Содержание к диссертации
Введение
ГЛАВА 1. Обзор литературы 11
1.1 Структура иммуноглобулинов и их генов 11
1.1.1 Структура антител 11
1.1.2 Гены иммуноглобулинов 14
1.1.3 Реорганизация генов иммуноглобулинов в ходе дифференцировки В-лимфоцитов 16
1.2 Получение фрагментов антител человека с помощью фагового дисплея 17
1.2.1 Фаговый дисплей 18
1.2.1.1 Фрагменты антител, используемые для фагового дисплея 19
1.2.1.2. Фаги, используемые для дисплея фрагментов антител 19
1.2.2 Комбинаторные библиотеки антител человека 25
1.2.2.1 Конструирование наивных библиотек..., 27
1.2.2.2 Конструирование синтетических библиотек 31
1.2.2.3. Конструирование иммунных библиотек * 37
1.2 J Заключение к п. 1.2 42
1.3 Ортопокс вирусы 42
1.3.1 Иммунный ответ при ортопоксвнрусной инфекции 43
1.3.1.1 Клеточный иммунный ответ 43
1.1.2 Гуморальный иммунный ответ 44
ГЛАВА 2. Материалы и методы 49
2.1 Реактивы и материалы 49
2.1.1 Реактивы 49
2.1.2 Растворы 50
2.1.3 Ферменты 50
2.1.4. Культуральные среды 50
2.1.5. Эукариотическис клетки, бактерии и бактериофаги 51
2.1.6. Вирусы 51
2.1.7. Используемые олиго ну клеотиды 51
2.2 Методы
2.2.1 Выделение периферических лимфоцитов из крови доноров 53
2.2.2 Выделение суммарной РНК из лимфоцитов периферической кров и..53
2.2.3 Синтез кДНК 53
2.2.4 Амплификация VH- и VL-генов, кодирующих вариабельные домены тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов 54
2.2.5 Конструирование линкера и объединение его VH- и VL-гснами в ДНК-последовательности, кодирующие одноцепочечные антитела человека 54
2.2.6 Встраивание scFv-гснов в векторную фагмиду pHEN2 56
2.2.7 Приготовление компетентных клеток TG1 57
2.2.8 Электропорация 57
2.2.9 Амплификация библиотеки 57
2.2.10 Аффинное обогащение библиотеки специфичными фаговыми антителами 58
2.2.11 Выделение фаговых одноцепочечных антител 59
2.2.12 Дот-блот анализ на нптроцеллюлозиых фильтрах 59
2.2.13 Иммунофермептный анализ 60
2.2.14 Выделение фагмидной ДНК методом щелочного лизиса 60
2.2.15 ПДРФ-аиализ отобранных scFv 61
2.2.16. Трансформация клеток Е. соїі фагмидной ДНК 61
2.2.17 Анализ экспрессии scFv AT в растворимой форме отдельными клонами библиотеки 61
2.2.18 Электрофорстический анализ белков 62
2.2.1? Вестерн-блот анализ 62
2.2.20 исследование вируснейтрализующей активности фаговых антител 62
2.2.21 Методика очистки одн оцеп очечных антител в растворимой форме на Ni-NTA сорбенте 63
2.2.22 Определение констант аффинности одноцепочечных антител 63
2.2.23. Очистка ортопоксвирусных препаратов 65
2.2.24 Выделение ДНК вируса оспы коров 65
2.2.25 Получение гибридного рекомбинантного белка prJ3L ВОК с использованием экспрсссирующего вектора pUR291 66
2.2.26 Определение нуклеотидных последовательностей генов, кодирующих вариабельные домены иммуноглобулинов 66
ГЛАВА 3. Результаты 68
3.1 Конструирование иммунной комбинаторной библиотеки scFv AT человека против ортопоксвиру сов 68
3.1.1 Тестирование способности антител сывороток иммунных доноров связывать ВОВ 68
3.1.2 Конструирование комбинаторной иммунной библиотеки scFv AT человека 70
3.1.3 Оценка функционального размера библиотеки 72
3.2 Отбор из комбинаторной иммунной библиотеки вируснейтрализующих
scFv AT, специфичных к белку ргАЗОЬ, и исследование их свойств 74
3.2.1 Аффинное обогащение комбинаторной иммунной библиотеки клонами, продуцирующими scFv AT, специфичные к белку ргАЗОЬ 74
3.2.2 Оценка вируснейтрализующей активности популяции фаговых антител, полученной после аффинного обогащения комбинаторной иммунной библиотеки против белка ргАЗОЬ 75
3.2.3 Отбор из обогащенной комбинаторной иммунной библиотеки клонов, продуцирующих scFv AT, специфичные к ргАЗОЬ 76
3.2.4 Исследование вируснейтрализующих свойств фаговых анти- ргАЗОЬ антител 79
3.2.5 Исследование свойств вируснейтрализующих фаговых анти-ргАЗОЬ антител 80
3.2.6 Определение аминокислотной последовательности вируснейтрализующих scFv AT, специфичных к белку ргАЗОЬ 81
3.3 Отбор из комбинаторной иммунной библиотеки вируснейтрализующих scFv AT, специфичных к ВОК, и исследование их свойств 82
3.3.1 Аффинное обогащение комбинаторной иммунной библиотеки клонами, продуцирующими scFv AT, специфичные к ВОК 82
3.3.2 Оценка вируснейтрализующей активности популяции фаговых антител, полученной после аффинного обогащения комбинаторной иммунной библиотеки против ВОК 84
3.3.3 Отбор из обогащенной против ВОК комбинаторной иммунной библиотеки клонов, продуцирующих scFv AT, специфичные к ВОК 85
3.3.4 Исследование вируснейтрализующих свойств фаговых антител, продуцируемых отобранными против ргАЗОЬ и ВОК клонами 86
3.3.5 Исследование свойств отобранных анти-ВОК антител 88
3.3.6 Определение аминокислотной последовательности scFv AT, специфичных к ВОК 88
3.3.7 Получение растворимых scFv AT 95
3.3.8 Определение константы аффинности растворимого scFv AT Ь9 96
3.4 Определение белка мишени для вируснейтрализующих scFv AT,
специфичных к ВОК 97
3.4.1 Получение штамма E.coli, продуцирующего рекомбкнантный белок prJ3L ВОК (штамм Гришак) 97
3.4.2 Исследование способности фаговых антител, нейтрализующих ВОК, связывать prJ3L 100
Глава 4. Обсуждение результатов 102
Конструирование и характеризация библиотеки 102
Отбор антител против рекомбинантного белка prA30L 104
Отбор антител против ВОК 107
Оценка аффинности отобранных вируснейтрализующих scFv антител 112
Определение белка мишени для вируснейтрализующих анти-ВОК scFv ATI 13
Выводы 117
Список литературы 118
- Реорганизация генов иммуноглобулинов в ходе дифференцировки В-лимфоцитов
- Аффинное обогащение библиотеки специфичными фаговыми антителами
- Оценка вируснейтрализующей активности популяции фаговых антител, полученной после аффинного обогащения комбинаторной иммунной библиотеки против белка ргАЗОЬ
- Исследование вируснейтрализующих свойств фаговых антител, продуцируемых отобранными против ргАЗОЬ и ВОК клонами
Введение к работе
Благодаря своей высокой специфичности и широкому спектру связываемых антигенов, антитела нашли широкое применение в фундаментальных исследованиях, медицине и биотехнологии. Но, если в качестве диагностических и аналитических реагентов антитела применяются уже давно и довольно успешно, то применение антител в терапии связано с рядом проблем [1]. Несмотря на разнообразие, только ограниченный набор антител обладает свойствами, подходящими для подобного использования. Так, терапевтические антитела не должны быть иммуногенны и должны иметь длинный период полувыведения из организма человека. К тому же необходимо, чтобы они были устойчивы к агрегации, преципитации и действию протеаз. В соответствии с применением должны учитываться и другие свойства антител: размер, аффинность, эффекторная функция и способность проникать в ткани [2]. Кроме того, необходимо наличие способа их наработки в препаративных количествах.
Открытие Kohler и Milstein гибридомной технологии в 1975 году [3] позволило нарабатывать моноклональные антитела грызунов разной специфичности. С тех пор гибридомы стали основным источником моноклональных антител (МАТ), использующихся в фундаментальных исследованиях и в биотехнологии при создании тест-систем. Но при использовании мышиных МАТ в терапии оказалось, что они имеют ряд недостатков, среди которых короткий период полувыведения, недостаточная активация эффекторньгх функций и, главное, развитие у человека иммунного ответа против мышиных антител, особенно при повторном использовании. Для решения этих проблем были разработаны стратегии, позволяющие с помощью методов генетической инженерии избегать нежелательного иммунного ответа: создание химерных антител путем соединения вариабельных доменов AT мыши с константными доменами человеческих AT, «гуманизация» путем замены CDR и удаление Т-хелперных эпитопов из состава молекулы антитела. Уменьшить степень иммунного ответа, направленного против антител, позволило также использование антител приматов [4].
Тем не менее, полностью человеческие МАТ наиболее ценны для терапевтического применения, поэтому было разработано несколько подходов к их получению из различных источников - человеческих гибридом, трансгенных мышей и in vitro библиотек. Однако, получать стабильные линии человеческих гибридом, продуцирующих высокоаффинные МАТ, удается очень редко по причине отсутствия подходящей клеточной линии человеческой миеломы [5, 6]. Еще одним способом
получения МАТ человека стали трансгенные мыши, у которых собственные гены иммуноглобулинов заменены на человеческие [4, 7]. Но при таком подходе, как и при получении МАТ человека с помощью гибридомной технологии, набор антигенов, против которых могут быть получены антитела ограничен только теми антигенами, которые могут быть использованы для иммунизации, при этом невозможно получить необходимые в терапии антитела против собственных белков человека [4]. Спектр антигенов может быть практически неограничен, если в качестве источника антигенсвязывающих доменов антител использовать комбинаторные библиотеки. В этом случае антигенсвязывающий сайт антитела желаемой специфичности отбирается из огромных репертуаров фрагментов антител, которые экспонированы на поверхности бактериофагов [8] либо с помощью других дисплейных технологий - на рибосомах [9] или дрожжах [10]. При этом существуют различные подходы к созданию комбинаторных библиотек, и выбор того или иного подхода зависит от конкретной задачи.
В последнее время все чаще технологию фагового дисплея стали применять для отбора рекомбинантных антител с целью получения на их основе терапевтических препаратов для лечения инфекционных заболеваний. Кроме того, такие антитела также используют для исследования антигенной природы различных вирусов [11-15].
Одними из наиболее многочисленных и сложноорганизованных представителей царства Vira являются поксвирусы, которые поражают практически все известные таксономические группы животных, начиная от насекомых и кончая млекопитающими, в том числе и человека, при этом большая часть патогенных для человека поксвирусов относится к роду Ортопоксвирусов [16]. Наиболее патогенными для человека являются вирус натуральной оспы, кроме того, генерализованную инфекцию может также вызывать вирус оспы обезьян. Известно, что вакцинация ВОВ, ранее использованная для ликвидации натуральной оспы, приводит к формированию у вакцинированных людей длительного состояния напряженности иммунитета [17, 18]. Но высокий процент осложнений, возникающих в результате классического оспопрививания, особенно у людей с врожденным или приобретенным иммунодефицитом, делает необходимым разработку новых специфических средств профилактики поствакцинальных осложнений. В настоящее время таким средством является сывороточный вакцинный иммуноглобулин (VIG) [19], тем не менее, его применение
сопровождается биологическим риском. Альтернативой VIG могли бы быть протективные моноклональные AT человека против ортопоксвирусов.
Целью данной работы являлось конструирование иммунной комбинаторной фаговой библиотеки scFv антител человека против ортопоксвирусов, отбор из нее вируснеитрализующих антител и исследование их иммунохимических свойств.
Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи:
сконструировать и охарактеризовать комбинаторную иммунную библиотеку одноцепочечных антител человека на основе мРНК лимфоцитов периферической крови доноров, предварительно вакцинированных вирусом осповакцины;
отобрать из сконструированной библиотеки вируснейтрализующие scFv антитела, специфичные к рекомбинантному белку prA30L вируса натуральной оспы, и исследовать их связывание с этим антигеном;
отобрать из комбинаторной иммунной библиотеки вируснейтрализующие scFv антитела, специфичные к вирусу оспы коров, и исследовать их иммунохимические свойства;
определить белок-мишень для вируснеитрализующих scFv антител, специфичных к вирусу оспы коров;
определить аминокислотные последовательности отобранных
одноцепочечных антител.
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые сконструирована иммунная комбинаторная библиотека одноцепочечных антител человека против ортопоксвирусов. Из сконструированной библиотеки впервые отобраны одноцепочечные антитела человека, специфичные к рекомбинантному белку вируса натуральной оспы ргАЗОЬ, способные нейтрализовать вирус осповакцины. Получена панель вируснеитрализующих одноцепочечных антител человека против вируса оспы коров. Сконструирован штамм Escherichia coli, продуцирующий рекомбинантный белок prJ3L вируса оспы коров (штамм Гришак). Показано, что 8 из 10 вируснеитрализующих антител специфически взаимодействуют с рекомбинантным белком prJ3L, а также с его природными аналогами в составе вирионов вируса оспы коров, осповакцины и эктромелии. Получен штамм Escherichia coli, продуцирующий растворимое одноцепочечное антитело Ь9, специфически взаимодействующее с вирусом оспы
коров. Определена константа аффинности одноцепочечного антитела Ь9. Определены аминокислотные последовательности всех полученных антител.
Поскольку в данной работе получены антигенсвязывающие домены антител человека, на их основе в дальнейшем могут быть сконструированы полноразмерные антитела человека. Такие полноразмерные антитела человека, после проверки их противовирусных свойств в модельных экспериментах на животных, могли бы представлять интерес для создания на их основе иммунопрофилактических средств, а также терапевтических препаратов предупреждения поствакцинальных осложнений и, возможно, лечения ортопоксвирусных инфекций.
Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 2 статьи, получено положительное решение о выдаче авторского свидетельства. Материалы диссертации были представлены на 7 Международных конференциях: 6lh, 7th и 8th Meetings of the WHO Advisory Committee on Variola Virus Research (Женева, Швейцария, 2004, 2005 и 2006), 18-ой Международной конференции "Antiviral research" (Барселона, Испания, 2005), 7th John Humphrey advanced summer programme in immunologythe interface between immunology and medicine (Москва, Россия, 2005), Международная конференция «Физико-химическая биология» (Новосибирск, Россия, 2006), Международная конференция "Basic Science for Biotechnology and Medicine" (Новосибирск, Россия, 2006); и 2 Российских конференциях: Ш Российская научная конференция с международным участием «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, Россия, 2006), VII Межгосударственная научно-практическая конференция (Оболенск, Россия, 2006).
Вклад автора. Все эксперименты и анализ полученных данных сделаны лично автором, за исключением тестирования антител на наличие вируснейтрализующей активности, которое проводилось в лаборатории химических антимикробных препаратов, руководитель к.м.н. Е.Ф.Беланов. Вместе с автором в тестировании антител принимали участие Н.И. Бормотов, З.Ф. Киселева и Т.Э. Юн.
Реорганизация генов иммуноглобулинов в ходе дифференцировки В-лимфоцитов
Генные сегменты, кодирующие части легких и тяжелых цепей иммуноглобулинов, находящиеся в зародышевых клетках, не могут транскрибироваться и транслироваться в полные цепи до тех пор, пока они не объединены в функциональные гены. В ходе созревания В-клеток в костном мозге в результате соматической рекомбинации происходит реорганизация генов синтеза тяжелой и легкой цепей иммуноглобулинов, при этом каждая образующаяся клетка синтезирует одну по специфичности тяжелую и одну легкую цепи из множества возможных. Первыми в процесс реорганизации вступают гены тяжелых цепей. На этапе ранних про-В-клеток в результате соматической рекомбинации происходит слияние D- и J-генных сегментов тяжелых цепей. На следующем этапе развития -этапе поздних про-В-клеток - сегмент DJ вступает в процесс объединения с V-генами. Реорганизация генов тяжелых цепей завершается на этапе пре-В-клеток, что сопровождается наработкой ц-цепей и экспонированием их на поверхности клетки. Это сигнал к началу реорганизации генов легких цепей. Объединение V- и J-генных сегментов легких цепей завершается на заключительном этапе дифференцировки в костном мозге - этапе незрелых В-клеток, Разнообразие полученных вариантов генов Ig при этом достигается за счет множественности сегментов зародышевых генов, комбинаторное их соединения, и за счет феномена, называемого неточное соединение. При этом может образовываться более чем 10б комбинаций.
Трансформация незрелых В-клеток с поверхностным IgM в зрелые клетки периферии сопровождается селекцией клонов, продуцирующих иммуноглобулиновые рецепторы, не реагирующие на собственные антигены. Еще не повстречавшиеся с антигеном В-клетки, мигрируют по кровеносным сосудам в В-зоны периферических лимфоидиых органов. После встречи с антигеном происходит селекция клеток по антигенсвязывающей способности их рецепторов. Они дифференцируются в короткоживущие плазматические клетки, которые секретируют большое количество антител, и долгоживущие В-клетки памяти, которые существуют в лимфоузлах, селезенке и костном мозге.
В V-генах антител клеток памяти возникают соматические гипермутации [18]. И при повторной встрече с антигеном снова происходит селекция клонов, продуцирующих высокоаффинные антитела, что подтверждается тем, что константа диссоциации «ранних» антител на два-три порядка выше, чем у «поздних», а гетерогенность антител одной специфичности на раннем этапе иммунного ответавыше, чем на поздних этапах процесса. Таким образом, повторная иммунизация приводит к так называемому «созреванию» аффинности иммунного ответа. Процесс гипермутирования вносит огромный вклад в разнообразие антител, которое, по мнению разных авторов, может достигать 1012 различных вариантов. В среднем VH-гены мутируют чаще, чем VL-гены: 6,1% нуклеотидных замен для VH и 3.9% для VL. В самом деле, 82% В-клеток имеют больше мутаций в VH-, чем в VL-гене. Одним из возможных объяснений этому является то, что помимо гипермутирования, еще одним механизмом «созревания» аффинности является так называемое «рецепторное редактирование». В работе [34] показано, что рецепторное редактирование происходит в зародышевых центрах и В-лимфоцитах периферии, при этом тяжелые цепи Ig образуют пары с разными легкими цепями, что приводит к изменениям в аффинности антител, а именно к ее увеличению. Новые легкие цепи могут быть получены из тех же зародышевых генных сегментов (другой аллели или другого идентичного сегмента той же аллели), из зародышевых сегментов того же семейства, другого семейства (любой аллели) или другого субкласса.
Кроме этого, по мере развития гуморального иммунного ответа в зрелой В-клетке происходят дальнейшие изменения в гене константного домена, приводящие к изменениям изотипа, отвечающего за биологические эффекторные функции молекулы иммуноглобулина, без изменения его специфичности. В самом начале доминирующим изотипом является IgM и очень незначительно представлен IgD. Позднее происходит замена синтеза IgM на IgG, IgA и IgE.A
Зрелые В-клетки содержат хромосомную ДНК, которая больше не идентична зародышевой ДНК. Путем реорганизации генных сегментов, кодирующих вариабельные домены иммуноглобулинов, иммунная система создает репертуар В-клеток, каждая из которых несет иммуноглобулиновый рецептор, способный реагировать только на один антигенный эпитоп, и содержит ген, кодирующий этот рецептор.
Современные технологии получения антител in vitro копируют селекционные стратегии иммунной системы. Одной из таких технологий является фаговый дисплей, который позволяет получать фрагменты антител человека разной специфичности. Гены этих фрагментов могут быть использованы для конструирования полноразмерных антител. Кроме того, очень часто терапевтические препараты, созданные на основе антител, не требуют привлечения их эффекторных функций посредством Fc домена, например, при инактивации цитокинов, блокировании рецепторов или вирусной нейтрализации. Поэтому одна из тенденций в конструировании рекомбинантных антител состоит в уменьшении их размера до минимального фрагмента, сохраняющего как связывающую активность, так и специфичность. Такие фрагменты в некоторых случаях могут быть более предпочтительны из-за их способности лучше проникать в ткани и быстрее выводиться из организма, по сравнению с полноразмерными молекулами антител. Вместе с тем, нужный фрагмент может быть наработан в E.coli или дрожжах, что существенно снижает его стоимость по сравнению с антителами, полученными с использованием культур клеток млекопитающих [4]. К тому же, такой способ наработки позволяет избежать биологической опасности, связанной с применением антител, выделенных из донорской крови.
Фаговый дисплей - это молекулярная техника, с помощью которой чужеродные белки экспонируются на поверхности фаговых частиц. Такие бактериофаги содержат нуклеотидную последовательность экспонируемого на их поверхности белка, и в то же время способны воспроизводиться. Физическая связь между фенотипом и генотипом экспонируемого белка и репликативная способность бактериофага являются основой, на которую опирается вся технология фагового дисплея. Посредством фагового дисплея огромное количество вариантов нуклеотидных последовательностей может быть переведено в популяцию пептидов или белков, которые могут быть протестированы на наличие желаемых свойств. Скрининг библиотек пептидов или белков, эспонированных на поверхности фагов, проводиться с помощью аффинной селекции - процесса, также называемого биопэннииг, в ходе которого фаговые популяции взаимодействуют с антигеном-мишенью. После успешных раундов связывания, отмывок, элюции и амплификации, исходно очень разнообразные фаговые популяции существенно обогащаются фагами, способными связывать данный антиген. В конечном итоге могут быть получены моноклональные фаговые популяции желаемой специфичности. Процедуры ДНК-манипуляций для создания библиотек различных вариантов пептидов или белков, упаковка в фаговые частицы, и последующий биопэннииг являются основным протоколом для всего фагового дисплея, названным «циклом фагового дисплея». Физическая сцепленность пептида и кодирующего его гена позволяет провести секвенирование генной последовательности сразу после выделения интересующего пептида, и эта последовательность может быть использована при проведении дальнейших генных манипуляций [35],
Аффинное обогащение библиотеки специфичными фаговыми антителами
Из фаговых библиотек, обогащенных антителами, специфическими к соответствующим антигенам, отдельные колонии засевали в пробирки с 200 мкл YT 2, содержащей 100 мкг/мл ампицилина и 1% глюкозу. Выращивали культуру Е. coli при постоянном перемешивании при 37С до (Юбоо О.З, после чего инфицировали культуру фагом М13К07, добавляя его в количестве 1:20 (количество бактериальных клеток: количество фаговых частиц, взятых из расчета, что 1 OD6oo-8 бактерий/мл). Инкубировали культуру 30 мин при 37С, затем подращивали 1 час при постоянном перемешивании при 37 С. После этого клетки осаждали центрифугированием в течение 10 мин при 3000 об/мин в центрифуге "Eppendorf". Осадок ресуспендировали в 50 мкл среды YT 2, и полученную фаговую суспензию переносили в 4-5 мл среды YT 2, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 50 мкг/мл канамицшіа. Клетки инкубировали в течение ночи при постоянном перемешивании при 30С. На следующий день клетки E.coli осаждали центрифугированием 10 мин при 10000 об/мин в центрифуге "Eppendorf. К супернатанту добавляли 1/5 объема ПЭГ/NaCl, хорошо перемешивали и в течение 2 часов инкубировали во льду. Затем проводили осаждение фагов центрифугированием 10 мин при 13000 об/мин. Супернатант вместе с остатками ПЭГ тщательно удаляли и ресуспендировали осадок в 50 мкл ФСБР. Для удаления остатков бактериальных клеток пробирки центрифугировали при 5000 об/мин 10 мин. Выход фаговых частиц составлял приблизительно 1013 -10й БОЕ
Нитроцеллюлозный фильтр смачивали раствором антигена с концентрацией 10 мкг/мл, инкубировали 30 мин, затем сушили и инкубировали 30 мин в 5% растворе обезжиренного молока для насыщения сайтов неспецифического связывания. После отмывки ФСБР, на фильтр наносили 10 мкл 1М раствора ИПТГ, затем сушили под ультрафиолетовым излучением 1-2 мин. Готовый нитроцеллюлозный фильтр накладывали на заранее подготовленные чашки Петри с агаризованной средой YT 2, содержащей 100 мкг/мл ампициллина, на которых были высеяны разведения библиотеки, позволяющие получить отдельные колонии. Чашки с фильтрами инкубировали при 37С в течение 1 ч. После чего аккуратно снимали фильтр, смывали с него остатки колоний ФСБР-Твин 0.1% и инкубировали с раствором анти-c-myc моноклоналыюго AT 1 ч при 37С. Связавшиеся молекулы антител выявляли антивидовым конъюгатом щелочной фосфатазы с субстратом на основе 0.5 мг 5-бромо-З-индолил фосфата и 1 мг нитро-тетразолиевого голубого в 3 мл АР-буфера. Реакцию останавливали погружением нитроцеллюлознго фильтра в дистиллированную воду.
Антиген разводили в ФСБР до соответствующей концентрации от 0,8 до 3 мкг/л и сорбировали в лунки полистироловых планшетов («Медполимер», Россия) в течение ночи при комнатной температуре. На следующий день после удаления антигена лунки промывали три раза буфером ФСБР. Участки неспецифического связывания насыщали 3 % раствором БСА в фосфатно-солевом буфере, рН 7,2, при 37С 2 часа. После этого, лунки снова промывали трижды буфером ФСБР, а затем инкубировали 1 час при 37С с выделенными ранее рекомбинантными антителами в буфере ФСБР-Твин 0.1% (при концентрации 10" БОЕ/мл). Промывали трижды буфером ФСБР-Твин 0.1%), затем трижды ФСБР. Образовавшиеся комплексы выявляли инкубацией с поликлональными анти-М13 антителами сыворотки кролика (в разведении 1:16000) в буфере ФСБР-Твин 0.1% с последующим связыванием с антивидовым конъюгатом щелочной фосфатазы. После трехкратной промывки ФСБР-Твин 0.1% и АР-буфером в лунки добавляли хромоген - пара-нитрофенилфосфат (по 1.05 мг) в буфере Трис-HCl, рН 7.2. Клоны, продемонстрировавшие сигнал, значение которого в 2 и более раз превышает контроль иеспецифического связывания и отрицательный контроль, отбирали как-положительные.
Фагмидную двухцепочечную ДНК выделяли из 1 мл культуры при плотности 109 клеток/мл щелочным методом [123] с модификациями. Полученный препарат прогревали в течение 5 мин. при 75С в 2.5М LiCl для освобождения от белковых примесей. ДНК осаждали из супернатанта, добавляя 5 объемов этанола.
ДНК фагмид, выделенную методом щелочного лизиса, использовали в качестве матрицы в реакции амплификации scFv-гена, с использованием праймеров LMB3 и pHEN-SEQ (Таблица 1), и Tag ДНК-полимеразы ("Сибэнзим", Россия) при температуре отжига праймеров 60С, ПЦР-фрагмент из 10 мкл реакционной смеси использовали в реакции ферментативного гидролиза эндонуклеазой рестрикции НаеШ ("Сибэнзим", Россия), Смесь инкубировали 1 ч при 37С, а затем наносили на 6% полиакриламидный гель для анализа результатов.
Трансформацию проводили по ранее описанному методу [124] с модификациями. 1мл клеточной культуры, достигшей плотности Пбоо=0.4-0.6, центрифугировали 1 мин при 4000 об/мин. Осадок ресуспендировали на холоду в 1 мл буфера 1:10 мМ MOPS, IOMMRDCI, рН7.0. Суспензию центрифугировали 1 мин. при 4000 об/мин. Осадок ресуспендировали в буфере 2: 100 мМ MOPS, 10 мМ RbCl, 50 мМ СаС12, рН 6.5, и оставляли во льду на 15 мин. После центрифугирования в течение 40 сек. при 3000 об/мин тщательно удаляли супернатант, ресуспендировали осадок в 0.2 мл буфера 2, добавляли 3 мкл DMSO и не более 10 мкл раствора, содержащего фагмидную двухцепочечную ДНК, Смесь выдерживали во льду в течение 30 мин, затем прогревали 2 мин при 42С, добавляли 1 мл среды 2xYT и выдерживали 60 мин при 37. После чего бактерии высевали на агаризованную среду с соответствующим антибиотиком
Отдельные колонии засевали в пробирки с 2 мл YT 2, содержащей 100 мкг/мл ампициллина и 0,1% глюкозу. Культуру Е. coli выращивали при постоянном перемешивании при 37С до ОВбоо=0.8, после этого проводили индукцию культуры 1 мМ ИПТГ и переносили в 25 мл 2 YT. Клетки инкубировали при постоянном перемешивании при 30С в течение 5 часов. Затем клетки осаждали центрифугированием и инкубировали с лизируюшим буфером для нанесения белковых проб при 95С 5 мин. Полученный клеточный лизат затем фракционировали электрофоретически в 14% полиакриламидном геле с ДСН, переносили на нитроцеллюлозную мембрану ("Millipore", США) согласно [125,126], Методом Вестерн-блот анализа исследовали содержание в клеточных лизатах scFv, выявляя их специфическими анти-C-myc моноклональными AT с последующим связыванием с антивидовым конъюгатом щелочной фосфатазы в разведении 1:4000.
Электрофоретическое разделение белков проводили по Лэммли [125] в прерывистой буферной системе в присутствии 0,1% ДСН в трис-глициновом буфере. Разделяющий гель содержал 0.375М трисНСІ, рН 8.8,0.1% ДСН, 12% акриламид, 1% Т К-метиленбисакриламид (80% объема геля), концентрирующий гель - 0.125М трис-НС1, рН 6.8, 0.1% ДСН, 4% акриламид, 0.5% К -метиленбисакриламид. Белковые пробы наносили на ПААГ в лизирующем буфере для нанесения. Перед нанесением пробы прогревали 5 мин при 95С. Электрофорез вели в режиме 10 В/см. Гель окрашивали в красителе Coomassi Brilliant Blue R-250 в 20% этаноле, 10% уксусной кислоте. Краситель отмывали кипячением в дистиллированной воде.
Белки соответствующих антигенов разделяли электрофоретически в 12% полиакриламидном геле, переносили на нитроцеллюлозную мембрану по методу Towbin соавт. [126], которую после блокирования сайтов неспецифического связывания раствором 3% БСА инкубировали с scFv AT или растворимыми моноклональными антителами. Связавшиеся антитела проявляли поликлональнми анти-М13 антителами сыворотки кролика (в разведении 1:16000), а в случае растворимых - мышиными anti-C-myc МАТ, с последующим добавлением конъюгата щелочной фосфатазы ("Sigma", США) в разведении 1:4000, Визуализацию иммунного комплекса проводили, добавляя 5-бромо-З-индолил фосфат и нитро-тетразолиевый голубой,
Оценка вируснейтрализующей активности популяции фаговых антител, полученной после аффинного обогащения комбинаторной иммунной библиотеки против белка ргАЗОЬ
Известно, что вакцинация ВОВ, использовавшаяся для ликвидации натуральной оспы, приводит к формированию у вакцинированных людей длительного состояния напряженности иммунитета [110, 115]. Но высокий процент осложнений, возникающих в результате классического оспопрививания, особенно у людей с врожденным или приобретенным иммунодефицитом, делает необходимым разработку новых специфических средств профилактики ортопоксвирусных инфекций и терапии поствакцинальных осложнений. В настоящее время таким средством является сывороточный вакцинный иммуноглобулин (VIG) [117], однако его применение сопровождается биологическим риском, что характерно для препаратов, полученных на основе донорской крови. Альтернативой VIG могут быть вируснейтрализующие моноклональные AT человека против ортопоксвирусов. Одним из способов создания таких AT является отбор их вариабельных доменов из комбинаторных библиотек миниантител человека, с последующим объединением их с константными доменами человеческих иммуноглобулинов [132].
Целью данной работы было конструирование иммунной комбинаторной библиотеки scFv AT человека против ортопоксвирусов, и отбор из нее вируснейтрализующих антител.
В качестве источника генетического материала для конструирования библиотеки была использована мРНК клеток лимфоидного ряда четырех доноров, недавно вакцинированных ВОВ. Для того чтобы в создаваемой библиотеке присутствовали AT, возникающие как при первичном, так и при вторичном иммунном ответе, использовали кровь доноров с разным начальным иммунным статусом по отношению к ортопоксвнрусам: двое из них были вакцинированы первично, а двое - ревакцинированы вирусом осповакцины. Исследование специфичности антител, находящихся в сыворотках крови доноров, вакцинированных вирусом осповакцины, показало, что в сыворотках, полученных от трех доноров, присутствовали AT против белка ортопоксвирусов с молекулярной массой около 35 кДа, в сыворотках двух доноров присутствовали AT, связывающие белок молекулярной массой около 14 кДа. Антитела исследуемых сывороток связывались также и с другими белками ортопоксвирусов с молекулярными массами 27,32, 39,62 кДа.
При амплификации VH- и VL-генов был использован набор праймеров, комплементарных концам V-генов тяжелых и легких цепей. Выбор олигонуклеотидов для амплификации был обусловлен первичной структурой VH И VL доменов. Ввиду относительно высокой консервативности участков FRI и 3 -областеЙ J-сегаентов, соответствующие им олигонуклеотиды могут быть использованы в качестве праймеров для амплификации VH- и VL-генов. Праймеры были выбраны из набора, представленного в работе Marks et al. [73], но этот набор был ограничен в пользу тех олигонуклеотидов, которые позволяют амплифицировать гены вариабельных доменов семейств, наиболее широко представленных в организме человека (Таблица 1) [33, 34]. В случае вариабельных доменов тяжелых цепей это были семейства 1, 3 и 5, в случае легких к или X цепей -1,2 и 3 семейства. Кроме того, VH И VL домены выбранных структурных семейств в составе одноцепочечных антител обладают большей термодинамической стабильностью по сравнению с остальными и эффективно экспрессируются в различных прокариотических и эукариотических системах [2]. Таким образом, мы рассчитывали увеличить содержание стабильных антител в конструируемой библиотеке, которые преобладают по сравнению с остальными типами AT, в норме циркулирующих в крови человека.
Одноцепочечные антитела представляют собой наименьший фрагмент антитела, содержащий его антигенсвязывающий сайт, поэтому из-за небольшого размера scFv-гепа, возможно его клонирование в составе одного вектора, в отличие от клонирования генов, кодирующих Fab фрагменты. К тому же экспрессия scFv-гена находится под контролем одного промотора, что снижает вероятность появления делеционных вариантов scFv-генов и повышает эффективность продукции функциональных scFv AT [65]. Исходя из этих данных был сделан вывод, что библиотеки одноцепочечных антител являются более стабильными [35], и был выбран именно этот вариант конструирования библиотеки.
Объединение ДНК фрагментов вариабельных доменов тяжелых и легких цепей иммуноглобулинов в последовательности, кодирующие scFv AT человека, было проведено с использованием линкерного олигонуклеотида, содержащего сайт для эндонуклеазы рестрикции АраЫ. Сайт рестрикции был введен в последовательность линкерного праймера с целью оптимизации процесса сборки scFv-генов. При этом, из-за введенного сайта рестрикции соответствующая аминокислотная последовательность линкера, S(G4S)2ARGSG4S, изменилась по сравнению с традиционно используемой (G4S)„, но, как было показано ранее [133, 134], незначительные изменения линкерноЙ последовательности существенно не влияют на взаимодействие между VH И VL доменами.
Гены, кодирующие scFv AT, были встроены в векторную фагмиду pHEN2, после этого полученный репертуар фагмид использовали для трансформации клеток Е. coll TG1. Выбранный для создания библиотеки вектор относится к 3+3 фагмидным векторным системам, в которых дикий тип белка pill конкурирует с химерным белком рШ, содержащим вставку фрагмента антитела, при включении в фаговую частицу [87]. В получаемой в результате амплификации библиотеки фаговой популяции фаговые частицы экспонируют только одну копию фрагмента антитела [61]. Так называемый моновалентный дисплей широко используется для отбора высоко аффинных фрагментов антител [65, 71,103],
Размер сконструированной иммунной библиотеки составил 3 10 независимых клонов. Был также оценен функциональный размер библиотеки, который всегда меньше исходного, определенного с помощью подсчета количества независимых трансформантов непосредственно после электропорации, но именно функциональный размер определяет возможность отбора из библиотеки антител с определенными свойствами. В нашем случае, он составил не менее 97% от определенного первоначально. Согласно [61], такой размер библиотеки позволяет получать AT с константами аффинности от 5ХЮ5 до 1 107 М"1, а качество сконструированной комбинаторной библиотеки находится на уровне описанных в литературе продуктивных фаговых библиотек [13, 15, 73]. Тот факт, что в нашем случае была сконструирована иммунная библиотека, позволял надеяться, что аффинность отбираемых из нее антител может быть выше, поскольку для конструирования использовали мРНК лимфоцитов вакцинированных доноров, в ходе развития иммунного ответа которых происходило повышение аффинности антител, специфичных к ортопоксвирусам.
Исследование вируснейтрализующих свойств фаговых антител, продуцируемых отобранными против ргАЗОЬ и ВОК клонами
В качестве еще одного антигена для обогащения сконструированной библиотеки scFv AT человека был выбран вирус оспы коров, штамм Гришак. В настоящее время показано, что этот вирус наиболее близок к предшественнику рода ортопоксвирусов [139] и является патогенным для многих животных, представляющих различные таксономические группы. У человека он вызывает заболевание, протекающее в местной форме, которое характеризуется развитием единичных поражений, чаще всего на кистях, предплечьях и лице; очень редко заболевание протекает в генерализованной форме [110]. Для максимального сохранения всех возможных вирусных эпитопов был использован жизнеспособный вирус, так как известно, что при инактивации разрушаются конформационные эпитопы вирусных белков. Использованный препарат ВОК был наработан на ХАО КЭ и очищен путем центрифугирования в градиенте плотности сахарозы. При таком способе очистки вирусная популяция в основном представлена инфекционной формой IMV.
Для обогащения библиотеки клонами, продуцирующими scFv AT против ВОК, было подведено только два раунда биопэннинга, поскольку, как было показано ранее, дальнейшее обогащение привело бы к снижению разнообразия представленных в библиотеке анти-ВОК антител. К тому же, уже после второго раунда в библиотеке существенно увеличилось количество фагов, экспонирующих специфичные к ВОК антитела, как было показано с помощью ИФА и вестерн-блот анализа (рис. 24, 25). Из обогащенной библиотеки было отобрано 15 клонов, способных продуцировать антитела, связывающиеся с ВОК, среди которых после проведения ПДРФ-анализа было выявлено 14 уникальных антител. Для некоторых рестрикционных профилей размеры рестрикционных фрагментов, предположительно соответствующие VH-генам, совпадали, что позволило выделить 3 группы антител:
Все отобранные фаговые антитела были проверены на наличие вируснейтрализующих свойств в реакции ингибирования бляшкообразования ВОК в культуре клеток Vera Е6. Среди анти-ВОК антител подавлять бляшкообразование ВОК в культуре клеток Vero Е6 оказались способными 10 антител: а4, Ь9, Я1, с4, d2, е7, е8, hi, g4 и (6, причем выраженную вируснейтрализующую способность (уровень нейтрализации 80%) показали 8 из них. Поскольку уровень нейтрализации для антител, объединенных в группы 1 и 2 по результатам ПДРФ-анализа, различался незначительно, анализ способности нейтрализовать бляшкообразование ВОК и ВОВ последовательных разведений антител, был проведен только для одного антитела из каждой группы (для Ъ9 из группы 1 и для 62 из группы 2). Фаговое антитело Ъ9 нейтрализовало инфекционность ВОВ и ВОК при разведении до 3,5 1012 БОЕ/мл (рис. 30, 31), а фаговое антитело 62 - инфекционность ВОК при разведении до 8,9х10п БОЕ/мл, а инфекционность ВОВ при разведении до 3,5 1012 БОЕ/мл (рис, 30,31).
В качестве положительного контроля нейтрализации было взято MAT 2D5, отобранное против ортопоксвирусов [127]. Было оценено количество AT, необходимых для нейтрализации инфекционности одного вириона. С учетом того, что физический титр ортопоксвирусов, используемых для нейтрализации в 100-1000 раз больше, чем инфекционный, на один вирион приходиться 105-10б молекул МАТ 2D5. Таким образом, поскольку для нейтрализации ортопоксвирусов недостаточно одной молекулы МАТ на вирион, можно предположить, что механизм нейтрализации является многоударным.
При оценке количества фаговых антител, с учетом литературных данных о том, что только 10% фаговых AT экспонируют scFv AT на своей поверхности и при этом большинство фаговых антител содержит только одну копию scFv AT [61]. Оказалось, что для нейтрализации инфекционности одного вириона необходимо 10 -107 фаговых антител, что только на порядок больше, чем необходимое количество MAT 2D5. При этом фаговые антитела содержать только один антигенсвязывающий центр, в что время как МАТ - два.
По результатам вестерн-блот анализа вируснейтрализующие анти-ВОК антитела а4, Ь9, fll, с4, d2, е7, е8 и hi связывали белок ВОК массой около 35 кДа, а остальные, включая вируснейтрализующие антитела Ї6 и g4,- не выявляли какого-либо белка, и, по-видимому, связывали конформационные эпитопы вирусных белков (рис. 32), Исходя из этих данных, было сделано предположение, что вируснейтрализующие эпитопы (или эпитоп) вирусного белка массой около 35 кДа, связываемого антителами а4, Ъ9, fl 1, с4,62, е7, е8, е9 и hi, являются линейными.
С целью исследования кросс-реактивности вируснейтрализующих анти-ВОК антител, был проведен вестерн-блот анализ белков ВОВ и ВЭ с фаговыми анти-ВОК антителами. Было показано, что вируснейтрализующие антитела а4, Ь9, fll, с4, 62, е7, е8 и hi связывали также белки ВОВ и ВЭ массой около 35 кДа. Также было проанализировано связывание последовательных разведений всех отобранных против ВОК фаговых антител с ВОК, ВОВ и ВЭ. Оказалось, что все отобранные фаговые антитела оказались способными связывать эти ортопоксвирусы.
Также, как и VH домены вируснейтрализующих анти-ргАЗОЬ антител, VH домены анти-ВОК антител, продемонстрировавших выраженную нейтрализующую активность, относятся к VH3 семейству. При этом анализ аминокислотных последовательностей этих антител, также, как и ПДРФ-анализ, позволил выделить среди отобранных антител группы антител со сходными последовательностями VH доменов: группу 1 - а4, Ь9 и fl 1; и группу 2 - с4, d2, е7, е8 и hi. При этом CDR3-участки VH доменов антител второй группы имеют одинаковую последовательность GSIAALRHHAFDI, а СБЯЗ-участки VH доменов антител первой группы различаются по нескольким аминокислотам, но в них можно выделить мотив DRIAARRGAFDI (выделен жирным шрифтом и подчеркнут), присутствующий и в CDR3 VH доменов антител второй группы (Таблица 3). Интересно, что в последовательности CDR3 VH домена антитела f6, показавшего менее выраженную вируснейтрализующую активность (уровень нейтрализации около 60%), можно выделить аминокислоты, содержащиеся в том же положении в CDR3 VH доменов антител второй группы DGJGKNGJ І (выделены серым), хотя VH домен этого антитела принадлежал VHI семейству.
