мутации lacZT из штамма DB1979 в RR1 методом общей трансдукции бактериофагом Р1 с селективным отбором целевого штамма на среде с канамицином (соответствующий ген устойчивости к антибиотику расположен в составе транспозона Тп5). Данный штамм, сконструированный и любезно предоставленный нам к.б.н. В.Г.Дорошенко, был использован в качестве одного из реципиентов при исследовании полученных в ходе работы рекомбинантных плазмид с гибридными промоторами; BW25113 (lacf1, ггпВти, A/acZwjie, hsdR514, AaraBADAim, ArhaBADLDls) -использовался в качестве удобного реципиента для проведения Red-зависимых интеграции. JC7623 (recB21, recC22, sbcBIS, sbcC201, thrl, ІеиВб, MsG4, argE2, thi-1, S.(gpt-pro), aral4, galK2, xyl5, mel-1, lacYl, tsk33, supE44, 1-, rec-, rfbDl, rpsHl, kdgKSl, JilvAnCm) В работе использованы созданные ранее, а также коммерчески доступные векторные и рекомбинантные плазмиды и бактериофаги Е.соИ из коллекции лаборатории: PML2.1 {Машко СВ. и др., 1985), pDR540 (GenBank/EMBL accession number U13847, "Pharmacia", США), pKK233-2 (GenBank/EMBL accession number U02439, "Pharmacia", США) -использованные в качестве матриц, содержащих промоторы P/acuvs, Рлю Р/«-, соответственно, для проведения ПЦР с последующим клонированием указанных промоторов. Плазмида рКК233-2 использовалась также в качестве матрицы при ПЦР для амплификации участка ДНК, содержащего терминатор транскрипции ter_rrnB; pUC-4K (GenBank/EMBL accession number X06404, "Pharmacia", США) -использовалась в качестве матрицы для амплификации структурной части гена устойчивости к канамицину, кап, с собственным участком связывания рибосом (RBS); pUC19 (GenBank/EMBL accession number L09137, "Fermentas", Литва) -использовалась в качестве матрицы для выделения фрагмента ДНК с геном ApR (не содержащим сайта расщепления рестриктазой PstI), необходимого для конструирования целевых рекомбинантных плазмид (см., ниже); pML24 (Метко СВ. и др., 1987), pACYC184 (GenBank/EMBL accession number X06403, "Fermentas", Литва), pMW118, pMW119 (GenBank/EMBL accession number AB005475) -использованные в качестве векторов для конструирования рекомбинантных ДНК, pPR53 (Машко и др., 1987), ДНК бактериофага X (GenBank/EMBL accession number NC_001416, "Fermentas", Литва), ДНК бактериофага Т7 (GenBank/EMBL accession number NC_001604,). Генно-инженерные методики. Конструирование, выделение и рестрикционный анализ рекомбинантных плазмид, проведение Са -зависимой трансформации клеток Е.соИ осуществлялись в соответствие с общепринятыми экспериментальными протоколами (Sambrook J., Fritsch E., Maniatis Т., 1989). В работе использовались коммерчески доступные препараты рестриктаз, Т4-ДНК лигазы и фрагмента Кленова ДНК-полимеразы I E.coli ("Fermentas", Литва).
Проведение полимеразной цепной реакции. ПЦР проводилась на амплификаторе «Perkin-Elmer 2400 GeneAmp PCR System». Реакционная смесь, общим объемом 50 мкл, обычно состояла из: 5мкл Юх ПЦР-buffer ("Fermentas", Литва) с добавлением MgCh до конечной концентрации 1,5 мМ в реакционной смеси, 200 мкМ каждого dNTP, 400 нМ каждого из олигонуклеотидных праймеров и 2ед. Taq-полимеразы ("Fermentas", Литва). Количество ДНК, используемой в качестве матрицы для амплификации, добавлялось в реакционную смесь из расчета 0,2 нг целевого гена. В большинстве случаев использовался следующий температурный профиль проведения реакции: первичная денатурация 5 минут при +95С; затем 20 циклов: денатурация +95С -30 сек, отжиг +5 5 С - 30 сек, элонгация при +72С; заключительная достройка 2 мин при +72С. Время элонгации выбиралось в соответствии с рекомендациями производителя Taq-полимеразы в зависимости от длины амплифицируемого фрагмента. Амплифицированные фрагменты ДНК очищали путем электрофореза в агарозном геле и выделения соответствующей зоны из легкоплавкой агарозы.
Оценка силы промоторов по устойчивости клеток к хлорамфениколу. Для грубой оценки силы промоторов рекомбинантные плазмиды с прокариотическими промоторами pML-Px (Рис.9) трансформировали в штамм E.coli НВ101 с высевом на чашки с L-агаром (Юг/л NaCl, 5г/л дрожжевого экстракта, Юг/л триптона, 1,5% агара) с добавлением Ю0мкг/мл ампициллина. Выросшие в течение ночи колонии перепечатывали на чашки с L-агаром, содержащим различные концентрации хлорамфеникола. Для каждого промотора брали как минимум пять независимых клонов. Чашки инкубировали в течение ночи при +37 С, после чего для каждого промотора определяли максимальный уровень устойчивости клеток к хлорамфениколу. Определение активности 3-галактозидазы в экстрактах бактериальных клеток.
Плазмидные штаммы выращивали на среде Лурия-Бертани (Miller J.H., 1972) с добавлением ампициллина (100 мкг/мл). Если не указано иначе, для определения ферментативной активности ночную культуру бактериальных клеток разводили в 100 раз свежей питательной средой с антибиотиком, культивировали при +37С при интенсивной аэрации до OD6oo=l, после чего добавляли IPTG ("Sigma", США) до концентрации 0,4мМ и продолжали культивирование в течение 2 часов. Измерение активности Р-галактозидазы проводилось по стандартному методу {Miller J.H., 1972); использовавшийся для этого о-нитрофенил-р-О-галактопиранозид являлся коммерческим препаратом "Sigma" (США). Электрофорез клеточных белков. Анализ бактериальных белков осуществляли электрофорезом в 10%-ном ПААГ с 0,1% SDS по методу Лэммли (Laemmli V.K., 1970). Образцы для электрофореза суммарных клеточных белков готовили стандартным способом, согласно протоколу "LKB" (Швеция). Количественное определение содержания синтезированных в клетке белков проводили сканированием электрофоретического геля, прокрашенного в растворе Coomassi blue R-250, на денситометре CDS-200 ("Beckman", США).
Mu-зависимая интеграция промотора Рыас Для проведения Mu-зависимой интеграции промотора Рьac в хромосому E.coli мы использовали интегративный вектор pMD4041, полученный на основе вектора pUC 19 и несущий мини-Mu Mud4041 (Castilho et al, 1984), который был любезно предоставлен нам Ахвердяном В.З., и плазмиду-помощник phMIV-1, сконструированную на основе вектора pACYC184 и несущую гены интегразы МиАВ под контролем собственного промотора и ген термочувствительного репрессора MuCts62 фага Ми (любезно предоставлена Смирновым СВ.). При конструировании плазмиды phMIV-І ген устойчивости к хлорамфениколу из вектора pACYC184 был удален и полученная плазмида несет только ген устойчивости тетрациклину.
Клонирование промоторов, узнаваемых РНК полимеразой (Еа70) E.coli, и оценка их силы
Как видно из Рис. 11, используя полученную коллекцию промоторов в экспериментах по генно-инженерному конструированию, можно обеспечить различные уровни конститутивной транскрипции целевого гена. Однако, только 4 промотора из этой коллекции (P/acuvs? P a« P r« PL) могут быть использованы для достижения регулируемой экспрессии. Сильный ранний промотор A,PL может индуцироваться при повышенной температуре в присутствие термочувствительного репрессора фага X (например, CIts857). Однако, как хорошо известно (Deuschle et al., 1986), а также непосредственно следует из наших данных (см. Рис. 11), PL - один из самых сильных промоторов, узнаваемых Ес70, и подходит, главным образом, в тех случаях, когда оптимизация экспрессии гена сводится к ее максимизации. Три другие промотора из нашей коллекции (P/acUVSi Pfao Pfrc) ШИрОКО ИСПОЛЬЗуЮТСЯ ДЛЯ обеСПЄЧЄНИЯ регулируемой экспрессии генов: в присутствие лактозного репрессора данные промоторы индуцируются IPTG или лактозой. P/acuvs является строго регулируемым, но достаточно слабым промотором. Созданные в начале 80-х годов гибридные регуляторные элементы Р,дс (Russell & Bennett, 1982) и Ytrc (Brosius et al, 1985), содержащие на оптимальном расстоянии друг от друга канонические области «-10» (ТАТААТ) и «-35» (TTGACA), соответственно промоторов лактозного (P/acuvs) и триптофанового (Pfrp) оперонов E.coli, а также природный оператор О/ас, по эффективности инициации транскрипции занимают среднее положение между P/acuv5 и PL- Однако, по своей способности к взаимодействию с Lad и тем самым по «строгости регуляции» транскрипции эти гибридные регуляторные элементы значительно уступают природному промотору лактозного оперона E.coli. Причиной этого является кооперативное взаимодействие лактозного репрессора с операторными участками, входящими в регуляторный район лактозного оперона (Oehler et al, 1990), и наличие лишь одного из них (0/це) в составе гибридных промоторов. Часто используемый промотор P/acuvs имеет в своем составе два нативных операторных участка (0/яс и Оз), что обеспечивает ему возможность значительно более эффективного взаимодействия с Lad, чем при репрессии Ytac и V,rc. Следствием снижения уровня репрессии в этом случае является высокий базальный уровень транскрипции генов, контролируемых гибридными промоторами, и невозможность создания на их основе рекомбинантных ДНК с генами токсичных для бактериальной клетки белковых продуктов. Поэтому была поставлена задача создания на основе Ртс и Р,гс новых высокоэффективных и, в то же время, строго регулируемых промоторов.
Конструирование гибридных промоторно-операторных элементов.
Структура природных операторов лактозного оперона E.coli (0/яс = Oi, Ог и Оз), являющихся вырожденными палиндромами длиной 21 н.п., и особенности их взаимодействия с тетрамерной молекулой Lad в настоящее время хорошо известны (см., например, (Oehler S. et al, 1990; Mttller-Hill В. 1998). Установлено также, что 20-ти звенный синтетический оператор - 0/ac.ideai, представляющий собой идеально симметричный палиндром, в котором «левая» часть в точности повторяет 10 н.п. природного оператора 0/яс, обладает повышенным примерно на порядок сродством к Lad {Sadler J.R. et al, 1983). Кроме того, показано, что для обеспечения кооперативности взаимодействия Lad с тандемом лактозных операторов необходимо чтобы участки взаимодействия с репрессором (при удалении их друг от друга до 200-300 н.п.) были расположены с одной стороны молекулы ДНК, находящейся в форме В-семейства конформаций, а для этого расстояние между центрами операторов должно быть кратно целому числу витков двойной спирали {Muller J. et al, 1996). Именно эти данные были использованы нами при разработке схемы конструирования новых искусственных регуляторных элементов на основе гибридных промоторов Pfr/ -P/acUV5- В качестве дополнительной к О/ас копии лактозного оператора в составе новых промоторов планировалось использовать 0/ec.ideab а его расположение в искусственных регуляторных элементах (81,5 и 92,5 н.п. между центрами операторов) должно было обеспечивать {Muller J. et al, 1996) оптимум кооперативного взаимодействия с Lad.
Для конструирования гибридных промоторно-операторных регуляторных элементов в нашей работе в качестве доноров исходных Р,ае и Р,гс использовали коммерчески доступные рекомбинантные плазмиды pDR540 и рКК233-2 ("Pharmacia"), соответственно. Интеграция этих промоторов в состав специально сконструированной векторной плазмиды pML-MCS {Машко СВ. и др., 2001) проводилась после амплификации соответствующих фрагментов ДНК с помощью полимеразной цепной реакции при использовании олигонуклеотидных праймеров, имеющих в своем составе сайты узнавания рестриктазами Kpnl и Xbal, которыми расщеплялись как получаемые фрагменты, так и векторная молекула. Предварительно промоторы РГйС и Р,гс , а также промотор P/acuv5, использовавшийся в дальнейшем в качестве контроля, были клонированы в составе вектора pML-MCS. Матрицей для амплификации промотора P/acuv5 послужила плазмида pML2.1. В составе использованных праймеров располагался дополнительный сайт рестрикции Bglll, который обеспечил возможность введения в состав рекомбинантных плазмид химически синтезированного «симметризованного» оператора лактозного оперона - 0/ac.ideai. Две полученные таким образом плазмиды содержали в своем составе новые искусственные промоторно-операторные области P ac-ideai и P/rc-ideai с двумя копиями лактозных операторов. Первичные структуры сконструированных таким образом регуляторных элементов представлены на Рис.7. Точное соответствие нуклеотидных последовательностей полученных промоторов PWc-ideal И P/rc.ideal запланированным было подтверждено в результате секвенирования промоторных областей методом Сэнгера.
Оптимизация экспрессии целевого хромосомального гена путем использования синтетического промотора с вырожденной последовательностью области «-35» 99 Определение коэффициента репрессии новых промоторов, полученных в результате варьирования области «-35» промотора Р/ас
При создании штаммов-продуцентов нередко возникает проблема оптимизации экспрессии того или иного гена, когда есть основания полагать, что низкий уровень экспрессии не обеспечивает достаточного выхода целевого продукта, а слишком высокий уровень может явиться токсичным для клетки. Для оптимизации уровня экспрессии генов, локализованных непосредственно в бактериальной хромосоме, нами был разработан метод, позволяющий путем одноактной Red-интеграции созданного in vitro фрагмента ДНК получать представительные выборки клонов с широким спектром уровней экспрессии интересующего нас цистрона/оперона. Селективный отбор клонов с оптимальным уровнем экспрессии в этом случае мог быть произведен непосредственно по выходу целевого продукта.
Идея этого экспериментального подхода была основана на хорошо известном факте, что в мутантах по области «-35» прокариотических промоторов, узнаваемых Еа70 Е.соН, значительно изменена эффективность инициации транскрипции соответствующих цистронов. Поэтому если в качестве исходного выбрать достаточно эффективный промотор, содержащий каноническую область «-35», то его аналоги, отличающиеся по этому району будут иметь различную (по-видимому, более низкую) «силу».
Для проверки осуществимости такого подхода был проведен модельный эксперимент по рандомизации промоторной области гена lacZ в штамме Е.соН MG1655. В качестве исходного промотора был выбран промотор РМс, имеющий консенсусные области «-10» (ТАТААТ) и «-35» (TTGACA). Фрагмент ДНК, содержащий этот промотор и начало структурной части гена lacZ, был амплифицирован с помощью ПЦР с использованием 5 -концевого «вырожденного» праймера (при синтезе праймера в соответствующей позиции мог оказаться любой из четырех нуклеотидов), содержащего сайт рестрикции Bglll, и 3 -концевого праймера, комплементарного началу структурной части гена lacZ (Праймеры - Pr-Г и Рг-2, Рис. 25). В качестве матрицы для полимеразной цепной реакции использовалась плазмида pMWPtaclacZ (см. выше), а для получения контрольного Рмс проводился ПЦР с праймерами Рг-1 и Рг-2 (Рис. 25). Одновременно с этим была амплифицирована кассета, содержащая фланкированный att-сайтами ген устойчивости к хлорамфениколу (Рис. 20). Использованный для этого 5 -концевой праймер содержал сайт Bglll, а 3 -концевой - включал в себя 36 нуклеотидов, комплементарных области генома, расположенного "up stream" от гена lad (Праймеры 3 и 4, Рис. 25). После обработки полученных фрагментов рестриктазой Bglll и их лигирования была проведена полимеразная цепная реакция с использованием праймеров 2 и 4. Полученный набор фрагментов ДНК содержал кассету с геном CmR и различные варианты промоторов, различающиеся последовательностью четырех центральных нуклеотидов области «-35».
Данная библиотека промоторов была интегрирована с использованием Red-системы фага X в хромосому штамма E.coli MG1655. Аналогично была проведена интеграция контрольного промотора Vtac. В результате этих интеграции ген lad был делетирован, а нативный Р/дс лактозного оперона заменялся на один из Prac-подобных промоторов нашей библиотеки (Рис.26). Выросшие после интеграции колонии были перепечатаны на среду с красителем X-gal, обеспечивающим синюю окраску колоний при наличии в клетках активной р 100 галактозидазы. Клоны с интегрированным контрольным промотором (ас были темно-синего цвета, а окраска 100 проанализированных колоний, полученных после интеграции библиотеки, варьировала от белой до темно-синей. Было отобрано 24 клона, имевших окраску разной интенсивности и измерена активность Р-галактозидазы для этих клонов и бактерий, содержавших в соответствующем месте хромосомы - Р,ас (см., Рис. 26). Поскольку мы варьировали только область «-35», можно было предполагать, что стартовая точка транскрипции мРНК р-галактозидазы во всех этих вариантах одинакова и активность LacZ в полученных интегрантах прямо пропорциональна эффективности инициации транскрипции с каждого из полученных промоторов. В дальнейшем выделенные с помощью ПЦР фрагменты ДНК хромосом интегрантов, содержащие некоторые из полученных таким способом Р,ЙС-подобных промоторов, были секвенированы по методу Сенгера. Полученные результаты приведены в Табл. 5 (приведены данные по определению активности LacZ только для тех из полученных промоторов, для которых была определена нуклеотидная последовательность).
Из Таблицы 5 видно, что описанный метод действительно позволяет достаточно плавно варьировать эффективность транскрипции целевого гена в широких пределах (экспериментально зарегистрированное различие в уровнях синтеза LacZ в случае наиболее «слабого», но достоверно функционального из проверенных промоторов по сравнению с Р,яс составляло не менее 2 порядков величины). При этом при «рандомизации» преимущественно получаются относительно слабые промоторы, что при модификации существенной для функционирования промотора области «-35» не удивительно. Действительно, общее количество возможных «рандомизированных» вариантов в нашем случае 44=256. Из них число промоторов, отличающихся от консенсуса по 1 позиции равно 12, по двум - 54, по трем позициям - 108 и по всем четырем -81. Таким образом, из 256 возможных вариантов промоторов 199 отличаются от исходного Ytac тремя или четырьмя позициями.
