Содержание к диссертации
Введение
1. Обзор литературы 8
1.1.Краткая классификация семейства поксвирусов 8
1.2. Структура и морфогенез ортопоксвирусов 8
1.3.Краткая характеристика генома ортопоксвирусов 12
1.4.Механизмы распространения вируса 13
1.5.Основные методы исследования ортопоксвирусных белков 16
1.6. Белки вириона 19
1.6.1.Основные белки сердцевины вириона 19
1.6.2.Мембранные белки зрелой вирусной частицы 23
1.6.3.Белки дополнительных мембран вириона 30
1.7. Использование иммуноглобулинов, направленных против ортопоксвирусов 36
1.8. Фаговый дисплей 40
2. Материалы и методы 45
2.1.Реактивы и материалы 45
2.2.Методы 48
3. Результаты 55
З.1.Получение препаратов ортопоксвирусов 55
3.2. Аффинная селекция антител против вируса осповакцины из иммунной библиотеки 60
3.3. Аффинная селекция антител против вируса осповакцины из синтетической библиотеки 65
3.4. Аффинная селекция фаговых антител против вируса натуральной оспы из синтетической библиотеки 68
3.5.Отбор фаговых антител против вируса эктромелии 70
З.6.Определение аминокислотных последовательностей отобранных одн оце почечных антител 72
3.7.Исследование связывания отобранных фаговых антител с различными ортопоксвирусами 79
3.8. Исследование связывания фаговых антител, отобранных из синтетической библиотеки с различными штаммами вируса натуральной оспы 84
3.9.Исследование антигенной специфичности отобранных антител 86
3.10.Исследование вируснейтрализующих свойств антител 92
Выводы 109
- Структура и морфогенез ортопоксвирусов
- Использование иммуноглобулинов, направленных против ортопоксвирусов
- Аффинная селекция антител против вируса осповакцины из иммунной библиотеки
- Исследование связывания фаговых антител, отобранных из синтетической библиотеки с различными штаммами вируса натуральной оспы
Введение к работе
Род Orthopoxvirus является наиболее известным в семействе Poxviridae, включающем в себя сложные ДНК-содержащие вирусы, реплицирующиеся в цитоплазме клеток позвоночных и беспозвоночных. Для человека на протяжении всей его истории наиболее важным из ортопоксвирусов был вирус натуральной оспы, который более двух тысяч лет являлся причиной эпидемий опасного генерализованного заболевания. Естественная трансмиссия натуральной оспы бьша прервана в 1977 году, менее чем через два столетия после начала применения профилактических прививок вирусом оспы коров и вирусом осповакцины. Возобновление интереса к ортопоксвирусам у исследователей можно объяснить распространением оспы обезьян в Африке и других странах, а также сохраняющейся возможностью использования вируса натуральной оспы для биотерроризма. Причем стихийному или преднамеренному распространению оспы обезьян или натуральной оспы может способствовать то, что в настоящее время большая часть населения иммунитета к оспе не имеет.
В настоящее время в мире имеется только две официальные коллекции вируса натуральной оспы, одна из которых находится в Векторе. Поэтому по рекомендациям ВОЗ в нашей стране бьша разработана Программа комплексных исследований вируса натуральной оспы, включавшая фундаментальные исследования ортопоксвирусов и получение иммунобиологических препаратов. Данная работа была выполнена в рамках этой программы.
Следует отметить, что большая часть информации о гуморальном иммунитете к ортопоксвирусам получена при изучении моноклопальных антител грызунов против вируса осповакцины и вируса оспы обезьян, а имеющиеся данные о молекулярных механизмах патогенеза вируса натуральной оспы получены на модельных инфекциях лабораторных животных. Поэтому панели человеческих антител против ортопоксвирусов, включая вирус натуральной оспы, кроме их несомненной ценности в качестве источника для разработки иммунопрофилактических и иммунотерапевтических средств, могут быть полезны как инструмент для изучения особенностей иммунологического профиля ортопоксвирусов и молекулярных основ их вирулентности, а также для исследований особенностей иммунного ответа организма.
Одним из современных способов получения антител человека является их селекция из комбинаторных библиотек мини-антител (Fab, scFv), экспонированных на поверхности нитчатых бактериофагов. Такие комбинаторные фаговые библиотеки содержат 10 -10 фаговых частиц, на поверхности каждой из которых экспонировано уникальное мини-антитело. Процедура биопэннинга (biopanning) - специфического обогащения библиотеки путем, повторяющихся раундов связывания антител с антигеном - позволяет отбирать молекулы с предопределенными свойствами.
Ранее в США из комбинаторной фаговой библиотеки, сконструированной на основе мРНК лимфоцитов периферической крови иммунного донора, была получена коллекция Fab-фрагментов человека, специфических к вирусу осповакцины. Несколько Fab-фрагментов из этой библиотеки продемонстрировали вируснейтрализующие свойства в отношении вируса осповакцины.
Целью данной работы являлось получение методами фагового дисплея одноцепочечных антител человека против ортопоксвирусов, включая вирус натуральной оспы, поиск группоспецифических или, в случае антител против вируса натуральной оспы, штаммо-специфических антител и отбор антител, обладающих вируснейтрализующими свойствами. Для выполнения поставленной цели необходимо было решить следующие задачи: отобрать из иммунной и синтетической комбинаторных библиотек одноцепочечные антитела человека против ортопоксвирусов, включая вирус натуральной оспы, штамм Butler; определить аминокислотные последовательности полученных одноцепочечных антител; исследовать отобранные антитела в реакции кроссреактивного связывания с различными ортопоксвирусами; исследовать связывание отобранных антител с различными штаммами вируса натуральной оспы; провести поиск вируснейтрализующих антител в полученной коллекции.
Научная новизна и практическая ценность работы. В настоящей работе впервые получены одноцепочечные антитела человека против вируса натуральной оспы, штамм Butler, против вируса осповакцины и вируса эктромелии. Определены аминокислотные последовательности полученных антител. Исследовано связывание антител с различными ортопоксвирусами, выявлены группоспецифические антитела. Проведенные исследования способности отобранных антител к кросс-реактивному связыванию позволили высказать предположение о вкладе в иммунологические профили ортопоксвирусов эпитопов, конформации которых могут несколько различаться у различных видов (штаммов одного вида) ортопоксвирусов.
Впервые исследовано связывание антител с различными штаммами вируса натуральной оспы. Впервые обнаружены антитела, обеспечивающие различное связывание штаммов вируса натуральной оспы, обладающих разной вирулентностью (variola major и variola alastrim).
В ходе данной работы впервые были отобраны одноцепочечные антитела человека, способные подавлять инфекционность вирусов осповакцины, оспы коров и эктромелии. На основе данных антител в дальнейшем могут быть сконструированы полноразмерные антитела человека. Такие полноразмерные антитела человека, после проверки их противовирусных свойств в модельных экспериментах на животных, могли бы представлять интерес для создания на их основе иммунопрофилактических средств, а также терапевтических препаратов предупреждения поствакципальных осложнений и, возможно, лечения ортопоксвирусных инфекций.
Апробация работы и публикации. По материалам диссертации опубликовано 4 статьи, получено положительное решение о выдаче авторского свидетельства. Материалы диссертации были представлены па 11 Международных конференциях: 5Ш John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology (Пущипо, Россия, 2000), "Human antibodies and hybridomas" (Прага, Чехия, 2001; Берн, Швейцария, 2002); 15-ой Международной конференции «Antiviral research» (Прага, Чехия, 2002); на XIII Международном вирусологическом конгрессе (Париж, 2002); Научной, конференции «Проблемы инфекционной патологии в регионах Сибири, Дальнего Востока и Крайнего Севера» (Новосибирск, 2002); Международной научно-практической школе-конференции «Цитокины. Воспаление. Иммунитет. (Санкт-Петербург, Россия, 2002); 6th John Humphrey Advanced Summer Programme in Immunology, (Пушино, Россия, 2002), 16-ой Международной конференции «Antiviral research» (Саванна, США, 2003), 17-ой Международной конференции «Antiviral research» (Туксон, США, 2004), 18-ой Международной конференции "Antiviral research" (Барселона, Испания, 2005).
Вклад автора. В исследованиях, проводимых с использованием жизнеспособного вируса натуральной оспы в условиях специальной лаборатории с уровнем защиты BSL 3-4, вместе с автором участвовали А.Л.Гуськов, Е.Б.Сокунова, Т.Э.Юн, Е.В.Жираковская, Е.И.Бовшик, к.б.н. Н.В.Тикунова. Тестирование антител на наличие вируснеитрализуїощеи активности проводилось в лаборатории общих вирусов, руководитель к.м.н. Е.Ф.Белаиов, в тестировании антител принимали участие вместе с автором Н.И.Бормотов и З.Ф.Киселева. Все остальные эксперименты и анализ полученных данных сделаны лично автором.
Структура и морфогенез ортопоксвирусов
Вирионы ортопоксвирусов имеют сложное строение и крупные размеры. Размер частиц вируса осповакцины, полученных путем разрушения зараженных клеток, составляет примерно 300х230х180нм. По данным электронной микроскопии, вирионы поксвирусов имеют характерную овоидную или кирпичеобразную форму. В составе виряона выделяют ряд морфологически обособленных структур (рис. 1): вогнутую сердцевину (кор или нуклеоид), латеральные тела и липопротеидные оболочки (Medzon, 1970). Общая схема морфогенеза ортопоксвирусов на примере вируса осповакцины представлена на рис. 2. Этот процесс начинается с появления в цитоплазме скоплений гранулярного или фибриллярного электронно-плотного материала, содержащего вирусные белки и ДНК (Kajioka et al, 1964). Данные скопления называются вироплазмой, она представляет собой начало формирования «вирусной фабрики», которая включает в себя вироплазму и вирионы па разных стадиях сборки. На следующих стадиях реиликативного цикла в вироплазме появляются серповидные вирусные структуры - так называемые мембранные полумесяцы (CR -crescent-shaped), состоящие из вирусных белков и мембран. Далее из этих структур формируются незрелые вирусные частицы (IV - immature virus), которые заполняются нуклеопротеиновым комплексом. Точно не установлено, как и когда нуклеопротеид попадает в вирион, но предполагается, что это происходит непосредственно перед замыканием мембраны. Незрелые вирусные частицы подвергаются процессу созревания, включающему в себя конденсацию вирусного кора, протеолитическое расщепление ряда капсидных белков и формирование латеральных тел (Moss-and Rosenblum, 1973). Сформировавшиеся таким образом внутриклеточные зрелые вириопы (IMV - intracellular mature virus) представляют собой большую часть вирусного потомства. Большинство сформировавшихся зрелых вирусных частиц остается в клетке вплоть до ее лизиса, только часть вирусного потомства ее покидает. Зрелые вирусные частицы, предназначенные к выходу из клетки, транспортируются из вирусных фабрик по направлению к клеточному центру с использованием цитоплазматической сети микротрубочек (МТ) (Sanderson et al, 2000) и окружаются дополнительно двумя мембранами, происходящими из аппарата Гольджи или ранних эпдосом.
Таким образом формируется промежуточная форма вириона - внутриклеточный "одетый" (оболочечный) вирус (IEV - intracellular enveloped virus). Частицы IEV, содержащие дополнительные мембранные оболочки,, движутся к плазматической клеточной мембране, продолжая использовать сеть микротрубочек клетки (HolHnshead et al, 2001). Внешняя мембрана внутриклеточного "одетого" вируса сливается с клеточной мембраной, что приводит к высвобождению вирионов, покрытых одной, дополнительной оболочкой. Часть высвободившихся "одетых" вирионов остается связанной с клеточной мембраной с помощью пучков актиновых волокон (CEV - cell-associated enveloped virus). Данная форма вирионов важна для инфицирования соседних клеток. Вирусные частицы, перешедшие в несвязанное с клеткой состояние, представляют собой еще одну вирусную популяцию, отвечающую за распространение вируса на значительное расстояние внутри инфицированного организма (Payne et al, 1980) и в культуре клеток (Boulter and Appleyard, 1973; Law et al, 2002). Такие вирионы носят название внеклеточного "одетого" или внеклеточного оболочечного вируса (EEV - extracellular enveloped virus). Некоторыми авторами также описан альтернативный путь выхода зрелых вирионов из клетки с помощью так называемого псевдопочкования. Такой способ высвобождения вирусных частиц встречается на позднем этапе развития инфекции. Существование такого пути выхода зрелых вирионов зависит от штамма вируса и типа используемых, клеток. Значение такого способа высвобождения вируса из клетки неизвестно, неясно также, обладает ли отпочковавшийся вирус теми же свойствами, что и EEV, вышедший из клетки обычным путем (экзоцитозом) (Meiser et al, 2003). 1.3. Краткая характеристика генома ортопоксвирусов Геном ортопоксвирусов представлен линейной двухцепочечной ДНК с ковалентно замкнутыми концами, называемыми теломерами. или шпильками. Размер ДНК ортопоксвирусов варьирует от 175 до 210 т.п. нуклеотидов в зависимости от вида и штамма вируса. В геноме различают центральную консервативную часть, несущую жизненно важные гены, и концевые вариабельные области, в которых содержатся гены, несущественные для жизнеспособности вируса. Геном кодирует около 200 іюлипептидов, из которых приблизительно половина входит в состав вирусной частицы. Вирион поксвирусов содержит как структурные, так и функциональные белки. Функциональные белки вириона в большинстве своем связаны с процессами репликации и транскрипции ДНК. Это обусловлено тем, что весь жизненный цикл поксвирусов протекает в цитоплазме инфицированных клеток. Гены подразделяются по времени экспрессии па ранние (Е - early), промежуточные (I - intermediate), поздние (L - late) и экспрессируемые в течение всего цикла развития вируса - ранне-поздние (E-L). Ранние гены экспрессируются сразу после инфицирования клетки с помощью вирион-ассоциированной РНК-полимеразы, с промежуточных синтез идет после репликации вирусной 7ДНК, а для экспрессии поздних генов необходим не только синтез ДНК, но и экспрессия ранних и промежуточных генов. Кодирующие последовательности этих вирусов непрерывны, и сплайсинг отсутствует. Вирусные белки, синтезирующиеся на ранних этапах и в середине вирусного цикла, обладают функциональной активностью, в то время как гены структурных белков вириона являются поздними по времени экспрессии, если они не несут помимо структурной еще какой-либо функциональной активности
Поскольку геном поксвирусов кодирует большое количество белков, то существует необходимость их систематизации. В настоящее время наиболее часто используется нумерация ОРТ (открытые рамки транскрипции) ортопоксвирусов, при которой принято привязывать положение каждого конкретного гена: к определенному HindIII-фрагменту геномной: поксвирусной ДНК. Фрагменты вирусной ДНК, полученные в результате расщепления рестриктазами, обозначают латинскими буквами в порядке уменьшения, их размера. Нумерация ОРТ в каждом конкретном фрагменте идет слева направо, и определенная ОРТ обозначается номером и буквой, соответствующей фрагменту, в котором находится ее инициирующий кодон; также ей присваивается буква L или R, в зависимости от того, с: какой цепи: ДНК идет транскрипция. Прототипным штаммом для ортопоксвирусов является штамм Копенгаген вируса1 осповакцины, полная нуклеотидная последовательность которого была определена первой среди представителей рода Ортопоксвирус. Кроме того, для. некоторых белков используются также и присвоенные им ранее названия (Sarov and Joklik, 1972; Essani and Dales, 1979). В данной работе будет использоваться как нумерация ОРТ, соответствующая HindlII-рестрикционной карте ДНК штамма: Копенгаген, так и исторически сложившиеся названия белков. 1:4.Механизмы распространения вируса Как известно, ортопоксвирусы продуцируют как минимум три инфекционных формы вириона, способные заражать клетки млекопитающих (Рис. 3). Каждая из форм вириона обладает своими морфологическими и биологическими особенностями, в силу чего все они: вносят свой вклад в выживание и распространение вируса. Зрелая вирусная частица (IMV) является очень стабильной структурой, устойчивой к различным физическим: воздействиям, и представляет собой инфекционный материал, содержащийся в оспенной вакцине; Частица IMV выдерживает лиофилизацию и циклы повторного замораживания-размораживания, ее стабильность позволяет вирусу достаточно долго сохраняться в природной среде и инфицировать новых хозяев.
Использование иммуноглобулинов, направленных против ортопоксвирусов
Одной из основных проблем, возникших в ходе кампании по уничтожению вируса натуральной оспы, была проблема диагностики и дифференциации ортопоксвируеных инфекций. Начало разработки и применения методов такой лабораторной диагностики относится ко второму десятилетию XX века. В этот же период появились все три основные группы традиционных методов лабораторной диагностики ортопоксвируеных инфекций (Маренникова и Щелкунов, 1998): морфологические, серологические, биологические. Позднее, уже после ликвидации натуральной оспы, была создана еще одна группа методов -молекулярно-биологическая, основанная на достижениях молекулярной биологии. Серологические методы обнаружения ортопоксвирусов основаны на использовании специфических антител, появляющихся в ходе инфекции. Для диагностирования может применяться широкий спектр лабораторных иммунологических реакций (ИФА, РНГА, РТГА, РИА и др.); Самым первым используемым тестом был тест на связывание комплемента, который использовался еще с начала прошлого века для обнаружения противооспенных комплементсвязывающих антител и был разработан Sugai (Маренникова и Щелкунов, 1998). Позднее: была разработана реакция гелевой преципитации (Ouchterlony et al, 1949), позволяющая определить принадлежность возбудителя инфекции к роду ортопоксвирусов. Ее модификация расширила возможности впутриродовой диагностики ортопоксвирусов (Маренникова и Мальцева, 1961а). На данный момент наиболее чувствительными серологическими методами выявления ортопоксвируеных инфекций являются ИФА, РИА и реакция вируснейтрализации. Ортопоксвирусы обладают сильно выраженной серологической кросс-реактивностью (Fenner et al, 1989; Ichihashi et al, 1988), поэтому их межвидовая диагностика серологическими методами осложнена. Для преодоления данных затруднений используют чаще всего прием предварительной адсорбции испытуемых сывороток соответствующим гетерологическим ортопоксвирусом (Мальцева и др., 1984). Альтернативным путем является использование моноклональных видоспецифических антител к различным ортопоксвирусам (Маренникова и др., 1986; Ichihashi etal, 1988).
В разное время различными исследователями были получены коллекции моноклональных антител грызунов, специфических к ортопоксвирусным антигенам. Так в работе Ichihashi (Ichihashi and Oie, 1988) были получены коллекции МКА мыши к антигенам вирусов осповакцины и оспы обезьян; выявлены антитела, обладающие видосиецифическим связыванием с антигенами вируса. оспы обезьян (МКА Н12СТ и H11G1) и антитела, видоспецифически: связывающие антигены вируса осповакцины (МКА G9F8). Известны также работы других авторов по созданию коллекций МКА к различным ортопоксвирусам (Czerny and Mahnel, 1990; Rodriguez et.al, 1995; Разумов и др, 2004). Полученные МКА были использованы для изучения белков дополнительной мембраны внеклеточного "одетого" вириона (Payne, 1992; Galmiche et al, 1999) и белков мембраны внутриклеточного зрелого вируса (Ichihashi and Oie, 1996а; Rodriguez et al, 1995; Aldaz-Caroll et al, 2005). Некоторые антитела из полученных коллекций обладали вируснейтрализующей активностью в отношении различных ортопоксвирусов (Ichihashi and Oie, 1996а; Rodriguez et al, 1995; Разумов, 2004 и др.). С помощью вируснейтрализующих антител были определены белки поверхностной мембраны зрелого внутриклеточного вириона, опосредующие проникновение зрелой вирусной частицы в клетку: белки, кодируемые ОРТ D8L (Hsiao et al, 1999), L1R (Wolffe et al, 1995; Ichihashi and Oie, 1996a; Aldaz-CaroU et al, 2005), A27L (Rodriguez et al, 1985; Разумов и др., 2004), A17L (Wallengren et al, 2001) и H3L (Gordon et al, 1991; Daviezet al, 2005). Поскольку вирион: ортопоксвирусов является очень сложной структурой, одну из основных проблем при характеризации полученных МКА. представляет определение их антигенной специфичности, что, в частности, относится и к вируснейтрализующим антителам. Так, например, для определения антигенной специфичности вируснейтрализующего МКА 2D5 (Ichihashi et al, 1996а), исследователям пришлось получать коллекцию устойчивых к нейтрализации МКА 2D5 вариантов вируса осповакцины, и картировать в геноме вируса ген, кодирующий белок, связываемый данным МКА. Оказалось, что МКА 2D5 связывает белок, кодируемый ОРТ L1R, Одновременно было обнаружено, что устойчивый: к нейтрализации МКА 2D5 вирус содержит а.о. аспарагина вместо а.о, аспарагиновой кислоты в 35 позиции аминокислотной последовательности белка L1R. Таким образом, был точно картирован эпитоп, который связывает MKA2D5. Механизмы вируснейтрализации ортопоксвирусов полученными МКА в литературе описаны крайне мало. Исключение составляет МКА СЗ, полученное Rodriguez (Rodriguez et al, 1985; Ramirez et al, 2002). Авторами показано, что данное вируснейтрализующее МКА, специфичное к вирусному белку 14 кДа, не мешает вирусу присоединяться к клеточной мембране, но предотвращает раздевание вирусной частицы в клетке. Долгое время считалось, что внеклеточная форма вириона (EEV) устойчива к вируснейтрализации антителами, что подтверждалось данными разных исследователей (Payne et al, 1992; Ichihashi, 1996b и др.). Но позднее M.Galmiche удалось. получить вируснейтрализующие антитела: к оболочке внеклеточного вириона и к белку, кодируемому ОРТ B5R (Galmiche et al, 1999). Антитела к остальным белкам оболочки EEV, исследованные в данной работе, не обладали вируснейтрализующим эффектом. Позднее, другими авторами был показан протективный эффект моноклональных антител, полученных к белкам A33R и B5R оболочки внеклеточного вириона (Lustig et al, 2005).
Моноклональные: антитела к ортопоксвирусным белкам широко используются при изучении репликативного цикла и морфогенеза ортопоксвирусов, при электрошю-микроскопических исследованиях структуры-вирионов и для определения локализации вирусных белков внутри клетки ив самом вирионе (Pederson et al, 2000; Payne et al, 1991,1992; Demkovicz et al, 1992; Galmiche et al, 1999) Одной из последних работ такого рода является работа Law (Law et al, 2004), в которой особенности связывания и входа вируса осповакцины в клетку исследовали с использованием моноклональных антител к коровым белкам вириона и к белкам EEV- и IMV- форм вируса. Проводились также исследования на лабораторных животных, связанные с изучением протективной роли моноклональных антител грызунов, полученных к различным поверхностным белкам ортопоксвирусов, При этом были использованы МКА, специфические к белкам, кодируемым ОРТ A27L, L1R, B5R и A33R (Ramirez et al, 2002; Lustig et al, 2005; Aldaz-Caroll et al, 2005). В экспериментах по заражению мышей вирусом осповакцины было показано,, что МКА, специфические к данным белкам, обладают иммунопрофилактичсским и иммунотерапевтическим эффектом, сравнимым с эффектом специфического поликлопалыюго иммуноглобулина (Lustig et al, 2005). Большая часть информации о гуморальном ответе на ортопоксвирусы была получена на модельных инфекциях лабораторных животных и при изучении мышиных и крысиных МКА, специфичных. к данным , вирусным антигенам (Маренникова и др., 1986; Ichihashi et al, 1988; Разумов и др., 2004). Но, по литературным данным, гуморальный ответ человека на ортопоксвирусы отличается от гуморального ответа грызунов (Demkovicz et al, 1992; Davies et al, 2005). Сыворотки вакцинированных вирусом осповакцины людей выявляют в Вестерн-блот анализе иммунодоминантпые белки вируса молекулярным весом 62, 59, 39, 36 и 32 кДа, из них белки молекулярным весом 62 и 39 кДа имеют коровую локализацию в вирионе. Сьшоротки иммунизированных тем же вирусом мышей выявляют в Вестерн-блот анализе помимо перечисленных еще и дополнительные вирусные белки молекулярным весом 27, 25, 21, 17 и 14 кДа. Поэтому большой интерес представляет создание коллекции МКА человека, специфичных к ортопоксвирусам и исследование их биологических и иммунохимических СВОЙСТВ. Известно, что поликлональные иммуноглобулины (VIG) человека, специфические к вирусу осповакцины, являются и по сей день единственным эффективным средством специфического лечения ортопоксвирусных инфекций и терапии поствакцинальных осложнений при оспопрививании (Маренникова и др., 1961b, 1968; Fenner et al, 1989; Воробьев и др, 2003; Shearer et al, 2005).
Аффинная селекция антител против вируса осповакцины из иммунной библиотеки
Аффинное обогащение иммунной библиотеки проводили с использованием в качестве антигена вируса осповакципы, дермальной наработки. Для первого раунда аффинного обогащения использовали ВОВ в концентрации 50 мкг/мл, вирус сорбировали в иммунологическую пробирку (Maxisorp, Nunc, Дания) в фосфатно-солевом буферном растворе (ФСБР). Контролем служила другая иммунологическая пробирка, содержащая ФСБР без антигена. После блокирования мест неспецифического связывания обе иммунологические пробирки заполняли суспензией фаговых частиц (5 10 БОЕ), экспонирующих на своей поверхности одноцепочечные антитела. После инкубации несвязавшиеся фаговые антитела удаляли, а связавшиеся с антигеном фаговые антитела элюировали раствором ЮОмМ триэтиламина. Элюатом инфицировали экспоненциально растущую культуру клеток Е.соІІ TG1. Выросшие клетки собирали и использовали для наработки новой популяции бактериофагов и проведения следующего раунда аффинного обогащения библиотеки.. Аналогично были проведены 2-й и 3-й раунды аффинного обогащения, при этом концентрация ВОВ составила 20 мкг/мл в обоих раундах селекции. Полученные после каждого раунда селекции поликлональные популяции фаговых антител, а также исходную библиотеку тестировали методом ИФА для оценки изменения связывания с ВОВ. Результаты тестирования показали значительное превышение сигнала при связывании антигена фаговой популяцией, полученной после 3-го раунда селекции, над сигналом, обеспечиваемым исходной библиотекой, что подтвердило обогащение ее фагами, экспонирующими на поверхности scFv антитела против ортопоксвирусов (рис. 9). Из библиотеки, полученной в результате третьего раунда бионэннинга, были протестированы 368 независимых клонов по способности связывать ВОВ в ИФА. Для тестирования был использован вирус осповакцины, наработанный на ХАО РКЭ. Суспензию ВОВ в ФСБР сорбировали на пластиковые планшеты в концентрации 3 мкг/мл. В качестве отрицательного контроля использовали раствор БСА в- ФСБР, в качестве контроля неспецифического связывания бактериофаг М13К07, не несущий антител на своей поверхности. Проведенный анализ показал, что около 25% клонов продемонстрировали сигнал, в 3 и более раз превышающий значения такового для бактериофага М13К07, и отрицательного контроля. Всего было отобрано 97 фаговых антител, специфично взаимодействующих с ВОВ. Клоны, давшие положительный сигнал при скрининге, проверялись на наличие в фагмиде встроенного фрагмента ДНК, кодирующего оц-АТ.
Все отобранные клоны содержали встройку ДНК правильного размера (рис. 10). Для того чтобы оценить разнообразие отобранных антител, кодирующие их гены были проанализированы методом ПДРФ-анализа с использованием эндонуклеазы рестрикции НаеШ. В результате было выделено 7 групп клонов (прототипные клоны 2VC3, 2VD10, 3VA10, 2VB7, 2VA8, 3VG8, 3VF11), обладающих различными рестрикциоппыми профилями (рис. 11). Следовательно, как минимум 7 из отобранных 97 фаговых антител являются заведомо уникальными. Аффинное обогащение синтетической библиотеки клонами, специфическими к ВОВ, проводили аналогично обогащению иммунной библиотеки. Для первого раунда аффинного обогащения использовали ВОВ в концентрации 50 мкг/мл, во втором и третьем раундах она составляла 20 мкг/мл антигена. Для каждого раунда использовали 5 10 бактериофагов, экспонирующих на своей поверхности одноцепочечные антитела: В ходе трёх последовательных раундов аффинного обогащения на вирусе осповакцины были получены фаговые поликлональные популяции антител, которые затем тестировали методом ИФА для оценки изменения связывания с соответствующим антигеном. Результаты тестирования показали значительное превышение сигнала при связывании антигена фаговой популяцией, полученной после 3-го раунда селекции, над сигналом, обеспечиваемым исходной библиотекой, что подтвердило обогащение фаговых популяций фагами,, экспонирующими на поверхности оц-АТ против ВОВ (рис. 12). Из обогащенной фаговой популяции, полученной из синтетической: библиотеки после 3-го раунда селекции, было проанализировано по связыванию с вирусом осповакцины в ИФА 480 клонов, продуцирующих фаговые антитела, 156 клонов оказались позитивными. Клоны, давшие положительный сигнал при скрининге, проверялись на наличие в фагмиде фрагментов ДНК, кодирующих Vh- и Vl-домены. Выяснилось, что приблизительно 90% отобранных клонов не содержали в фагмиде фрагментов ДНК, кодирующих Vh- и Vl-домены, Пример таких клонов приведен на рис. 13. Пятнадцать клонов, давших положительный сигнал при скрининге на ВОВ и содержащих встройку ДНК правильного размера, были отобраны для дальнейшей работы. Обогащение синтетической библиотеки клонами, специфическими к ВНО, проводили в ходе трёх последовательных раундов аналогично обогащению синтетической библиотеки против вируса осповакцины. При этом в качестве антигена использовали жизнеспособный вирус натуральной оспы, штамм Butler. Концентрацию использованного антигена понижали со 100 мкг/мл при первом раунде селекции до 20 мкг/мл при третьем раунде.
Для первого и второго раундов брали ВНО, наработанный па ХАО РКЭ, для последнего раунда - ВНО, наработанный в культуре клеток VeroE6. Полученные после каждого раунда селекции поликлональные популяции фаговых антител, а также исходную библиотеку тестировали методом ИФА для оценки изменения связывания с. соответствующим антигеном. Результаты тестирования показали значительное превышение сигнала при связывании антигена фаговой популяцией, полученной после 3-го раунда селекции, над сигналом, обеспечиваемым исходной библиотекой, что подтвердило обогащение фаговых популяций фагами, экспонирующими на поверхности оц-АТ против ВНО (рис. 14). 165 индивидуальных клонов из библиотеки после третьего раунда1 аффинного обогащения на ВНО были проанализированы по связыванию ВНО в ИФА, положительными оказались 35 клонов. Клоны, давшие положительный сигнал при скрининге, проверялись на наличие в фагмиде встроенного фрагмента ДНК, кодирующего оц-АТ. Выяснилось, что 10 клонов. содержали в фагмиде встроенный фрагмент ДНК правильного размера. Они и были отобраны для дальнейшей работы. Из популяций синтетической и иммунной библиотек, полученных в результате 3-х раундов аффинного обогащения против ВОВ, отбирались фаговые антитела по связыванию с вирусом эктромелии в ИФА. Скрининг проводили аналогично скринингу на вирусе осповакцины. ВЭ, наработанный на ХАО РКЭ, сорбировали на иммунологический планшет в концентрации 3 мкг/мл. Из 96 проанализированных на связывание с ВЭ клонов из иммунной библиотеки было отобрано 10 клонов, продуцирующих фаговые антитела, способные связывать вирус эктромелии. Клоны, давшие положительный сигнал при скрининге, проверяли на наличие в фагмиде встроенного фрагмента ДНК, кодирующего оц-АТ. Все отобранные из иммунной библиотеки клоны содержали встройку ДНК правильного размера. Для того чтобы сравнить антитела, отобранные из иммунной библиотеки на ВЭ с антителами, отобранными на ВОВ, кодирующие их" гены: были проанализированы методом ПДРФ-анализа с. использованием эндонуклеазы рестрикции НаеШ. При этом 10 клонов, отобранных па ВЭ, совпали по результатам ПДРФ-анализа с клонами, отобранными на ВОВ (рис. 11, 15). Из 178 клонов из синтетической библиотеки, проанализированных па связывание с вирусом эктромелии, было отобрано 43 положительных клона. Положительные клоны проверяли на наличие в фагмиде встроенного фрагмента ДНК, кодирующего оц-АТ. Лишь 5 клонов из 43, отобранных из синтетической библиотеки, содержали встройку правильного размера. Дальнейшая работа велась с данными пятью клонами.
Исследование связывания фаговых антител, отобранных из синтетической библиотеки с различными штаммами вируса натуральной оспы
Все уникальные фаговые антитела, отобранные из синтетической библиотеки по связыванию с ВОВ, ВЭ и ВНО, исследовались методом непрямого ИФА по их способности связывать штаммы живого вируса натуральной оспы BHO-Ind-За, BHO-Butler, BHO-Brazil 131, ВНО-Соп-9 и BHO-Kuw-5. Связывание фаговых антител с вышеназванными штаммами ВНО изучали в параллельных экспериментах при последовательных разведениях антигенов. Для этого, тестировали связывание фаговых антител в концентрации фагов 2x10 бляшкообразующих единиц (БОЕ) на 1 мл с последовательными разведениями вирусных препаратов, начальная концентрация антигенов составляла бмкг/мл, шаг разведения 1:4. В качестве контроля неспецифического связывания использовали фаг-помощник М13К07. Результаты экспериментов показали, что фаговые антитела отличались между собой по эффективности связывания исследуемых штаммов вируса натуральной оспы, но каждое из них выявляло приблизительно равные концентрации разных представителей данного вида (рис. 20). Исключение составили антитела 2В2 и 9G2 (рис. 20). Антитело 2В2, отобранное по связыванию с ВНО, Butler, выявляло около 0,6 нг/лунке BHO-Butler и BHO-Brazil 131 (группа штаммов alastrim), но 150нг/лунке BHO-Ind-За и BHO-Kuw-5 и около 37,5 нг/лунке BHO-Congo-9, принадлежащих к группе штаммов variola major. В то же время антитело 9G2, отобранное по связыванию с ВЭ, выявляло менее 10 нг/лунке. вирусов из группы штаммов alastrim, и 150 нг/лунке вирусов из группы штаммов variola major. Поиск белков-мишеней фаговых AT, отобранных из иммунной и синтетической библиотек по связыванию с ортопоксвирусами, осуществляли методом Вестерн-блот анализа. Для этого белки ВОВ, ВОК, ВЭ и ВНО (штамм Butler), разделенные электрофорезом в полиакриламидном геле, переносили на нитроцеллюлозную мембрану и инкубировали с различными фаговыми антителами. Контролем неспецифичного связывания являлось антитело antihy. Было показано, что три антитела, отобранных из синтетической библиотеки, выявляли белки-мишени ортопоксвирусов в Вестерн-блот анализе: антитело 1F4 связывало белки ВОВ, ВОК и ВЭ молекулярным весом приблизительно 27 кДа (рис. 21), a 9G2 и 2В2 взаимодействовали с белками ВОВ и ВНО, молекулярный вес которых составлял приблизительно 34 кДа (рис. 22,23). Четыре фаговых антитела (2VC3,.2VD10, 3VA10, 4VC1), отобранные из иммунной библиотеки, также выявляли в Вестерп-блот анализе белки ВОВ, ВОК и ВЭ молекулярным весом около 34 кДа. Приводятся иммуноблоты антител 3VA10 и 2VD10 (рис. 24,25).
Остальные фаговые AT, отобранные из обеих библиотек, не связывали ортопоксвирусные белки в иммуноблот-анализе. Вероятно, эти AT взаимодействовали с конформационпыми эпитопами, которые разрушаются при проведении электрофореза в восстановительных условиях. Наличие вируснейтрализующих свойств у отобранных фаговых антител проверялось в реакции подавления бляшкообразования в культуре эукариотических клеток VeroE6, Тестирование антител проводилось в параллельных экспериментах при последовательных разведениях антител с использованием различных ортопоксвирусов (ВОВ, ВОК и ВЭ). В качестве контроля неспецифической нейтрализации использовали фаговое антитело antihy (Griffiths et al, 1994), в качестве положительного контроля - МКА мыши 2D5 (Ichihashi and Oie, 1996а), Исследование проводили при постоянной концентрации ортопоксирусов, которая составляла 250 бое/мл, и при последовательных разведениях антител, начальная концентрация которых составляла 17 пмоль/мл, с шагом разведения 1:4. Результаты представлены в табл. 3. В результате проведенных экспериментов было показано, что фаговые антитела прототипа 3VA10, 4VC1 и 2VD10, отобранные из иммунной библиотеки, обладают вируснейтрализующей активностью (табл. 3, рис. .26). .Из антител, полученных. из синтетической библиотеки, только антитела 16НЗ и 10Н2, отобранные по связыванию с ВОВ, проявили способность к нейтрализации инфекционности ВОВ, но не ВОК и ВЭ (табл. 3). Следует отметить, что все антитела, полученные из синтетической библиотеки как по связыванию с ВНО, так и по связыванию с ВОВ и ВЭ, были протестированы в реакции ингибирования бляшкообразования с использованием штаммов ВНО Ind-За: и Butler. В этих экспериментах в качестве контроля иеспецифической нейтрализации использовали фаг-помощник М13К07, не экспонирующий на своей поверхности оц-АТ. В качестве положительного контроля также было использовано МКА 2D5. В результате проведенных экспериментов не было обнаружено фаговых антител, нейтрализующих инфекциошюсть указанных штаммов ВНО. Целью данной работы являлось получение методами фагового дисплея одноцепочечных антител человека против ортопоксвирусов, включая вирус натуральной оспы, поиск группоспецифических или, в случае антител против вируса натуральной оспы, штаммо-специфических антител и отбор антител, обладающих вируснейтрализующими свойствами. Методология фагового дисплея предоставляет принципиальную возможность отбора из комбинаторных библиотек рекомбинантных антител человека против различных вирусных патогенов, при этом возможен отбор вируснейтрализующих антител. Комбинаторная библиотека антител - это коллекция нитчатых бактериофагов, каждый из которых экспонирует на своей поверхности антигенсвязывающие домены иммуноглобулинов, отвечающие за специфичность антител. Как правило, используют библиотеки Fab-фрагментов или библиотеки одноцепочечных антител (scFv), состоящих из вариабельных доменов тяжелых и легких цепей, объединенных гибким пептидным линкером. Разнообразие антител в таких библиотеках может достигать 10 вариантов в 1 мл (de Haard et al., 1999; Soderlind et al., 2000).
В данной работе были использованы как синтетическая, так и иммунная натуральная библиотеки одноцепочечных антител человека. Такой выбор был обусловлен тем, что из синтетических библиотек можно получить более широкий спектр антител против определенного антигена, а из иммунных библиотек, как правило, отбирают очень узкий репертуар специфических антител, но полученные антитела чаще обладают биологической активностью. Иммунная библиотека одноцепочечных антител была сконструирована в лаборатории рекомбинантных белков ФГУП ГНЦ ВБ «Вектор». Для получения фрагментов кДНК, кодирующих Vh и Vl-фрагменты антител, были использованы мРНК периферических лимфоцитов крови 4 доноров, предварительно иммунизированных вирусом осповакцины. Vh- и Vl-гены были объединены в единые ДНК-последовательности, кодирующие одноцепочечные антитела, весь репертуар которых был встроен в фагмидный вектор pHEN2. Размер данной библиотеки оценивался как ЗхЮ7 независимых клонов. Синтетическая библиотека одноцепочечных антител человека Griffinl была любезно предоставлена Medical Research Center (Кэмбридж, Англия). В конструировании библиотеки использовались гены 50-ти различных вариабельных доменов тяжелых цепей. Также в конструировании библиотеки были использованы гены 6 различных вариабельных. доменов легких цепей, соответствующие шести основным подтипам к- и Х-цепей. Дополнительное разнообразие в библиотеку вносили путем рандомизации CDR3 тяжелой цепи, который, как известно, в наибольшей мере определяет специфичность антител. Гены Vh и VI-фрагментов объединяли с помощью линкерной последовательности и встраивали в плазмидный вектор pHEN2, объединяя с геном поверхностного белка рШ фага М13. Размер этой библиотеки оценивался авторами как 108 различных вариантов фаговых антител (Krebs et al, 1998). В качестве антигенов для аффинного обогащения библиотек использовали вирус осповакцины, штамм ЛИВП, и вирус натуральной оспы, штамм Butler, относящийся к группе штаммов минорной оспы (Variola alastrim).
