Введение к работе
Актуальность темы. Роль антител в различных областях медицины трудно переоценить С развитием генетической инженерии стало возможным создание рекомбинантных производных моноклональных антител (МКА) К ним относятся химерные и гуманизированные AT, которые в настоящее время применяют в терапии различных заболеваний Однако, несомненным является тот факт, что предпочтительнее использовать в терапии полностью человеческие молекулы иммуноглобулинов
В настоящее время источником для получения полноразмерных антител человека могут являться сыворотка крови человека, гибридомы на основе В-клеток человека и трансгенные мыши Однако, существует ряд ограничений в использовании этих источников для получения препаратов терапевтических антител В то же время получение антител человека возможно с использованием методологии фагового дисплея Несомненным преимуществом применения комбинаторной технологии является отсутствие необходимости использования лабораторных животных, относительная простота в исполнении, а также возможность скрининга большого количества кандидатных молекул за более короткий промежуток времени Из комбинаторных библиотек возможен отбор мини-антител человека против широкого круга антигенов, включая особо опасные вирусы Объединение в дальнейшем вариабельных доменов отобранных мини-антител с константными доменами иммуноглобулинов человека в экспрессионных векторах позволяет получать полноразмерные антитела человека
Целью данной работы являлось получение на основе методов фагового дисплея одноцепочечных антител человека против инфекционного вируса натуральной оспы, штамм Ind-За, конструирование и характеризация полноразмерных антител человека против ортопоксвирусов
Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи
- отобрать из синтетической комбинаторной библиотеки одноцепочечные
антитела человека против инфекционного вируса натуральной оспы, штамм Ind-За,
- исследовать иммунохимические и вируснейтрализующие свойства
отобранных антител,
сконструировать полноразмерные антитела человека на основе одноцепочечных антител против ортопоксвирусов,
исследовать иммунохимические и вируснейтрализующие свойства полученных полноразмерных антител
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые получены одноцепочечные антитела человека против вируса натуральной оспы, штамм Ind-За Определены аминокислотные последовательности полученных антител Исследовано связывание антител с различными ортопоксвирусами, включая различные штаммы вируса натуральной оспы
Получены штаммы Esherichm coli, продуцирующие растворимые одноцепочечные антитела slF4, slI6 и s2I19 специфично взаимодействующие с ортопоксвирусами Исследованы особенности продукции этих антител в клетках Б coli
Получены рекомбинантные плазмидные ДНК, pCHlF4 и pCLlF4, рСНПб и рСІЛІб, рСН2П9 и pCL2I19, рСНЬ9 и pCLb9, обеспечивающие продукцию в клетках млекопитающих полноразмерных человеческих антител класса IgGl, специфично взаимодействующих с ортопоксвирусами Антитела fhb9 и fhlF4 способны нейтрализовать инфекционность вируса осповакцины на культуре клеток УегоЕб В случае антитела fhlF4 вируснейтрализующие свойства проявлялись только при совместной инкубации с сывороткой невакцинированного донора.
Антитело fhb9 после проверки противовирусных свойств в модельных экспериментах на животных, могло бы представлять интерес для создания на его основе иммунопрофилактического средства, а также терапевтического препарата предупреждающего развитие поствакцинальных осложнений, и возможно, лечения ортопоксвирусных инфекций
Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 3 статьи, получено два положительных решения о выдаче авторского свидетельства Материалы диссертации были представлены на 11 Международных конференциях 16-ой Международной конференции «Antiviral research» (Саванна, США, 2003), 17-ой Международной конференции «Antiviral research» (Туксон, США, 2004), 18-ой Международной конференции "Antiviral research" (Барселона,
Испания, 2005), 6th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology, (Пущино, Россия, 2002), 7th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology (Москва, Россия, 2005), на XIII Международном вирусологическом конгрессе (Париж, 2002), 31-st FEBS Congress, Molecules m health and Disease (Стамбул, Турция 2006) VII Межгосударственная научно-практическая конференция (Оболенск, Россия 2006), 6* 7th и 8th Meetings of the WHO Advisory Committee on Variola Virus Research (Женева, Швейцария, 2004, 2005 и 2006), и 1 Российской конференции Научная конференция «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2002)
Вклад автора. Все эксперименты и анализ полученных данных сделаны лично автором В исследованиях, проводимых с использованием инфекционного вируса натуральной оспы в условиях специальной лаборатории с уровнем защиты BSL 3-4, вместе с автором принимали участие А А Гуськов, Е Б Сокунова, Е В Жираковская, В В Морозова, Е И Бовшик, Н В Тикунова Тестирование антител на наличие вируснейтрализующей активности проводилось в лаборатории общей вирусологии, руководитель к м н Е Ф Беланов, в тестировании антител вместе с автором принимали участие НИ Бормотов и ЗФ Киселева Конструирование полноразмерных антител и эксперименты по эукариотической экспрессии проводились совместно с сотрудниками лаборатории инженерии белка и группы экспрессии белковых факторов роста и дифференцировки института Биоорагнической химии им М М Шемякина и Ю А Овчинникова РАН г Москва кхн ЛН Шингаровой и к б н ИВ Мерсияновой.
Объем и структура диссертации. Диссертация изложена на 120 страницах машинописного текста, включая 23 рисунка и 6 таблиц, состоит из введения, обзора литературы, описания материалов и методов, результатов, обсуждения, выводов и списка цитируемой литературы (148 наименований)
